余惠娟褚曰環(huán)邵光江帆巢暉

(1中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 廣東廣州510275;2深圳市出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品檢測(cè)技術(shù)中心 廣東深圳518017)

隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)條件在逐步改善，儀器資源也在不斷增加，大型儀器也逐漸服務(wù)于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，在培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考能力和掌握科研技能方面起到了很好的促進(jìn)作用?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS)是一種新型的軟電離質(zhì)譜，可以使不易氣化、電離的樣品分子實(shí)現(xiàn)離子化，且具有靈敏度高、分辨率高、準(zhǔn)確度高、分析速度快以及相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)范圍大等優(yōu)點(diǎn)［1-2］，近年來(lái)已成為聚合物性能分析的一個(gè)不可缺少的手段。MALDI-TOF MS在應(yīng)用于測(cè)試高分子聚合物相對(duì)分子質(zhì)量的過(guò)程中，必須選擇適合該聚合物樣品的溶劑、基質(zhì)和陽(yáng)離子化試劑。本文將從這些方面來(lái)探索聚芐氧羰基賴氨酸樣品測(cè)試條件的優(yōu)化，從中可以培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

基質(zhì)的選擇是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)試的核心，它是測(cè)試成功與否的關(guān)鍵因素［3］;其次，樣品溶劑的選擇也具有非常大的影響。在MALDI-TOF MS檢測(cè)中，多肽類(lèi)高分子聚合物屬于聚合物的范疇，然而對(duì)多肽類(lèi)聚合物的測(cè)試目前還沒(méi)有很成熟的方法，簡(jiǎn)單地利用常規(guī)的聚合物基質(zhì)如2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB)、α-腈基-4-羥基肉桂酸(CHCA)反-2-［3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亞丙烯基］丙二腈(DCTB)等來(lái)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，往往不能得到有效的譜圖，所以找到一種良好的測(cè)試方法就顯得十分必要。本文擬通過(guò)改變聚芐氧羰基賴氨酸(圖1)樣品溶劑、基質(zhì)及添加陽(yáng)離子試劑等條件，來(lái)探索多肽類(lèi)聚合物測(cè)試條件的優(yōu)化，從而得到最佳的測(cè)試結(jié)果。

圖1 聚芐氧羰基賴氨酸的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

樣品:聚芐氧羰基賴氨酸，測(cè)試用戶提供，重復(fù)單體M=262。

基質(zhì):DCTB、CHCA、2，5-DHB、蒽三酚(Dithranol，DIT)，購(gòu)于德國(guó)Bruker Daltonics公司。

溶劑:六氟異丙醇、氯仿、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙酸鉀，購(gòu)于阿拉丁，分析純。

2 儀器及實(shí)驗(yàn)條件

儀器:基質(zhì)輔助激光解吸電離高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，MALDI-TOF MS ultrafleXtreme，德國(guó)Bruker Daltonics公司，氮激光器，波長(zhǎng)355 nm，不銹鋼樣品靶。

實(shí)驗(yàn)條件:樣品與基質(zhì)采用相同溶劑，配置成10 g/L，按體積比1∶1混合后，取2μL點(diǎn)在樣品靶上，自然干燥后測(cè)試，采用反射模式，正離子檢測(cè)。激光頻率為1000 Hz，離子延遲提取時(shí)間為120 ns，能量范圍30%～50%，使用標(biāo)準(zhǔn)多肽進(jìn)行校正。

3 結(jié)果和討論

3.1 基質(zhì)不變、改變?nèi)軇?/h3>

圖2中展示的質(zhì)譜圖基質(zhì)均為DCTB，溶劑分別為氯仿、二氯甲烷、二氯甲烷(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑、氯仿(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑以及六氟異丙醇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑的選擇對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果有一定的影響，用六氟異丙醇作為溶劑比用其他溶劑的效果更好，但是這些質(zhì)譜圖的信號(hào)強(qiáng)度都不高，背景干擾較大。

3.2 溶劑不變、改變基質(zhì)

