胡常巨，熊金波，陳和平,，王 凱，葉 然，崔永平，朱建林，張德民,*

1寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211 2寧波大學(xué)建筑工程與環(huán)境學(xué)院，寧波 315211 3寧波海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，寧波 315012

象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌群落分布

胡常巨1，熊金波1，陳和平1,2，王 凱1，葉 然3，崔永平3，朱建林2，張德民1,*

1寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211 2寧波大學(xué)建筑工程與環(huán)境學(xué)院，寧波 315211 3寧波海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，寧波 315012

近海集約化養(yǎng)殖是導(dǎo)致我國(guó)近海污染的主要來(lái)源之一。浮游細(xì)菌在近海生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究海洋浮游細(xì)菌群落對(duì)養(yǎng)殖活動(dòng)的響應(yīng)，對(duì)于指示和評(píng)價(jià)海水養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)健康具有重要意義。采集了象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)3個(gè)深度，包括表層(0.5m)、中層(2.5m)、底層(8.0m)的水樣，利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)定16S rRNA 基因，研究浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。結(jié)果表明：網(wǎng)箱養(yǎng)殖活動(dòng)不僅使得附近區(qū)域水體理化性質(zhì)發(fā)生改變，如化學(xué)需氧量濃度顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)域，而且顯著地(P<0.05)改變了浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，但不同深度間群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異不顯著。網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)中主要浮游細(xì)菌類(lèi)群為α-變形菌(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)、ε-變形菌(Epsilonproteobacteria)和其它變形菌(Unclassified Proteobacteria)，占細(xì)菌總序列數(shù)的98.64%。有些細(xì)菌類(lèi)群的平均相對(duì)豐度從網(wǎng)箱區(qū)到非養(yǎng)殖區(qū)差異顯著，如擬桿菌(P<0.01)和放線菌(P<0.05)顯著降低，而γ-變形菌(P<0.05)顯著增加。相似度分析表明γ-變形菌、α-變形菌和擬桿菌是造成網(wǎng)箱區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)群落差異的主要類(lèi)群，對(duì)群落差異總貢獻(xiàn)率達(dá)到45.02%。偏冗余分析表明，影響細(xì)菌群落分布的主要環(huán)境因子有化學(xué)需氧量、磷酸鹽、銨鹽和總有機(jī)碳，共解釋38.18%的群落變異，空間距離單獨(dú)解釋10.66%的群落變異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，養(yǎng)殖活動(dòng)導(dǎo)致浮游細(xì)菌群落的改變, 其中擬桿菌、放線菌和γ-變形菌的豐度顯著變化，可能用于評(píng)價(jià)養(yǎng)殖水體的水質(zhì)狀況。

浮游細(xì)菌；群落組成；網(wǎng)箱養(yǎng)殖；環(huán)境因子

海產(chǎn)品需求急劇增長(zhǎng)和海洋捕撈量逐年下降，刺激了近海集約化養(yǎng)殖技術(shù)的迅速發(fā)展，其中網(wǎng)箱養(yǎng)殖占據(jù)了重要的地位[1]。近年來(lái)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，常伴隨過(guò)量的飼料投放和抗生素使用，給近海生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重危害[2-3]。同時(shí)，因網(wǎng)箱數(shù)量和養(yǎng)殖密度的增加致使養(yǎng)殖病害爆發(fā)頻繁[4]，成為養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。

在養(yǎng)殖環(huán)境中，浮游細(xì)菌既是各種有機(jī)物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者，又是物質(zhì)和能量的貯存者，在物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中具有無(wú)可替代的作用[5-6]。同時(shí)，有些細(xì)菌還是近海養(yǎng)殖的致病菌，如弧菌是最常見(jiàn)的條件致病菌之一。在養(yǎng)殖環(huán)境條件惡化時(shí)，弧菌大量增殖，可導(dǎo)致養(yǎng)殖生物感染發(fā)病[7-8]。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，浮游細(xì)菌的群落組成與對(duì)蝦養(yǎng)殖塘的健康狀況密切相關(guān)[9]，且細(xì)菌群落的變化趨勢(shì)是可以預(yù)測(cè)的[10]。目前有大量研究表明微生物是以群落的形式整體承擔(dān)重要的生態(tài)功能，群落響應(yīng)可以綜合全面地反映環(huán)境擾動(dòng)[9]，如微生物群落結(jié)構(gòu)能對(duì)水溫、pH值、溶解氧、氨氮、磷酸鹽、總有機(jī)碳、化學(xué)需氧量和深度等因素的變化產(chǎn)生快速響應(yīng)[11-15]。因此，在近海養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中，水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性有可能作為評(píng)價(jià)海水養(yǎng)殖生態(tài)系健康和穩(wěn)定的重要指標(biāo)[16-17]。

