胡敏鸝 華宏軍 楊小云 陳躍華

浙江省金華市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江金華321300

IBS-D患者直腸乙狀結(jié)腸交界黏膜MC活化及類胰蛋白酶的變化及作用研究

胡敏鸝 華宏軍 楊小云 陳躍華▲

浙江省金華市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江金華321300

目的研究MC的活化及類胰蛋白酶在IBS-D中的發(fā)病機制中所起到的作用。方法選擇滿足RomeⅢ診斷標準的IBS-D患者20例，健康的志愿者10例。應(yīng)用免疫組化方法對腸黏膜MC染色，計算每高倍視野下MC的數(shù)量及活化MC占MC總數(shù)的比例，并與IBS-D患者GSRS進行相關(guān)性分析。結(jié)果IBS-D患者MC數(shù)量與正常對照組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；且其活化MC比率顯著高于正常對照組（P＜0．01）。IBS－D患者活化MC胞質(zhì)增多，胞質(zhì)染色呈深褐色，并可見脫顆?，F(xiàn)象。MC細胞活化分數(shù)與GSRS呈正相關(guān)（r＝0．626，P＝0．003）。結(jié)論IBS-D患者MC數(shù)量明顯增加及活化，與其發(fā)病機制密切相關(guān)，類胰蛋白酶在IBS-D中可能起著關(guān)鍵作用。

腹瀉型腸易激綜合征；肥大細胞；類胰蛋白酶；內(nèi)臟敏感性；免疫組化

腸易激綜合征（IBS）屬于一種常見的功能紊亂疾病，其發(fā)病的主要特點是腹部出現(xiàn)疼痛不適以及排便不規(guī)律等，腸道缺乏可以支持癥狀的器質(zhì)性改變和生化學(xué)異常[1]。IBS是一種全球性疾病，人群患病率因民族、社會文化及生活習(xí)慣、地域、診斷標準選擇等的不同而存在差異。歐美國家的總患病率約在10%～15%之間[2]，國內(nèi)兩項流行病學(xué)調(diào)查顯示北京市和廣東省的IBS患病率分別為7.26%和11.5%[3，4]。作為臨床上常見的慢性功能性腸病，IBS的病因與發(fā)病機制是當(dāng)前研究的熱點，但由于比較復(fù)雜，尚不十分清楚，可能與腦-腸軸功能異常、胃腸動力改變、腸道感染、內(nèi)臟敏感增高、精神心理因素、神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂等有關(guān)。近年來的多項研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞活化所分泌的的炎癥介質(zhì)類胰蛋白酶在IBS腸道痛覺閾值下降、敏感性增高形成中可能起到關(guān)鍵性的作用。類胰蛋白酶是人們對肥大細胞進行過組織酶染色時發(fā)現(xiàn)，具有多種生物活性。按分子結(jié)構(gòu)類胰蛋白酶可分α和β2種類型，幾乎特異性地由組織肥大細胞分泌，通過激活蛋白酶活化受體－2（PAR－2）起作用[5，6]。β－類胰蛋白酶屬于中性絲氨酸蛋白酶中的一種，分子量為134 000 Da，結(jié)構(gòu)是由4個相同的亞單位和肝素糖蛋白組成的四聚體，主要存在于肥大細胞胞質(zhì)的小顆粒內(nèi)，占整個肥大細胞總蛋白的25%，是肥大細胞內(nèi)含最豐富的一種分泌性介質(zhì)[7]。當(dāng)特異性抗原進入機體后，誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生特異性IgE抗體，并且與抗體結(jié)合之后又繼續(xù)和肥大細胞表面存在的FcεRI受體相互結(jié)合，這樣肥大細胞就會被激活，然后通過脫顆粒的方法把類胰蛋白酶分泌出來，類胰蛋白酶通過激活含有神經(jīng)肽類物質(zhì)神經(jīng)表面的PAR-2，使鄰近的腸傷害感受神經(jīng)元興奮，傳遞傷害信息，導(dǎo)致內(nèi)臟感覺的變化。本實驗通過對人直腸乙狀結(jié)腸交界黏膜肥大細胞作類胰蛋白酶免疫組化染色分析，并計數(shù)肥大細胞數(shù)量及活化肥大細胞百分率，探討肥大細胞數(shù)量及活化、類胰蛋白酶的變化對腸易激綜合征的影響，從而為探討腸易激綜合征發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇浙江省金華市中心醫(yī)院2014年5～12月在消化內(nèi)科門診及住院部腸易激綜合征患者20例，診斷標準符合RomeⅢ診斷標準，其中男8例，女12例，年齡23～64歲，平均41.2歲。另選擇10例為結(jié)腸息肉摘除術(shù)后復(fù)查的患者、痔瘡患者或健康體檢者，結(jié)腸鏡和病理檢查未均發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜有病理性改變且無IBS臨床癥狀者作為正常對照組。男4例，女6例；年齡27～57歲，平均37.3歲。

