周 曙，田 芳，金海蓉，王緒國，李 超，胡晉紅*

（第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433）

姜黃素調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白表達誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡

周 曙，田 芳，金海蓉，王緒國，李 超，胡晉紅*

（第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433）

目的研究姜黃素誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡及其分子機制。方法用10、20、40μmol/L姜黃素 （對照組0μmol/L）處理增生性瘢痕成纖維細胞24 h，MTT法檢測姜黃素對細胞增殖的影響，Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡率，分光光度法檢測Caspase-9、Caspase-3活性，Western Blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達。結(jié)果MTT結(jié)果顯示姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞具有抑制作用，抑制率隨姜黃素濃度增加而上升（P＜0.05）；Annexin V-FITC/PI雙標法結(jié)果顯示成纖維細胞凋亡率隨姜黃素濃度增加而上升（P＜0.05）；經(jīng)姜黃素作用，Caspase-9、Caspase-3的活性隨姜黃素濃度增加而升高（P＜0.05）；Western Blot結(jié)果顯示Bcl-2蛋白表達下降，Bax蛋白表達升高，Bax/Bcl-2比值增大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞有抑制增殖和誘導凋亡的作用，其機制與下調(diào)Bcl-2蛋白表達、上調(diào)Bax蛋白表達，升高Caspase-9、Caspase-3活性有關(guān)。

姜黃素；增生性瘢痕；成纖維細胞；細胞凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-9；Caspase-3

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar）是在創(chuàng)傷、燒傷后皮膚真皮愈合時，局部瘢痕組織過度修復出現(xiàn)的高出皮面、發(fā)紅、發(fā)硬的病理結(jié)構(gòu)。增生性瘢痕的形成機制尚未完全清楚，現(xiàn)認為皮膚成纖維細胞是傷口愈合和瘢痕增生的主要效應(yīng)細胞，其過度增殖、合成細胞外基質(zhì)異常，直接導致增生性瘢痕的形成[1]。臨床上常采用手術(shù)、藥物注射、激光、冷凍、加壓、中醫(yī)辨證施治等方法綜合治療，但至今尚無特效療法、特效藥物。瘢痕患者皮膚形態(tài)畸形和功能障礙，同時面臨心理、社會問題，研究增生性瘢痕的形成機制和防治藥物具有重要的臨床意義[2]。

姜黃素（Curcumin）是姜科姜黃屬（Curcuma L.）植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然植物多酚，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[3]，且毒性低，具有良好的臨床應(yīng)用前景。有研究表明姜黃素能誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡，具有體外抗增生性瘢痕的作用[4]，但是具體的凋亡作用機制尚未明確。本研究以體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞為研究對象，采用不同濃度的姜黃素進行干預，探討姜黃素誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的效應(yīng)及其分子機制，為姜黃素用于臨床治療增生性瘢痕提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

姜黃素、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；MTT試劑盒購自美國Promega公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase-9和Caspase-3活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Bcl-2、Bax、β-actin多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。主要儀器：倒置顯微鏡，日本Olympus公司；細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；酶標儀，美國BTO-Rad公司；流式細胞儀，德國Miltenyi Biofec公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能公司。

1.2 增生性瘢痕成纖維細胞培養(yǎng)

增生性瘢痕組織來源于第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院整形外科增生性瘢痕患者的手術(shù)標本，患者術(shù)前未作任何抗瘢痕治療，無系統(tǒng)疾病，均經(jīng)臨床和病理確診，收集標本前都已取得患者知情同意，實驗經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準。取手術(shù)切除的增生性瘢痕組織，盡量去除表皮和皮下組織，在無菌條件下漂洗、剪碎，參照組織塊貼壁法培養(yǎng)成纖維細胞，置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)。每天觀察細胞貼壁和生長情況，待組織周圍有梭形細胞游出，換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞長滿時，用0.25%胰酶消化，按1∶3進行消化傳代。實驗選用第3～7代細胞。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制

取對數(shù)生長期的成纖維細胞，制成5×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細胞完全貼壁后更換為含姜黃素的培養(yǎng)基。分為不同濃度10、20、40μmol/L姜黃素處理組，0μmol/L為對照組，每組做6個復孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL后在培養(yǎng)箱溫育3.5 h，吸取上清，每孔加入150μL DMSO，取培養(yǎng)板，采用酶標儀在490 nm處檢測光密度OD值，計算各組細胞生長抑制率。成纖維細胞生長抑制率=(1-姜黃素組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡率

收集經(jīng)0、10、20、40μmol/L姜黃素處理24 h后的增生性瘢痕成纖維細胞，PBS洗滌，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入195μL的Binding Buffer重懸細胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI，室溫下避光、反應(yīng)15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Caspase-9、Caspase-3活性檢測