象山港是浙江省重要的養(yǎng)殖基地[18]。然而，以往對(duì)象山港生態(tài)環(huán)境的報(bào)道多以潮間帶生物、浮游動(dòng)植物和底棲動(dòng)物為主，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的研究也主要集中在底泥細(xì)菌群落以及水體中浮游細(xì)菌的數(shù)量方面[3,18-21]，有關(guān)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面的研究也較少。本研究通過(guò)16S rRNA基因焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖和非養(yǎng)殖區(qū)的浮游細(xì)菌群落，比較不同水深度下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，獲得驅(qū)動(dòng)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的環(huán)境因子，初步揭示了浮游細(xì)菌群落對(duì)養(yǎng)殖擾動(dòng)的響應(yīng)規(guī)律。結(jié)合不同細(xì)菌類(lèi)群的功能，通過(guò)群落組成變化推測(cè)生態(tài)功能變化，可為網(wǎng)箱養(yǎng)殖生態(tài)健康提供評(píng)價(jià)和維護(hù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和水樣采集

象山港位于浙江省寧波市的東部，為東北-西南向的狹長(zhǎng)形半封閉海灣。為研究養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)浮游細(xì)菌群落的影響，2012年4月10日，選取位于象山港中西滬港內(nèi)網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)(121°45′9.935″ E，29°32′20.472″ N)和非養(yǎng)殖區(qū)(121°46′10.056″ E，29°36′4.356″ N)兩個(gè)站位，其具體時(shí)間為15:40和16:10，潮位均為低平一落，兩位點(diǎn)相距7km。養(yǎng)殖區(qū)面積約1.1km2，擁有海水網(wǎng)箱2000余只，網(wǎng)箱規(guī)格為3m × 3m × 6m，主要養(yǎng)殖種類(lèi)為大黃魚(yú)和鱸魚(yú)，平均放養(yǎng)密度為3000尾/網(wǎng)箱，養(yǎng)殖周期為2—3a。每個(gè)區(qū)域分別采集表(水深0.5m)、中(水深2.5m)、底(水深8m)3個(gè)深度的水樣3L。

每個(gè)點(diǎn)位設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。采集的水樣置于預(yù)先滅菌容器中存于冰盒，4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析。1L水樣用于提取細(xì)菌總DNA，剩余水樣用于水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 DNA提取

分別取各樣品1L水樣，用經(jīng)滅菌處理的100μm孔徑的尼龍布預(yù)過(guò)濾，后用0.2μm孔徑的聚碳酸酯膜(Millipore)過(guò)濾。濾膜在無(wú)菌剪刀剪碎后用Power Soil?DNA試劑盒(Mobio)提取收集物的總DNA。用NanoDrop ND-1000型分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。抽提后的DNA于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增和454測(cè)序

PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V1-V3可變區(qū)(27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和519R：GWATTACCGCGGCKGCTG)，其中正向引物上帶有10個(gè)堿基的barcode序列，用于區(qū)分不同樣品，DNA模板用量為50ng，在50μL反應(yīng)體系擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)PCR重復(fù)，以降低擴(kuò)增造成的偏差。PCR反應(yīng)條件如下：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將每個(gè)樣品的重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)物混合后純化(TaKaRa Biotech，Japan)。最后所有樣品的PCR產(chǎn)物等摩爾量混合，在羅氏FLX 454儀器上測(cè)序(Roche Diagnostics，Branford，CT，USA)。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

