高磊雷曉光1，*

(1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系 北京100871;2北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院 北京100730;3北京生命科學(xué)研究所 北京102206)

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時(shí)代。如何確定每個(gè)基因所對(duì)應(yīng)蛋白的功能成為遺傳學(xué)家所面臨的難題。傳統(tǒng)的遺傳學(xué)研究方法主要是利用各種基因突變來改變所研究生物體的遺傳基因，從而獲得可穩(wěn)定遺傳的變異體，并利用變異體來確定基因或者蛋白的功能。雖然我們利用模式生物，通過傳統(tǒng)的遺傳學(xué)研究方法，已經(jīng)確定了許多基因的功能，但這種方法也存在著許多不足［1-2］:①許多基因具有遺傳冗余性，突變其中之一并不會(huì)出現(xiàn)遺傳性狀的改變;②某些基因?qū)τ谏矬w來講非常重要，突變了該基因使得生物體無法存活;③對(duì)于繁殖速率慢，個(gè)體較大，基因組是多倍體的哺乳動(dòng)物來說，得到穩(wěn)定遺傳的突變體是很困難的;④對(duì)于復(fù)雜系統(tǒng)來講，某些蛋白的功能可以通過其他方式來調(diào)控(例如磷酸化、去磷酸化)，并不能通過簡(jiǎn)單的減少其表達(dá)來確定其功能［3］。生物活性小分子能夠與特定蛋白質(zhì)相互作用，并可以條件性地改變靶標(biāo)蛋白的功能和活性，所以克服了基因冗余和基因致死等難題，這種新的遺傳學(xué)研究的方法被稱為化學(xué)遺傳學(xué)(chemical genetics)［4］。由于生物活性小分子可以隨時(shí)加入或移除，這使得化學(xué)遺傳學(xué)除了克服基因冗余和基因致死等難題外，還有與生俱來的優(yōu)勢(shì)——時(shí)空可控性。正因?yàn)榛瘜W(xué)遺傳學(xué)的這些優(yōu)勢(shì)，使得它在現(xiàn)代藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)上扮演著越來越重要的角色［3］。

1 化學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展歷史

化學(xué)遺傳學(xué)是建立在兩個(gè)前提之上的:①生物活性小分子能夠獲得;②這些小分子能夠與生物體內(nèi)的靶標(biāo)蛋白(或稱為受體)結(jié)合［1］?；瘜W(xué)遺傳學(xué)概念的雛形最早可以追溯到幾百年甚至幾千年前，那時(shí)人們已經(jīng)開始使用天然產(chǎn)物來治療一些病癥。例如，早在公元前15世紀(jì)，古埃及人就利用柳樹皮的提取物來治療頭疼、發(fā)燒或者炎癥。但在當(dāng)時(shí)，人們并不清楚在柳樹皮提取物中的有效化學(xué)成分是什么，更不清楚它的作用機(jī)制。在18世紀(jì)，許多研究者開始意識(shí)到，在植物提取液中，可能是某一種單一的成分作用于動(dòng)物的某個(gè)部位。1804年，第一個(gè)生物活性小分子——嗎啡被Friedrich Sertürner從罌粟中分離出來，證實(shí)了人們的猜想。在1826年前后，柳樹皮中治療頭痛的有效成分——水楊酸(著名的阿司匹林就是水楊酸的衍生物)也被分離出來。這些具有生物活性的天然產(chǎn)物的分離不僅推動(dòng)了近現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展，更重要的是奠定了化學(xué)遺傳學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，使人們認(rèn)識(shí)到，單一化合物就可以具有生物學(xué)活性。

雖然當(dāng)時(shí)人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，在柳樹皮提取液中，是水楊酸發(fā)揮著藥效，但并不清楚它的作用機(jī)制。在19世紀(jì)早期，F(xiàn)rancois Magendie和Claude Bernard提出，這些生物活性小分子可能作用于身體的某些部位;隨后Rudolf Buchheim認(rèn)識(shí)到，藥物的生物學(xué)活性可能是由于藥物分子與細(xì)胞內(nèi)組分發(fā)生了生物化學(xué)反應(yīng)而引起的;直到20世紀(jì)初，Paul Ehrlich才提出了受體的概念，他把受體定義為“小分子唯一的特定蛋白靶標(biāo)”。對(duì)于化學(xué)遺傳學(xué)來說，受體的提出是一個(gè)重大的突破，它使人們開始重視和利用生物活性小分子與蛋白的相互作用，這使化學(xué)遺傳學(xué)研究方法逐步走向成熟。