1.2 標本來源

上述的所有研究對象都在結(jié)腸鏡的檢查中發(fā)現(xiàn)，在肛門15 cm的直腸和乙狀結(jié)腸的相交處取少量的黏膜組織，立即用10%甲醛固定，然后制成石蠟切片，然后用石蠟包裹標本以及連續(xù)切片2張，其中1張使用HE染色處理，1張用于肥大細胞類胰蛋白酶免疫組化研究。

1.3 試劑及主要儀器

鼠抗人類胰蛋白酶單克隆抗體（Santa Cruz生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色劑試劑盒（北京中杉金橋公司）；免疫染色一抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)研究所）；PBS磷酸鹽緩沖液（粉劑）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；檸檬酸抗原修復(fù)液（粉劑）（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；抗鼠/兔二步法免疫組化檢測試劑（上海中杉橋生物有限公司）；HE染色試劑盒（北京生物工程有限公司）；超凈工作臺（蘇州SW-CJ-IFD型）；顯微鏡、倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；高壓鍋（中國順發(fā)公司）；電熱恒溫干燥箱GZX-GF-101型（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.4 方法

1.4.1 常規(guī)HE染色取材組織經(jīng)固定后，石蠟包埋，4 μm切片，切片放入60℃烤箱烘烤30 min；切片經(jīng)用二甲苯脫蠟，各級梯度乙醇水化：二甲苯（Ⅰ）10 min→二甲苯（Ⅱ）10 min→100%乙醇5 min→95%的乙醇5 min→85%乙醇5 min→75%乙醇5 min→蒸餾水洗4 min（充分水洗，然后把水吸干）；蘇木素液染色10 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化30 s（提插數(shù)下，自來水洗）；碳酸鋰5 s，充分水洗；置75%伊紅乙醇液5 min；常規(guī)脫水，透明，封片：85%乙醇5 min→95%乙醇（Ⅰ）5 min→95%乙醇（Ⅱ）5 min→100%乙醇（I）5 min→100%乙醇（Ⅱ）5 min→二甲苯（I）5 min→二甲苯（Ⅱ）5 min→中性樹脂封固。

1.4.2 免疫組織化學(xué)檢測肥大細胞類胰蛋白酶腸石蠟標本常規(guī)4 μm切片，免疫組化采用非生物素即用型二步法（PV-9000）檢測類胰蛋白酶的表達。設(shè)立陽性對照（陽性表達的切片由試劑公司提供），以PBS代替一抗作為陰性對照。按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定：在肥大細胞中，類胰蛋白酶主要在胞質(zhì)中的顆粒內(nèi)表達，并且胞漿會被染成棕黃色的就是陽性。對于陰性對照組來說，除了細胞核被染成了藍色之外，胞漿內(nèi)沒有棕黃色顆粒。在光鏡下進行拍照，隨機抽選10個400倍的視野進行觀察，計數(shù)MC總數(shù)和活化MC數(shù)，MC計數(shù)以平均每高倍視野的MC個數(shù)表示，活化MC比率則以活化MC數(shù)占總MC數(shù)的比值表示，采取的是Image Pro Plus 6.0軟件，用來對平均光密度進行測量，最后進行統(tǒng)計意義分析研究。