利用Qiime(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，http://qiime.org)流程對(duì)下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行樣品分裝、去嵌合體和質(zhì)量篩選；利用Uclust將相似性大于97%的序列歸為同一個(gè)分類(lèi)操作單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)[22]。選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為代表序列[23]，通過(guò) Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比獲得OTUs的分類(lèi)地位信息[24]。為避免測(cè)序深度不同造成的偏差，每個(gè)樣品隨機(jī)選取5700條序列(樣品中最低測(cè)度深度)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用R軟件(v.2.11.0)中vegan軟件包計(jì)算養(yǎng)殖水環(huán)境中浮游細(xì)菌群落的多樣性，包括多樣性指數(shù)(Shannon Wiener)和均勻度指數(shù)(Pilou′s Evenness)。應(yīng)用冗余分析方法(Redundancy analysis，RDA)分析細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系[25]，同時(shí)采用偏冗余分析(Partial redundancy analysis，pRDA)，計(jì)算出水體理化因子和空間距離對(duì)群落變異的相對(duì)貢獻(xiàn)。

用Past(v.2.03)軟件中非參數(shù)多維度法(Non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析浮游細(xì)菌的群落組成，將各樣品浮游細(xì)菌群落組成在二維圖上可視化。NMDS中，一般采用壓力系數(shù)(Stress)評(píng)定所得到的多維構(gòu)型與實(shí)際數(shù)據(jù)之間的適合度，壓力系數(shù)越小，表示適合度越高[25]。根據(jù)Kruskal提出的判斷標(biāo)準(zhǔn)，壓力系數(shù)<0.2，適合度較好，聚類(lèi)分析可靠[26]。應(yīng)用群落相似性檢驗(yàn)分析養(yǎng)殖和水深對(duì)浮游細(xì)菌群落分布的影響。利用SIMPER(Similarity percentage)分析找出對(duì)群落差異貢獻(xiàn)度高的OTUs。

2 結(jié)果

2.1 水體理化性質(zhì)

主要結(jié)果表明：在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)中，水溫、磷酸鹽、總磷、亞硝酸鹽和銨鹽的均值較高，化學(xué)需氧量顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)(t檢驗(yàn)，P=0.004)；與網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)相比，非養(yǎng)殖區(qū)中葉綠素a和總有機(jī)碳較高(表1)。在不同水體中，化學(xué)需氧量均隨水深逐漸遞減，而總有機(jī)碳隨水深逐漸增加，其它環(huán)境因子在水深層次上分布規(guī)律不明顯(表1)。

表1 網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)各采樣點(diǎn)水體主要理化參數(shù)Table 1 The main physical and chemical properties of the water samples in cage culture and non-cultured areas

COD：Chemical oxygen demand；TP：Total phosphorus；TN：Total nitrogen；TOC：Total organic carbon；Chl a：Chlorophyll a；Y：養(yǎng)殖區(qū)Cage culture area；N：非養(yǎng)殖區(qū)Non-cultured area；S：表層Surface;M：中層Middle；B：底層Bottom

圖1 各樣品的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(綱)平均相對(duì)豐度圖 Fig.1 Relative abundances of the dominant phyla or classes in water samplesY：cage culture area，養(yǎng)殖區(qū)；N：non-cultured area，非養(yǎng)殖區(qū)；S：surface，表層；M：middle，中層；B：bottom，底層

2.2 浮游細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)分析

象山港水體主要浮游細(xì)菌類(lèi)群為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、其它變形菌門(mén)(Unclassified Proteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)，平均相對(duì)豐度分別為47.48%、39.45%、7.76%、1.32%、1.13%、0.87%和0.63%，占細(xì)菌總數(shù)的98.64%(圖1)。在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)，擬桿菌門(mén)(P=0.006)和放線菌門(mén)(P=0.015)顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)，而γ-變形菌綱(P=0.038)顯著低于非養(yǎng)殖區(qū)。在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)，α-變形菌平均相對(duì)豐度隨水深逐漸降低，而γ-變形菌綱逐漸增加；在非養(yǎng)殖區(qū)，擬桿菌平均相對(duì)豐度隨水深逐漸降低(圖1)?？傮w而言，浮游細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(t檢驗(yàn)，P=0.790)和均勻度指數(shù)(t檢驗(yàn)，P=0.587)在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)中的均值高于非養(yǎng)殖區(qū)，但無(wú)顯著差異。網(wǎng)箱區(qū)中層水樣浮游細(xì)菌的多樣性指數(shù)最高，表層水最低，分別為4.808，4.104；均勻度指數(shù)也是中層水最高(0.735)，表層水最低(0.652)(表2)。在非養(yǎng)殖區(qū)，則是表層水多樣性最高，底層水多樣性最低，但是這些差別均不顯著(表2)。