化學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展是建立在有機(jī)合成特別是天然產(chǎn)物全合成的基礎(chǔ)之上的。隨著天然產(chǎn)物分離和有機(jī)合成技術(shù)的日趨成熟，越來越多的生物活性小分子被合成出來(例如雷帕霉素、紫杉醇等)。這些化合物往往表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性，吸引著科學(xué)家去找尋它們的受體。作為化學(xué)遺傳學(xué)的奠基人之一，哈佛大學(xué)的Stuart Schreiber教授無疑是其中的佼佼者。從他1981年獨(dú)立工作以來，他與合作者合成了許多具有非常重要生物活性的天然產(chǎn)物，包括FK506、lactacystin、trapoxin等。通過化學(xué)遺傳學(xué)的研究方法，1988年，Stuart Schreiber發(fā)現(xiàn)了FK506受體蛋白——FKBP12，闡明了免疫抑制劑FK506是通過構(gòu)成FKBP12-FK506-鈣調(diào)磷酸酶三元復(fù)合體來抑制鈣調(diào)磷酸酶的活性［5］;1995年，他使用氚標(biāo)記的方法，發(fā)現(xiàn)lactacystin可以特異性地與20S蛋白酶體結(jié)合［6］;1997年，他利用從微生物中分離出來的一種環(huán)五肽類天然產(chǎn)物——trapoxin，找到了一種全新功能的蛋白——組蛋白去乙?；?HDAC)［7］。組蛋白去乙?；傅陌l(fā)現(xiàn)不僅給抗癌藥物的研發(fā)帶來了新的思路，更對(duì)表觀遺傳學(xué)的發(fā)展有著深刻的影響。1997年，他因在化學(xué)合成方面的貢獻(xiàn)和對(duì)生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的間接影響而獲得了四面體有機(jī)化學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)(Tetrahedron Prize for Creativity in Organic Chemistry)。在隨后的1998年，他發(fā)表了名為《Chemical Genetics Resulting from a Passion for Synthetic Organic Chemistry》的綜述，介紹了把這種利用有機(jī)小分子配體來研究蛋白功能的方法定義為化學(xué)遺傳學(xué)(chemical genetics)的理由和自己是如何走上化學(xué)遺傳學(xué)這條道路［8］。從此，化學(xué)遺傳學(xué)的概念越來越受到人們的關(guān)注和認(rèn)同。

2 傳統(tǒng)遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)

在研究某一生物學(xué)系統(tǒng)的功能時(shí)，常用的方法就是通過打破該系統(tǒng)的平衡來觀察和分析該系統(tǒng)被擾動(dòng)后的功能變化。而打破生物學(xué)系統(tǒng)平衡的最傳統(tǒng)的方式就是基因突變，這種遺傳學(xué)研究方法被稱為經(jīng)典遺傳學(xué)(classic genetics)。經(jīng)典遺傳學(xué)根據(jù)研究過程的不同可以分為兩類［9］(圖1A):①如果我們對(duì)一個(gè)已知基因的功能感興趣，我們可以對(duì)其進(jìn)行突變，然后觀察突變之后的表型變化，這樣就能知道該基因的功能，這種由基因到表型的研究方法被稱為反向遺傳學(xué)(reverse genetics);②對(duì)細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)突變，得到大量的突變體，在這些突變體中找到感興趣的表型，最后再找到對(duì)應(yīng)的基因，這種由表型到基因的方法叫做正向遺傳學(xué)(forward genetics)。打破生物學(xué)系統(tǒng)平衡的另一種方式是利用生物活性小分子與其受體的相互作用來引起某個(gè)生物學(xué)系統(tǒng)改變的方式，而這種方法就是化學(xué)遺傳學(xué)。與經(jīng)典遺傳學(xué)類似，化學(xué)遺傳學(xué)也可以分為正向化學(xué)遺傳學(xué)(forward chemical genetics)和反向化學(xué)遺傳學(xué)(reverse chemical genetics)，如圖1B所示［9］。一般來講，正向化學(xué)遺傳學(xué)研究過程遵循著以下步驟:①利用高通量篩選技術(shù)(HTS)對(duì)已有的化合物庫進(jìn)行大規(guī)模篩選(目的與正向遺傳學(xué)中的隨機(jī)突變類似);②找到能引起感興趣表型的生物活性小分子;③利用這個(gè)分子來找到靶標(biāo)蛋白。如果我們對(duì)某個(gè)已知的蛋白的功能比較感興趣，就可以利用反向遺傳學(xué)的方法來研究其功能:①利用HTS技術(shù)對(duì)已有的化合物庫進(jìn)行篩選，找到能與該蛋白特異性結(jié)合的小分子;②將該小分子加入到生物體中進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察生物體表型和功能的變化;③將蛋白和表型或功能變化直接關(guān)聯(lián)起來，就能知道該蛋白的生物學(xué)功能。

