余惠娟褚曰環(huán)邵光江帆巢暉

(1中山大學化學與化學工程學院 廣東廣州510275;2深圳市出入境檢驗檢疫局工業(yè)品檢測技術(shù)中心 廣東深圳518017)

隨著經(jīng)濟水平的不斷發(fā)展，實驗條件在逐步改善，儀器資源也在不斷增加，大型儀器也逐漸服務(wù)于基礎(chǔ)實驗教學，在培養(yǎng)學生獨立思考能力和掌握科研技能方面起到了很好的促進作用?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS)是一種新型的軟電離質(zhì)譜，可以使不易氣化、電離的樣品分子實現(xiàn)離子化，且具有靈敏度高、分辨率高、準確度高、分析速度快以及相對分子質(zhì)量檢測范圍大等優(yōu)點［1-2］，近年來已成為聚合物性能分析的一個不可缺少的手段。MALDI-TOF MS在應(yīng)用于測試高分子聚合物相對分子質(zhì)量的過程中，必須選擇適合該聚合物樣品的溶劑、基質(zhì)和陽離子化試劑。本文將從這些方面來探索聚芐氧羰基賴氨酸樣品測試條件的優(yōu)化，從中可以培養(yǎng)學生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。

基質(zhì)的選擇是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜測試的核心，它是測試成功與否的關(guān)鍵因素［3］;其次，樣品溶劑的選擇也具有非常大的影響。在MALDI-TOF MS檢測中，多肽類高分子聚合物屬于聚合物的范疇，然而對多肽類聚合物的測試目前還沒有很成熟的方法，簡單地利用常規(guī)的聚合物基質(zhì)如2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB)、α-腈基-4-羥基肉桂酸(CHCA)反-2-［3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亞丙烯基］丙二腈(DCTB)等來對其進行檢測，往往不能得到有效的譜圖，所以找到一種良好的測試方法就顯得十分必要。本文擬通過改變聚芐氧羰基賴氨酸(圖1)樣品溶劑、基質(zhì)及添加陽離子試劑等條件，來探索多肽類聚合物測試條件的優(yōu)化，從而得到最佳的測試結(jié)果。

圖1 聚芐氧羰基賴氨酸的結(jié)構(gòu)式

1 實驗材料和試劑

樣品:聚芐氧羰基賴氨酸，測試用戶提供，重復單體M=262。

基質(zhì):DCTB、CHCA、2，5-DHB、蒽三酚(Dithranol，DIT)，購于德國Bruker Daltonics公司。

溶劑:六氟異丙醇、氯仿、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙酸鉀，購于阿拉丁，分析純。

2 儀器及實驗條件

儀器:基質(zhì)輔助激光解吸電離高分辨飛行時間質(zhì)譜儀，MALDI-TOF MS ultrafleXtreme，德國Bruker Daltonics公司，氮激光器，波長355 nm，不銹鋼樣品靶。

實驗條件:樣品與基質(zhì)采用相同溶劑，配置成10 g/L，按體積比1∶1混合后，取2μL點在樣品靶上，自然干燥后測試，采用反射模式，正離子檢測。激光頻率為1000 Hz，離子延遲提取時間為120 ns，能量范圍30%～50%，使用標準多肽進行校正。

3 結(jié)果和討論

3.1 基質(zhì)不變、改變?nèi)軇?/h3>

圖2中展示的質(zhì)譜圖基質(zhì)均為DCTB，溶劑分別為氯仿、二氯甲烷、二氯甲烷(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑、氯仿(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑以及六氟異丙醇。實驗結(jié)果表明，溶劑的選擇對質(zhì)譜檢測結(jié)果有一定的影響，用六氟異丙醇作為溶劑比用其他溶劑的效果更好，但是這些質(zhì)譜圖的信號強度都不高，背景干擾較大。

3.2 溶劑不變、改變基質(zhì)