表2 網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)群落多樣性分析Table 2 Analysis of bacterial alpha diversity of water samples collected from cage culture and non-cultured areas

同列中不同字母代表的值表示有顯著差異

圖2 浮游細(xì)菌群落組成的非度量尺度分析NMDS二維圖(箭頭表示從表層到底層的變化方向)Fig.2 Two-dimensional NMDS of bacteriolplankton community compositions (The arrows representing changes from surface to bottom)NMDS: 非參數(shù)多維度法Non-metric multidimensional scaling

2.3 浮游細(xì)菌群落組成空間分布分析

利用NMDS分析浮游細(xì)菌群落組成，壓力系數(shù)為0.16，說(shuō)明可以較好地反映各采樣點(diǎn)間浮游細(xì)菌群落的相似性(圖2)。各樣品在圖中的相對(duì)距離可以反映所對(duì)應(yīng)的浮游細(xì)菌群落組成的相似程度[15]，可將所有樣品大致分為3類(lèi)，網(wǎng)箱區(qū)樣品為一類(lèi)，非養(yǎng)殖區(qū)中層和底層樣品成一類(lèi)，非養(yǎng)殖區(qū)表層樣品聚為一類(lèi)(圖2)。此外，沿著第一排序軸網(wǎng)箱區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌群落分布規(guī)律均由表層向底層，具有相似的演替軌跡(圖2)。

群落相似性檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)網(wǎng)箱區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌群落分布差異顯著(P=0.023)；不同水深層次的細(xì)菌群落差異不顯著(P=0.070)，表明水深對(duì)浮游細(xì)菌群落分布影響較小。SIMPER分析表明網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌群落差異度為62.41。對(duì)群落差異度貢獻(xiàn)率較大的11個(gè)OTUs(貢獻(xiàn)率>1%)，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到45.02%，其中海單胞菌屬(Marinomonas)(2個(gè)OTUs)、褐桿菌屬(Phaeobacter)(1個(gè)OTU)、紅桿菌科(Rhodobacteraceae)(3個(gè)OTUs)、交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)(1個(gè)OTU)、Sediminicolasp.(1個(gè)OTU)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)(1個(gè)OTU)、冰居菌屬(Glaciecola)(1個(gè)OTU)和弧菌科(Vibrionaceae)(1個(gè)OTU)(表3)。對(duì)造成群落差異的主要OTUs在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行豐度比較，發(fā)現(xiàn)黃桿菌科(Flavobacteriaceae)(t檢驗(yàn)，P=0.012)和褐桿菌屬(t檢驗(yàn)，P=0.041)的平均相對(duì)豐度在網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)，而交替假單胞菌屬和弧菌科的平均相對(duì)豐度在非養(yǎng)殖區(qū)中較高。

表3 網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)群落SIMPER分析Table 3 Taxonomic identities of the 11OTUs serving as indicator taxa between cage culture and non-cultured areas by SIMPER analysis

SIMPER: Similarity percentage;OTUs: Operational Taxonomic Units

2.4 浮游細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

圖3 網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)不同水深層次水樣浮游細(xì)菌群落與其變異驅(qū)動(dòng)的主要環(huán)境因子RDA雙向排序圖Fig.3 RDA ordination biplot showed factors that driving the variation of bacterial communities between cage culture area and non-cuntured areaCOD: Chemical oxygen demand;TOC: Total organic carbon;RDA: Redundancy analysis