圖1 經(jīng)典遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)流程

從化學(xué)遺傳學(xué)研究方法的實(shí)驗(yàn)流程可以看出，快速篩選技術(shù)(例如高通量篩選技術(shù))的發(fā)展對(duì)于化學(xué)遺傳學(xué)的進(jìn)步有著深刻的影響，它使我們能夠簡(jiǎn)單高效地對(duì)某個(gè)表型或者實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行成百上千次的篩選。其次，化學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展也離不開能快速合成結(jié)構(gòu)多樣、數(shù)目龐大的化合物庫的技術(shù)，例如組合化學(xué)(combinatorial synthesis)、固相合成化學(xué)(solid phase synthesis)和多樣性導(dǎo)向合成(diversity oriented synthesis)。這些技術(shù)使快速合成結(jié)構(gòu)多樣的小分子有機(jī)化合物成為現(xiàn)實(shí);而后商業(yè)用小分子化合物庫的出現(xiàn)，極大地促進(jìn)了化學(xué)遺傳學(xué)方法的普及。再次，對(duì)于正向化學(xué)遺傳學(xué)來說，利用小分子探針從復(fù)雜的生物體系中找到其特異性靶標(biāo)蛋白的技術(shù)，例如蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)，也是一個(gè)不可缺少的工具;而對(duì)于反向化學(xué)遺傳學(xué)來說，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化技術(shù)是重中之重。此外，其他技術(shù)［10-11］也對(duì)化學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展起著推動(dòng)作用。例如，蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)幫助了生物學(xué)家了解蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，而在此基礎(chǔ)上，化學(xué)家利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)就能更準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)和合成該蛋白的小分子配體，極大地推動(dòng)了反向遺傳學(xué)研究方法的應(yīng)用。

3 化學(xué)遺傳學(xué)在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)上的應(yīng)用

3.1 發(fā)現(xiàn)全新的生物靶點(diǎn)和生物作用機(jī)制

在真核細(xì)胞內(nèi)，遺傳信息——基因存在于染色體上，而染色體主要是由組蛋白包裹著DNA折疊而成。組蛋白末端在一般情況下由于賴氨酸和精氨酸的存在而帶正電荷，正電荷會(huì)幫助組蛋白包裹帶負(fù)電的DNA。一旦賴氨酸或者精氨酸的氨基被乙?；?，那么組蛋白的正電荷消失，使得染色小體的結(jié)構(gòu)變得松散，轉(zhuǎn)錄因子能夠與啟動(dòng)子結(jié)合而促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。組蛋白去乙?；?histone deacetylase)的作用就是脫去組蛋白近氨基端賴氨酸上的乙?；鶊F(tuán)，使得組蛋白帶正電，這樣組蛋白就能夠與DNA更緊密結(jié)合，從而阻止了該區(qū)域基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在早期研究中，曲古抑菌素和一種來源于微生物的環(huán)五肽類天然產(chǎn)物——trapoxin被證明可以抑制組蛋白去乙?；倪^程，但具體的機(jī)制并不是很清楚。1996年，Stuart Schreiber等人通過研究結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系(SAR)，發(fā)現(xiàn)親電基團(tuán)環(huán)氧酮對(duì)于抑制組蛋白去乙?；潜夭豢缮俚幕钚曰鶊F(tuán)。隨后，他們利用全合成的技術(shù)，合成了氚取代的trapoxin和探針分子(圖2)，利用蛋白質(zhì)親和標(biāo)記及親和層析的方法找到了一個(gè)全新功能的蛋白——組蛋白去乙?；福?］。至此，有機(jī)小分子trapoxin抑制組蛋白去乙?；^程的機(jī)制不再是個(gè)謎:trapoxin和N-乙?；嚢彼釒缀跏请娮拥扰诺?，所以trapoxin可以作為一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的底物與組蛋白去乙?；附Y(jié)合，結(jié)合之后，親電基團(tuán)環(huán)氧酮能夠與組蛋白去乙?；富钚晕稽c(diǎn)上富含電子的氮原子反應(yīng)，這樣使得組蛋白去乙?；覆豢赡娴厥セ钚?。利用正向化學(xué)遺傳學(xué)的方法，Stuart Schreiber等人不僅發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)里最重要的蛋白之一——組蛋白去乙?；福€為癌癥治療帶了新的思路。例如，2006年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)的組蛋白去乙?；敢种苿┧幬铩⒅Z他(vorinostat)。