1.5 IBS－D胃腸道癥狀評分（GSRS）

在IBS-D患者就診時進行，主要選擇的是GSRS標準。詳細的評分細則包括：腹部疼痛感不適的程度；排便的異常次數(shù)以及頻率；是否有急便、排便困難等等問題；出現(xiàn)黏液便的頻度。具體的程度評分：0=無；1=表示有一點癥狀，屬于輕度；2=表示有癥狀但是不影響正常生活，屬于中度；3=表示存在影響正?；顒拥陌Y狀，屬于重度。頻率評分：0=無；1=偶爾（1%～24%時間內(nèi)出現(xiàn)）；2＝經(jīng)常（25%～50%時間內(nèi)出現(xiàn)）；3＝持續(xù)（＞50%時間內(nèi)出現(xiàn)）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件。肥大細胞數(shù)、活化肥大細胞百分率、消化道癥狀評分值等計量資料采用（x±s）描述，數(shù)據(jù)資料分析采用獨立樣本t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析（LSD法），肥大細胞活化率與胃腸道癥狀評分（GSRS）相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)檢驗。假如α=0.05，以P<0.05示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果分析及MC計數(shù)

結(jié)果顯示，MC主要分布于黏膜固有層和黏膜下層，細胞呈卵圓形、梭形或不規(guī)則形狀。在高倍鏡下(×400，圖1）MC通過免疫化的類胰蛋白酶染色之后，胞質(zhì)呈現(xiàn)為深褐色，細胞核為藍色，那些沒有經(jīng)過脫顆粒的細胞屬于完整的，而且胞質(zhì)均勻、清晰，那些脫顆粒的細胞出現(xiàn)了破裂，會有少量的顆粒漏出，積聚在周圍，而且細胞的形態(tài)是不規(guī)則的；采用IPP 6.0圖像軟件測定MC類胰蛋白酶平均光密度。IBS-D患者升結(jié)腸黏膜的MC數(shù)量（8．423±1．372個/高倍視野）要遠遠大于健康對照組（5．172±0．821個/高倍視野），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；IBS-D組的MC脫顆粒率（67.000± 0.231）%也高于對照組（22.000±0.152）%，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；IPP 6.0圖像軟件測平均光密度，IBS-D組類胰蛋白酶表達與正常對照組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。見表1。

圖1 兩組HE染色及免疫組化染色

表1 兩組結(jié)腸黏膜MC數(shù)量及活化率的比較（±s）

表1 兩組結(jié)腸黏膜MC數(shù)量及活化率的比較（±s）

注：vs對照組，*P<0.05，**P<0.01

組別n肥大細胞數(shù)（個/ H P）活化M C數(shù)百分率（%）平均光密度（O D / μ m2）正常對照組I B S -D組t值1 0 2 0 5 . 1 7 2 ± 0 . 8 2 1 8 . 4 2 3 ± 1 . 3 7 2*2 . 0 2 4 2 2 . 0 0 0 ± 0 . 1 5 2 6 7 . 0 0 0 ± 0 . 2 3 1**9 . 7 5 0 0 . 1 9 6 ± 0 . 0 1 3 0 . 3 7 6 ± 0 . 0 3 5**6 . 0 3 0

2.2 MC數(shù)量及活化百分率、類胰蛋白酶表達與胃腸道癥狀相關(guān)性分析

IBS-D患者的胃腸道癥狀評分為6～11分，平均（7．10±1．43）分。關(guān)于肥大細胞以及腹部癥狀之間是否存在相關(guān)性的問題，主要是通過Spearman等級相關(guān)分析顯示肥大細胞活化百分率與腹部的癥狀的總體分數(shù)、腹部疼痛不適的程度呈正比例關(guān)系，但是和其他的癥狀沒有任何關(guān)系；類胰蛋白酶的表達和腹部的癥狀總分數(shù)、腹部疼痛不適的程度還有排便的異常呈正比例關(guān)系，但是和其他的癥狀沒有關(guān)系。見表2。

3 討論

IBS的發(fā)病機制尚不明確，患者多表現(xiàn)為發(fā)作—緩解交替，過去觀點認為僅是患者胃腸動力發(fā)生紊亂所致。隨著對IBS深入研究發(fā)現(xiàn)，IBS臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，已難以用單一生物模式來簡單解釋?，F(xiàn)有研究認為本病與腸道運動異常、內(nèi)臟感覺過敏、腸道感染及菌群失調(diào)、腦腸作用、免疫異常、食物不耐受、慢性應(yīng)激、遺傳環(huán)境等因素有關(guān)[8]。近年來，許多研究顯示神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控異常在IBS的發(fā)病中扮演著關(guān)鍵性的角色[9]，但其中病理生理機制尚未能弄清。之前已有較多研究報到IBS患者結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)量增多、脫顆粒增加，肥大細胞可釋放多種生物活性介質(zhì)，可能與腸運動功能紊亂和內(nèi)臟感覺異常改變密切相關(guān)。本實驗通過對指定部位腸黏膜肥大細胞免疫組化染色，計數(shù)其數(shù)量及活化率、類胰蛋白表達與IBS腹部癥狀的相關(guān)性，來進一步探討肥大細胞數(shù)量增多及活化在腸易激綜合征癥狀發(fā)生中的作用。