3 討論與結(jié)論

關(guān)于養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)水體浮游細(xì)菌的影響，在群落水平上的研究還較少[3]，其研究手段主要是依賴(lài)培養(yǎng)技術(shù)和基于16S rRNA基因的DGGE等分子指紋技術(shù)和克隆文庫(kù)測(cè)序方法[3,29]。這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，分析通量非常有限，而細(xì)菌多樣性又異常豐富，因此揭示的信息非常有限，忽略了一些具有重大功能的低豐度物種的存在[30-31]。新近出現(xiàn)的焦磷酸測(cè)序技術(shù)則將細(xì)菌的鑒定分析通量提高百萬(wàn)倍，很好得解決了通量瓶頸，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息揭示的更加全面、詳細(xì)[32-33]。本研究利用16S rRNA 基因焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析了12個(gè)海水樣品，產(chǎn)生了110950條序列，共檢測(cè)出5752個(gè)OTUs(相當(dāng)于種屬水平)，每個(gè)樣品的序列數(shù)在5774—12877之間，涵蓋的OTU數(shù)平均達(dá)680—1578，為深入探究浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.1 浮游細(xì)菌多樣性與群落組成

維持浮游細(xì)菌在養(yǎng)殖水體中的多樣性可以增強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境生物群落生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，減少養(yǎng)殖生物患病的風(fēng)險(xiǎn)。已有研究表明，高密度網(wǎng)箱增養(yǎng)殖活動(dòng)使養(yǎng)殖區(qū)域及附近水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽和有機(jī)污染物濃度較高，對(duì)細(xì)菌具有一定的選擇作用，導(dǎo)致養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌多樣性較低[3]。本實(shí)驗(yàn)則顯示，網(wǎng)箱區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)的多樣性無(wú)顯著差異。這種差異可能是因?yàn)榫W(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)受污染程度較低，對(duì)浮游細(xì)菌多樣性影響較小，也可能是以前研究不能檢測(cè)到稀有物種造成的。

從浮游細(xì)菌種類(lèi)組成來(lái)看，α-變形菌、γ-變形菌、擬桿菌為海水中主要的優(yōu)勢(shì)菌群，Kirchman也發(fā)現(xiàn)變形菌和擬桿菌是組成海洋異養(yǎng)細(xì)菌的兩個(gè)最大的類(lèi)群[34]。在以前的象山港生態(tài)研究中，利用克隆測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌組成也與上述相似[35]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從網(wǎng)箱區(qū)到非養(yǎng)殖區(qū)，擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低，而γ-變形菌綱的相對(duì)豐度增加，可能是網(wǎng)箱區(qū)域磷酸鹽、總磷濃度較高所致。有研究表明α-變性菌的相對(duì)豐度隨水體中總磷濃度增加顯著增加，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度隨磷酸鹽的濃度升高而增加[36]。對(duì)東海沉積物中的微生物群落結(jié)構(gòu)研究也表明，隨著N、P污染梯度的變化，細(xì)菌群落中γ-變形菌和δ-變形菌相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化，與污染物濃度顯著相關(guān)，能夠指示環(huán)境受污染程度[28]。因此，擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和γ-變形菌綱的豐度對(duì)水質(zhì)變化敏感，可能用于指示和評(píng)價(jià)海水養(yǎng)殖污染的生態(tài)效應(yīng)。

3.2 浮游細(xì)菌群落空間分布

已有研究表明，養(yǎng)殖活動(dòng)能夠改變浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[19]，本文結(jié)果也表明網(wǎng)箱區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)的群落差異顯著。Salvator等[37]對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖活動(dòng)的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)：網(wǎng)箱養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)網(wǎng)箱下微生物的影響效果顯著，但離網(wǎng)箱外50m區(qū)域受養(yǎng)殖活動(dòng)影響較小。本研究中盡管養(yǎng)殖區(qū)站位和非養(yǎng)殖區(qū)站位的距離較遠(yuǎn)，空間距離對(duì)群落變異的影響(10.66%貢獻(xiàn)度)小于環(huán)境因子(38.18%貢獻(xiàn)度)。造成群落變異的主要原因可能是養(yǎng)殖區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)之間水質(zhì)差異較大，如化學(xué)需氧量有顯著差異。有研究表明，水質(zhì)情況相似的采樣點(diǎn)，其浮游細(xì)菌群落的組成也相似[38]。本研究還發(fā)現(xiàn)網(wǎng)箱區(qū)和非養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌群落由表層向底層分布的規(guī)律一致，但水深對(duì)群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)相似性均無(wú)顯著影響。李玉華等[38]通過(guò)對(duì)松花湖水體中不同空間分布的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究表明，水深變化對(duì)細(xì)菌群落垂直分布有重要影響。以上結(jié)果不一致性可能是由于不同深度范圍造成的，如本實(shí)驗(yàn)采樣點(diǎn)最大水深只有8m，遠(yuǎn)小于松花湖平均水深35m。