基質(zhì)的作用是與樣品形成共晶體、吸收激光能量和解離樣品。從3.1中可知采用六氟異丙醇作為溶劑效果較好。為進(jìn)一步優(yōu)化測(cè)試，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用六氟異丙醇作為溶劑，嘗試更換不同基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。圖3(a)采用2，5-DHB作為基質(zhì)，圖3(b)采用CHCA作為基質(zhì)，圖3(c)采用DIT作為基質(zhì)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用2，5-DHB、CHCA、DIT作為基質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度明顯比采用DCTB作為基質(zhì)的高很多，且采用DIT作為基質(zhì)的測(cè)試效果最好，背景干擾的影響較小，測(cè)出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量范圍和信噪比最大。

圖2 基質(zhì)均為DCTB的質(zhì)譜圖

3.3 選中基質(zhì)、再次改變?nèi)軇?/h3>

由于基質(zhì)的選擇是MALDI測(cè)試成功與否的關(guān)鍵因素之一，所以在篩選出一個(gè)較好的基質(zhì)之后，嘗試改變?nèi)軇?，進(jìn)一步探索溶劑對(duì)測(cè)試效果的影響。如圖4所示，DIT作為基質(zhì)時(shí)，各種溶劑均能得到樣品的相對(duì)分子質(zhì)量信息，但仍然是以六氟異丙醇作為溶劑的效果最好。

圖3 溶劑均為六氟異丙醇的質(zhì)譜圖

3.4 添加陽(yáng)離子助劑

在MALDI-TOF MS的分析過(guò)程中，蛋白質(zhì)樣品可以在基質(zhì)的作用下通過(guò)質(zhì)子化作用被電離。而聚合物樣品則不易電離，通常需要加入某種單價(jià)陽(yáng)離子，如Na+、K+和Ag+，配合基質(zhì)的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品離子化。本實(shí)驗(yàn)嘗試加入三氟乙酸鉀作為陽(yáng)離子助劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，基質(zhì)、樣品、陽(yáng)離子助劑的比例為5:1:5，結(jié)果如圖5所示。在加入三氟乙酸鉀作為陽(yáng)離子助劑后，發(fā)現(xiàn)整個(gè)譜圖沒(méi)有了背景干擾，信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，測(cè)出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量范圍更大。

4 結(jié)論

(1)用六氟異丙醇作為溶劑比氯仿、二氯甲烷、二氯甲烷(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑、氯仿(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑的效果更好，因?yàn)槠錁O性強(qiáng)，能夠充分溶解聚多肽和基質(zhì)，使樣品和基質(zhì)能夠很好地結(jié)晶，其沸點(diǎn)也低，容易揮發(fā)。而其他溶劑要么對(duì)樣品的溶解性差，要么沸點(diǎn)高、揮發(fā)性差。

(2)蒽三酚可以有效地和聚多肽結(jié)合，在激光照射到樣品靶的時(shí)候可以有效地吸收能量，并將能量傳遞給聚多肽，使其電離。

圖4 基質(zhì)均為DIT的質(zhì)譜圖

圖5 采用DIT作為基質(zhì)、六氟異丙醇作為溶劑、三氟乙酸鉀作為陽(yáng)離子助劑的質(zhì)譜圖

(3)選擇合適的陽(yáng)離子化試劑，可有效幫助樣品離子化。然而陽(yáng)離子化試劑既要考慮其離子化作用，又不能干擾基質(zhì)與樣品形成共結(jié)晶。

用MALDI-TOF MS來(lái)檢測(cè)多肽類(lèi)聚合物相對(duì)分子質(zhì)量時(shí)，選擇蒽三酚作為基質(zhì)，六氟異丙醇作為溶劑，并加入適量的三氟乙酸鉀作為陽(yáng)離子助劑，可以得到較好的檢測(cè)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施過(guò)程是一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件逐步優(yōu)化的過(guò)程，從中可以培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。本實(shí)驗(yàn)不僅可設(shè)計(jì)為高年級(jí)本科生和研究生實(shí)驗(yàn)技能的培訓(xùn)課程，同時(shí)其研究成果也可以使公共實(shí)驗(yàn)室的儀器更好地為師生的科研服務(wù)。

［1］倪國(guó)新，朱鐳，馬小土，等.分析化學(xué)，2009，37(9):1291

［2］汪正范，劉娜，張婷.現(xiàn)代儀器，2009，15(6):77

［3］向弘，朱斌，徐昕榮，等.廣東化工，2009，8(36):85