收集經(jīng)0、10、20、40μmol/L姜黃素處理24 h后的增生性瘢痕成纖維細胞，PBS洗滌，加入裂解液，置于4℃下裂解15 min提取總蛋白，測定蛋白濃度并定量。按Caspase-9、Caspase-3活性檢測試劑盒配置100μL反應(yīng)體系，每組做6個復孔，37℃孵育2 h后，用酶標儀在405 nm處檢測光密度OD值，根據(jù)標準曲線計算活性。

1.6 Western Blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達

收集經(jīng)0、10、20、40μmol/L姜黃素處理24 h后的增生性瘢痕成纖維細胞，PBS洗滌，加入裂解液，置于4℃下裂解15 min提取總蛋白，測定蛋白濃度并定量，用質(zhì)量分數(shù)為12%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶500稀釋的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次。應(yīng)用ECL法進行顯影檢測，以Bcl-2、Bax蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的IOD比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對細胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果如表1所示，姜黃素能夠抑制增生性瘢痕成纖維細胞的生長，隨著濃度的提高，姜黃素對成纖維細胞的增殖抑制效果逐漸增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的抑制作用（±s，n=6）

表1姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的抑制作用（±s，n=6）

注：與對照組比較*P＜0.05。下表同。

姜黃素(μmol/L) 0(對照組) 10 20 40 OD 抑制率(%) 1.725±0.081 0 1.053±0.077* 39.0 0.898±0.060* 47.9 0.697±0.053* 59.6

2.2 AnnexinV-FITC/PI雙標檢測細胞凋亡

對照組細胞凋亡率為 (2.90±0.72)%，10、20、40μmol/L姜黃素組細胞凋亡率分別為 (22.53± 1.67)%、(37.83±1.27)%、(46.21±1.95)%。姜黃素不同濃度組組間比較，高濃度組細胞凋亡率高于低濃度組，凋亡率隨著姜黃素濃度的增加而上升（P＜0.05）。結(jié)果如圖1所示。

圖1 AnnexinV-FITC/PI雙標檢測姜黃素誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡率

2.3 Caspase-9、Caspase-3活性檢測

與對照組相比，不同濃度姜黃素可以使增生性瘢痕成纖維細胞Caspase-9、Caspase-3的活性明顯升高，并呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。結(jié)果如圖2、圖3所示。

2.4 姜黃素對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Western Blot結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加，增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)，Bcl-2蛋白表達降低，而Bax蛋白表達增加，Bax/Bcl-2比值明顯升高（見表2），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。如圖4所示。

圖2姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Caspase-9活性的影響

圖3姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Caspase-3活性的影響

圖4 姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的電泳圖

表2 姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Bax/Bcl-2比值的影響 （±s，n=3）

表2 姜黃素對增生性瘢痕成纖維細胞Bax/Bcl-2比值的影響 （±s，n=3）

姜黃素(μmol/L) 0 10 20 40 Bcl-2/β-actin 0.63±0.06 0.58±0.12* 0.53±0.08* 0.50±0.17* Bax/β-actin 2.10±0.19 2.58±0.27* 2.83±0.13* 3.11±0.19* Bax/Bcl-2 3.33 4.45* 5.34* 6.22*

3 討論

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷后過度修復的一種不良結(jié)果，病理學特點是成纖維細胞過度增殖和膠原蛋白、纖聯(lián)蛋白、氨基多聚糖等細胞外基質(zhì)的過度沉積，成纖維細胞是產(chǎn)生膠原的主要細胞，瘢痕中成纖維細胞正常凋亡過程失控是其過度增殖、合成膠原異常的一個重要環(huán)節(jié)[5]。用藥物誘導促使成纖維細胞凋亡，是抗增生性瘢痕治療的一個很有意義的研究領(lǐng)域，從天然藥物活性成分中篩選新的有效藥物，在增生性瘢痕的治療和預防中更是被給予很高期望。

姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種植物多酚，藥理作用廣泛[6-7]，對多種腫瘤細胞有拮抗作用，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌等，其機制之一與誘導腫瘤細胞凋亡有關(guān)。由于細胞凋亡的信號途徑比較復雜，對于不同的腫瘤細胞，姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡的機制也可能不盡相同。在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過激活Bax表達、抑制Bcl-2和Bcl-xL表達而活化Caspase-3信號通路，顯著抑制人結(jié)腸癌LoVo細胞的增殖并促進其凋亡[8]。姜黃素作用于人T細胞淋巴瘤Jurkat細胞，阻滯Jurkat細胞于G0/G1期，激活MAPKs家族中的JNk信號通路誘導Jurkat細胞凋亡[9]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可作為肺、肝纖維化病變的治療藥物，通過調(diào)整肺內(nèi)凋亡相關(guān)因子Bcl-xL、Bax、Caspase-3的改變延緩肺纖維化疾病進展，通過促進活化的肝星狀細胞凋亡而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。增生性瘢痕具有纖維化病變的特點，胡曉龍等[4]報道姜黃素能引起增生性瘢痕成纖維細胞凋亡，本研究結(jié)果與之較為一致，姜黃素在10～40μmol/L濃度范圍內(nèi)誘導成纖維細胞凋亡，凋亡率隨藥物濃度增加而增高。本實驗進一步研究黃素誘導成纖維細胞凋亡的作用機制，為姜黃素對增生性瘢痕的治療提供了很好的理論基礎(chǔ)。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，可引起細胞一系列的形態(tài)及生物學改變，并最終導致細胞死亡。目前認為線粒體通路、死亡受體通路是參與細胞凋亡的兩條主要信號通路，在細胞凋亡的線粒體通路中Bcl-2蛋白家族占有重要地位[8]。Bax、Bcl-2分別是Bcl-2蛋白家族中典型的促凋亡和抑凋亡蛋白，促凋亡蛋白Bax在正常細胞中主要定位于細胞漿，受到凋亡刺激后轉(zhuǎn)位到線粒體上，直接或間接地在線粒體上形成孔道，引起細胞色素C的釋放，細胞色素C活化Caspase-9，激活下游的效應(yīng)Caspase-3，進而啟動細胞凋亡。抑凋亡蛋白Bcl-2則能與Bax形成異源二聚體，抑制細胞色素C的釋放，具有抑制細胞凋亡的功能。正常情況下Bax、Bcl-2的表達量處于相對的穩(wěn)態(tài)，當Bax占優(yōu)勢時細胞發(fā)生凋亡，當Bcl-2占優(yōu)勢時細胞免遭凋亡，Bax/Bcl-2比值改變決定細胞凋亡的發(fā)生，是凋亡調(diào)控的一個重要因素[10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素下調(diào)Bcl-2蛋白表達、上調(diào)Bax蛋白表達，Caspase-9、Caspase-3活性顯著升高，促進了增生性瘢痕成纖維細胞凋亡，這可能是姜黃素治療增生性瘢痕作用的重要機制之一。但是細胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯綜復雜，姜黃素是否還通過其他通路共同發(fā)揮作用有待進一步研究。目前增生性瘢痕尚無理想的治療藥物，現(xiàn)有藥物或因毒性太大、或作用不強，使臨床應(yīng)用受到限制。姜黃素因其毒副作用較小等優(yōu)勢，通過誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡，有望作為治療增生性瘢痕的潛力藥物。

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（本文編輯 楊 瑛）

Curcum in Induced Hypertrophic Scar Fibroblasts Apoptosis by Regulating Bcl-2/Bax Protein Expressions

ZHOU Shu,TIAN Fang,JIN Hairong,WANG Xuguo,LI Chao,HU Jinhong*
（Department of Pharmacy,Changhai Hospital of Second Military Medical University,Shanghai 200433,China）

ObjectiveTo investigate the effects of curcumin on cell apoptosis in hypertrophic scar fibroblasts and the related mechanism.MethodsThe hypertrophic scar fibroblasts were treated with curcumin of 10 μmol/L,20 μmol/L, 40μmol/L for 24 h.The effects of curcumin on proliferation of hypertrophic scar fibroblasts were detected by MTT assay.The apoptosis rate was analyzed by Annexin V-FITC/PI double staining.The activities of Caspase-9 and Caspase-3 were detected with spectrophotometric method.The protein expression of Bcl-2 and Bax was detected with Western blot assessment.ResultsMTT assay showed that curcumin could inhibit hypertrophic scar fibroblasts proliferation and the inhibitory rate increased with the concentration of curcumin(P＜0.05).Annexin V-FITC/PI double staining showed that curcumin could induce apoptosis of fibroblasts and the apoptosis rate which increased with the concentration of curcumin(P＜0.05).The activities of Caspase-9 and Caspase-3 were increased with the concentration of curcumin(P＜0.05).Western Blot assessment showed that curcumin reduced the Bcl-2 protein expression,increased the Bax protein expression and the ratio of Bax/Bcl-2,the differences had the statistical significance(P＜0.05).ConclusionCurcumin could inhibit proliferation and induce apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts.Its mechanism may be associated with increasing the activities of Caspase-3 and Caspase-9 by inhibiting the expression of Bcl-2 protein and promoting the expression of Bax protein.

curcumin;hypertrophic scar;fibroblasts;apoptosis;Bcl-2;Bax;Caspase-9;Caspase-3

R285.5；R619.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.002

2014－11－02

國家自然科學基金資助項目（81173130）。

周 曙，男，在讀碩士研究生，主管藥師，研究方向：臨床藥學。

*胡晉紅，主任藥師，E-mail：hujh2011@163.com。