劉晶晶等[3]對(duì)象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)水體中細(xì)菌分布研究表明，與養(yǎng)殖場(chǎng)魚(yú)類(lèi)疾病相關(guān)的弧菌在網(wǎng)箱區(qū)中的數(shù)量均大于網(wǎng)箱外對(duì)照區(qū)，而本文結(jié)果中，交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和弧菌科(Vibrionaceae)在非養(yǎng)殖區(qū)中的平均相對(duì)豐度較高。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)褐桿菌屬(Phaeobacter)平均相對(duì)豐度在養(yǎng)殖區(qū)顯著高于網(wǎng)箱區(qū)，而褐桿菌屬對(duì)以弧菌、交替假單胞菌等為代表的主要致病菌具有廣泛的抗菌活性譜并且能控制致病菌的繁殖[39-40]。因此，推測(cè)可能是褐桿菌屬的高豐度存在抑制了弧菌和交替假單胞菌的繁殖，具體原因和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 影響浮游細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子

冗余分析表明，化學(xué)需氧量、磷酸鹽、銨鹽和總有機(jī)碳是影響浮游細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子。除總有機(jī)碳外，這與李秋芬等[35]應(yīng)用DGGE技術(shù)對(duì)象山港中部養(yǎng)殖區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的研究所得到的結(jié)果一致。銨鹽和磷酸鹽是調(diào)控浮游細(xì)菌群落分布的重要因子，與浮游細(xì)菌群落分布密切相關(guān)[20]。高密度的水產(chǎn)養(yǎng)殖常造成水體環(huán)境中氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的增加[1]，從而影響浮游細(xì)菌群落組成，包括條件致病菌的增殖和致病性的增加，同時(shí)增加水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原菌的敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致養(yǎng)殖病害的發(fā)生。化學(xué)需氧量是衡量海水中有機(jī)質(zhì)含量的重要指標(biāo)，水體中的溶解性有機(jī)物是異養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖和生命活動(dòng)最基本的營(yíng)養(yǎng)源[20]。在養(yǎng)殖區(qū)中因剩余殘餌和養(yǎng)殖生物的排泄物與分泌物均含有豐富的有機(jī)質(zhì)，造成養(yǎng)殖區(qū)中的化學(xué)需氧量顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)，從而影響浮游細(xì)菌群落組成的分布。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，溶解性總有機(jī)碳是異養(yǎng)細(xì)菌重要的碳源，浮游細(xì)菌可以吸收、利用水體中的溶解性有機(jī)碳，進(jìn)行二次生產(chǎn)，其分布與總有機(jī)碳顯著相關(guān)[13]。有研究表明，總有機(jī)碳與有機(jī)污染物濃度存在正相關(guān)關(guān)系[41]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是由于網(wǎng)箱區(qū)浮游植物的生長(zhǎng)消耗了大量的總有機(jī)碳，而養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)浮游植物的捕食，表現(xiàn)為養(yǎng)殖區(qū)的葉綠素a和總有機(jī)碳濃度較低。

綜上所述，近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖活動(dòng)影響水質(zhì)，進(jìn)而改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且從表層至底層具有相似的演替規(guī)律。其中在網(wǎng)箱區(qū)增加的化學(xué)需氧量、活性磷酸鹽和銨鹽，總有機(jī)碳是驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落變異的主要環(huán)境因子。造成群落差異的敏感類(lèi)群如擬桿菌、放線菌和γ-變形菌可能用于指示和評(píng)價(jià)海水養(yǎng)殖污染程度。

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Distribution of bacterioplankton communities in cage culture and non-cultured areas of Xiangshan Bay, Ningbo, China