表2 MC活化百分率與腹部癥狀評分相關(guān)分析

肥大細胞（MC）在胃腸道分布廣泛，是腸道免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)細胞[10]，構(gòu)成機體抗感染免疫的第一線防線，通過釋放多種潛在生物活性介質(zhì)刺激炎癥細胞，產(chǎn)生級聯(lián)瀑布效應(yīng)，參與多種消化疾病的生理病理過程。Demir等[11]報道IBS患者結(jié)腸和末端回腸黏膜肥大細胞數(shù)量明顯高于正常人，在腹瀉型IBS患者中，這種差異更為明顯，這后多項研究表明MC與IBS之間聯(lián)系緊密，逐漸成為人們研究的熱點。另有大量實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC與傳導(dǎo)內(nèi)臟疼痛的神經(jīng)纖維接觸密切，表明二者之間存在直接雙向的交流：一方面，與MC接觸的神經(jīng)纖維可釋放多種神經(jīng)肽，與MC表面的相應(yīng)受體結(jié)合，導(dǎo)致MC活化并釋放介質(zhì)，影響腸動力及痛覺閾值；另一方面，MC通過其合成分泌的神經(jīng)遞質(zhì)作用于神經(jīng)細胞上相應(yīng)受體，將有害信息傳至神經(jīng)中樞，導(dǎo)致中樞敏感性增高，參與IBS的發(fā)生發(fā)展[12]。MC在免疫途徑和非免疫途徑介導(dǎo)下活化，是神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)細胞，調(diào)節(jié)腸道生理功能，IBS的發(fā)病可能與這個網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控紊亂有關(guān)。MC既具有免疫活性，又同時受多種神經(jīng)肽調(diào)節(jié)，分泌多種活性介質(zhì)，參與腸黏膜的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。當(dāng)各種因素如腸道感染、食物過敏、精神心理緊張等觸發(fā)機體免疫系統(tǒng)，激活MC，使其脫顆粒并釋放類胰蛋白酶、組胺、前列腺素、5-HT、血小板活化因子、白三烯等多種生物活性介質(zhì)，其中類胰蛋白酶含量最豐富，是MC中的一種重要的生物活性介質(zhì)，主要存在于MC胞質(zhì)內(nèi)，是MC激活和脫顆粒的重要標志。因其具有高度的選擇性及敏感性，成為鑒別肥大細胞的重要標志。對肥大細胞類胰蛋白酶進行免疫組化特異性染色，與以往采取的甲苯胺藍方法相比，結(jié)果更清晰、可靠，更適合對MC細胞的觀察。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IBS患者的結(jié)腸組織中存在大量肥大細胞浸潤，肥大細胞數(shù)目明顯增多、活化，腸黏膜中類胰蛋白酶、組胺、5-HT等肥大細胞的產(chǎn)物的含量明顯增高。國外研究發(fā)現(xiàn)MC穩(wěn)定劑（如色甘酸二鈉、酮替芬）對MC有拮抗作用，可調(diào)整內(nèi)臟感覺及腸運動功能，使IBS癥狀得到改善[13]。有研究發(fā)現(xiàn)MC浸潤和介質(zhì)釋放與IBS患者腹痛感覺等癥狀有關(guān)。類胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白水解酶，可以用來激活蛋白酶的活化受體-2，即PAR-2，用來刺激感覺神經(jīng)元引起相應(yīng)反應(yīng)。有試驗證實結(jié)腸內(nèi)廣泛存在PAR-2陽性的神經(jīng)元，類胰蛋白酶通過識別水解PAR-2胞外區(qū)的N-端，暴露其配體激活序列進而激活PAR-2。激活PAR-2后由活化磷脂酶C，使用G蛋白進行引導(dǎo)，通過絕大部分的信號產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。腸道內(nèi)PAR-2陽性神經(jīng)元興奮性增高，釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)(SP)和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP），傳遞痛覺信息，持續(xù)刺激中樞系統(tǒng)使其對各種刺激引起的痛覺過敏，感受疼痛閾值降低，敏感性增高[14]。而有研究表明腸道黏膜存在持續(xù)低度炎癥反應(yīng)，此反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程也有PAR-2參與，此反應(yīng)的特征為粒細胞浸潤及黏膜下水腫，被認為是IBS發(fā)生發(fā)展中的重要因素之一。