基質(zhì)的作用是與樣品形成共晶體、吸收激光能量和解離樣品。從3.1中可知采用六氟異丙醇作為溶劑效果較好。為進一步優(yōu)化測試，本實驗繼續(xù)采用六氟異丙醇作為溶劑，嘗試更換不同基質(zhì)進行試驗。圖3(a)采用2，5-DHB作為基質(zhì)，圖3(b)采用CHCA作為基質(zhì)，圖3(c)采用DIT作為基質(zhì)，試驗結(jié)果顯示，采用2，5-DHB、CHCA、DIT作為基質(zhì)的信號強度明顯比采用DCTB作為基質(zhì)的高很多，且采用DIT作為基質(zhì)的測試效果最好，背景干擾的影響較小，測出樣品的相對分子質(zhì)量范圍和信噪比最大。

圖2 基質(zhì)均為DCTB的質(zhì)譜圖

3.3 選中基質(zhì)、再次改變?nèi)軇?/h3>

由于基質(zhì)的選擇是MALDI測試成功與否的關(guān)鍵因素之一，所以在篩選出一個較好的基質(zhì)之后，嘗試改變?nèi)軇?，進一步探索溶劑對測試效果的影響。如圖4所示，DIT作為基質(zhì)時，各種溶劑均能得到樣品的相對分子質(zhì)量信息，但仍然是以六氟異丙醇作為溶劑的效果最好。

圖3 溶劑均為六氟異丙醇的質(zhì)譜圖

3.4 添加陽離子助劑

在MALDI-TOF MS的分析過程中，蛋白質(zhì)樣品可以在基質(zhì)的作用下通過質(zhì)子化作用被電離。而聚合物樣品則不易電離，通常需要加入某種單價陽離子，如Na+、K+和Ag+，配合基質(zhì)的作用來實現(xiàn)樣品離子化。本實驗嘗試加入三氟乙酸鉀作為陽離子助劑進行實驗，基質(zhì)、樣品、陽離子助劑的比例為5:1:5，結(jié)果如圖5所示。在加入三氟乙酸鉀作為陽離子助劑后，發(fā)現(xiàn)整個譜圖沒有了背景干擾，信號強度明顯增強，測出樣品的相對分子質(zhì)量范圍更大。

4 結(jié)論

(1)用六氟異丙醇作為溶劑比氯仿、二氯甲烷、二氯甲烷(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑、氯仿(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶劑的效果更好，因為其極性強，能夠充分溶解聚多肽和基質(zhì)，使樣品和基質(zhì)能夠很好地結(jié)晶，其沸點也低，容易揮發(fā)。而其他溶劑要么對樣品的溶解性差，要么沸點高、揮發(fā)性差。

(2)蒽三酚可以有效地和聚多肽結(jié)合，在激光照射到樣品靶的時候可以有效地吸收能量，并將能量傳遞給聚多肽，使其電離。

圖4 基質(zhì)均為DIT的質(zhì)譜圖

圖5 采用DIT作為基質(zhì)、六氟異丙醇作為溶劑、三氟乙酸鉀作為陽離子助劑的質(zhì)譜圖

(3)選擇合適的陽離子化試劑，可有效幫助樣品離子化。然而陽離子化試劑既要考慮其離子化作用，又不能干擾基質(zhì)與樣品形成共結(jié)晶。

用MALDI-TOF MS來檢測多肽類聚合物相對分子質(zhì)量時，選擇蒽三酚作為基質(zhì)，六氟異丙醇作為溶劑，并加入適量的三氟乙酸鉀作為陽離子助劑，可以得到較好的檢測結(jié)果。本實驗的實施過程是一個實驗條件逐步優(yōu)化的過程，從中可以培養(yǎng)學生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。本實驗不僅可設(shè)計為高年級本科生和研究生實驗技能的培訓課程，同時其研究成果也可以使公共實驗室的儀器更好地為師生的科研服務(wù)。

［1］倪國新，朱鐳，馬小土，等.分析化學，2009，37(9):1291

［2］汪正范，劉娜，張婷.現(xiàn)代儀器，2009，15(6):77

［3］向弘，朱斌，徐昕榮，等.廣東化工，2009，8(36):85