HU Changju1, XIONG Jinbo1, CHEN Heping1,2, WANG Kai1, YE Ran3, CUI Yongping3, ZHU Jianlin2, ZHANG Demin1,*

1SchoolofMarineScience,NingboUniversity,Ningbo315211,China2FacultyofArchitectural,CivilEngineeringandEnvironment,NingboUniversity,Ningbo315211,China3MarineEnvironmentalMonitoringCenterofNingbo,SOA,Ningbo315012,China

Intensive aquaculture has been a major source of coastal pollution.Microorganisms play a critical role in primary production and biogeochemical processes such as substance cycling and energy transformation in coastal ecosystems.Bacterioplankton are considered to be a dominant group because of their many contributions to ecosystem functional processes.Studying the influences of aquaculture activities on bacterial diversity in water is significant for assessing the structure and function of mariculture ecosystems.Xiangshan Bay, an important mariculture base located in Ningbo, China, is subject to a large influx of organic matter from the rapid development of aquaculture.Thus, understanding the responsive pattern of the bacterioplankton community to aquaculture sheds light on indicating and evaluating the health status of the mariculture ecosystem.In this study, water samples were collected separately from three depths: the surface, middle, and bottom levels of the water column (corresponding to 0.5, 2.5, and 8.0m below the water surface, respectively), from a cage culture area and a non-cultured area in Xiangshan Bay, on April 10, 2012.Using the 16S rRNA gene amplicon pyrosequencing technique, we evaluated the effects of aquaculture activities on variations within bacterioplankton communities.The results showed that cage aquaculture dramatically changed the geochemical variables of water.For example, there was a substantial increase of chemical oxygen demand in the culture area.In addition, cage aquaculture significantly (P<0.05) altered the bacterioplankton community structure, although the alpha diversity was not affected.The bacterioplankton communities were very similar across the three water depths, dominated by Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, and Unclassified Proteobacteria, accounting for 98.64% of the total bacteria.The relative abundances of some dominant phyla were considerably different between the two investigated areas.For example, the relative abundances of Bacteroidetes and Actinobacteria were significantly lower in the non-cultured area than in the cage culture area, while that of Gammaproteobacteria was significantly higher in the non-cultured area.Similarity percentage (SIMPER) analysis further indicated that the presence of Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, and Bacteroidetes taxa controlled the differences in bacterial communities between the two areas, which contributed to 45.02% of the overall dissimilarity.Redundancy analysis (RDA) showed that the bacterioplankton community variation significantly correlated with chemical oxygen demand, phosphate, ammonium, and total organic carbon.Partial redundancy analysis (pRDA) was conducted in order to quantify the effect of the geographic distance between the two investigated areas on the differences between the bacteria communities.The results showed that the above-mentioned environmental factors in total contributed 38.18% of the bacteria community variation, while the geographic distance contributed only 10.66%, indicating that the influence of environmental factors on bacterial communities was much greater than that of the geographic distance.Overall, this study demonstrated that coastal aquaculture could cause eutrophication of rearing water, which, in turn, drove the variation of the bacterioplankton community, and remarkably altered the relative abundances of Bacteroidetes, Actinobacteria, and Gammaproteobacteria.The sensitivity of these bacteria to the concentration changes of pollutants, represented by nitrogen and phosphorus, indicates their potential usage in assessing the quality of aquaculture water and the health and stability of an aquaculture ecosystem.

bacterioplankton;community composition;cage culture;environmental factors

國(guó)家863資助項(xiàng)目(2012AA092000)；寧波大學(xué)自然科學(xué)基金(XYL14004)

2014-06-17; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期:

日期:2015-05-21

10.5846/stxb201406171263

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhangdemin@nbu.edu.cn

胡常巨，熊金波，陳和平，王凱，葉然，崔永平，朱建林，張德民.象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)菌群落分布.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(24):8053-8061.

Hu C J, Xiong J B, Chen H P, Wang K, Ye R, Cui Y P, Zhu J L, Zhang D M.Distribution of bacterioplankton communities in cage culture and non-cultured areas of Xiangshan Bay, Ningbo, China.Acta Ecologica Sinica,2015,35(24):8053-8061.