IBS患者結(jié)腸黏膜MC數(shù)量增多、浸潤、活化及其脫顆粒，類胰蛋白酶的釋放被認為是腸易激綜合征發(fā)生的真正原因，MC的數(shù)目增加還有活化都會和IBS的癥狀呈正比例關(guān)系，過程主要是通過釋放類胰蛋白酶，刺激活化受體-2完成。PAR-2的激活容易造成感受神經(jīng)元的過度興奮，產(chǎn)生傷害性的神經(jīng)遞質(zhì)，引起內(nèi)臟中的滲透壓發(fā)生變化，然后增加敏感性；另一個角度，活化受體-2的激活使結(jié)腸黏膜上皮細胞間隙增寬、有害物質(zhì)進入，結(jié)腸的低度炎癥容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這樣就會使MC更加快速的表達活化、類胰蛋白酶的合成釋放，最終引起腸易激綜合癥的發(fā)生。IBS的病因和發(fā)病機制比較復(fù)雜，是由多因素相互作用的結(jié)果，尚未能完全闡明，而對MC及其分泌的類胰蛋白酶等相關(guān)介質(zhì)在IBS病理生理過程調(diào)控機制的深入研究，這樣就可以讓人們更好的去認識發(fā)病機制，對于MC以及類胰蛋白酶的選擇性干預(yù)得以實現(xiàn)，還可能會找到治療IBS的新的方法，所以具有非常吸引人的前景。本實驗通過對直腸乙狀結(jié)腸交界黏膜MC的數(shù)量及其活化程度的測定，類胰蛋白酶表達程度的分析，研究分析腸粘膜MC以及類胰蛋白酶在腹瀉型腸易激綜合征中發(fā)病機制中的作用。實驗結(jié)果中MC數(shù)量明顯增多及活化，類胰蛋白酶量合成增多及釋放。機體類胰蛋白酶幾乎全部來源于MC的合成與分泌，IBS-D組MC數(shù)目明顯多于正常對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，但與腹部癥狀評分無明顯相關(guān)。腹部癥狀評分主要與MC是否致敏及活化、類胰蛋白酶表達程度有關(guān)，MC活化率及類胰蛋白酶表達程度與腸易激綜合征胃腸道癥狀相關(guān)性說明MC活化及類胰蛋白酶與腸易激綜合征發(fā)病機制密切相關(guān)，而闡明MC被激活，類胰蛋白酶釋放的調(diào)控機制將為腸易激綜合征的治療開辟新的途徑，具有較高的臨床價值[15]。

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Study on MC activation and tryptase change in rectosigmoid adjacent mucosa of IBS-D patients and their role

HU MinliHUA HongjunYANG XiaoyunCHEN Yuehua
Department of Gastroenterology,Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province,Jinhua321300,China

Objective To study the role of MC activation and tryptase in the pathogenesis of IBS-D patients.Methods Twenty IBS-D patients meeting the RomeIII diagnostic criteria and 10 healthy volunteers were selected.The immunohistochemical method was used for intestinal mucosa MC staining.The MC count and the proportion of activated MC out of the total MC count under each high power field were calculated and used for correlation analysis with the GSRS of IBS-D patients.Results The MC count of IBS-D patients had statistically significant difference to that of the normal control group(P<0.05),and the ratio of activated MC of the IBS-D patients was significantly higher than that of the normal control group(P<0.01).The cytoplasm of activated MC in the IBS-D patients increased and displayed a dark brown color,and degranulation was observed.The activated proportion of MC cells was in a positive correlation to the GSRS (r=0.626,P=0.003).Conclusion The MC count increases and activates obviously in the patients with IBS-D,which are closely related to the pathogenesis,and tryptase may play a key role in IBS-D.

Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome;Mast cells;Tryptase;Visceral sensitivity;Immunohistochemistry

R361.3

A

1673-9701（2015）24-0001-04

2015-04-01）

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2014ZB126）

▲通訊作者