圖2 trapoxin探針合成及其作用機(jī)理研究

3.2 發(fā)現(xiàn)已知生物靶點(diǎn)的新的調(diào)控機(jī)制或生物學(xué)功能

2009年起，本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)地研究了具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類天然產(chǎn)物的全合成。以相同的倍半萜內(nèi)酯單體(dehydrozaluzanin C)作為合成前體，利用集成全合成策略，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的二倍體(ainsliadimers A and B)［12］和三倍體(ainsliatrimers A and B)［13］的仿生合成。在隨后的生物學(xué)活性研究上，我們發(fā)現(xiàn)ainsliatrimers A能通過誘導(dǎo)凋亡的方式殺死癌細(xì)胞，但這類天然產(chǎn)物的作用機(jī)理并不清楚。利用多樣化合成和生物正交反應(yīng)的策略，我們實(shí)現(xiàn)了ainsliatrimers A在HeLa細(xì)胞內(nèi)的熒光定位，發(fā)現(xiàn)其靶蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)(圖3)。

圖3 利用天然產(chǎn)物ainsliatrimers A的分子探針來探尋細(xì)胞內(nèi)蛋白靶標(biāo)的過程

接下來，我們將基于ainsliatrimers A的小分子探針與HeLa細(xì)胞核提取物進(jìn)行共孵育，利用“pull-down”和肽質(zhì)量指紋圖譜分析(peptide mass fingerprinting analysis)，我們找到了兩個(gè)最可能的核蛋白——過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)和組蛋白去乙?；?(HDAC2)。為了進(jìn)一步確定ainsliatrimers A的靶標(biāo)蛋白，我們利用RNA干擾技術(shù)分別對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行Knockdown實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，降低PPARγ的表達(dá)能夠明顯減弱ainsliatrimers A的細(xì)胞毒性;而降低HDAC2的表達(dá)并不能提高ainsliatrimers A處理下的HeLa細(xì)胞存活率。這些結(jié)果顯示，ainsliatrimers A的靶標(biāo)蛋白是PPARγ而不是HDAC2［14］。

本實(shí)驗(yàn)室除了利用天然產(chǎn)物作為生物活性小分子來探索其蛋白靶標(biāo)外，也通過高通量篩選來找到有生物活性的有機(jī)小分子，并利用這類小分子來進(jìn)行化學(xué)遺傳學(xué)相關(guān)研究。細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的另一個(gè)途徑，但相比于“凋亡”來說，其具體的細(xì)胞學(xué)機(jī)制并不清楚。2009年，王曉東課題組［15］及另兩個(gè)課題組——Francis Ka-Ming Chan課題組［16］和韓家淮課題組［17］先后在《Cell》和《Science》上發(fā)表文章，闡明了受體相互作用蛋白3(RIP3)在受體相互作用蛋白1(RIP1)介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死中起著重要作用，但RIP3下游的靶標(biāo)蛋白卻仍是個(gè)謎。2012年，本實(shí)驗(yàn)室與王曉東實(shí)驗(yàn)室合作，建立了細(xì)胞壞死小分子抑制劑的高通量篩選模型，從大約有20萬個(gè)化合物的小分子庫中篩選到一個(gè)先導(dǎo)化合物(IC50≈1μmol/L)，隨后對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到作用于RIP3下游通路的生物活性小分子——necrosulfonamide(NSA，IC50≤0.2μmol/L)，并將其改造成為小分子探針。通過利用免疫沉淀和質(zhì)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)混合連接激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)可以與RIP3相互作用，隨后利用小分子探針進(jìn)行“pull-down”實(shí)驗(yàn)，找出的靶標(biāo)蛋白正是MLKL，這說明MLKL很可能是RIP3下游的底物。我們通過研究結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系(SAR)，發(fā)現(xiàn)在NSA中，α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)對(duì)于該小分子與MLKL的N端片段相互作用是必不可少的。由此，我們推測(cè)，MLKL可能通過半胱氨酸上的巰基與不飽和酮形成不可逆的共價(jià)鍵，從而抑制了細(xì)胞壞死(圖4)。通過比較人和小鼠的MLKL的N端片段，我們發(fā)現(xiàn)，在這一區(qū)域內(nèi)，除了86位半胱氨酸外，人源MLKL的所有半胱氨酸都與小鼠相同，而該小分子僅僅能與人源MLKL結(jié)合而不能與鼠源MLKL結(jié)合，所以我們推測(cè)是86位的半胱氨酸與該分子形成了共價(jià)鍵。隨后我們把86位半胱氨酸突變成絲氨酸，發(fā)現(xiàn)該小分子失去了抑制細(xì)胞壞死的活性且不能與人源MLKL結(jié)合，這進(jìn)一步證實(shí)了該小分子是通過與86位半胱氨酸形成共價(jià)鍵來抑制細(xì)胞壞死的。為了進(jìn)一步證實(shí)MLKL是RIP3的底物，我們?cè)隗w外對(duì)RIP3和MLKL進(jìn)行培養(yǎng)，隨后對(duì)MLKL進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)MLKL的357位的蘇氨酸和358位的絲氨酸被RIP3磷酸化。這說明MLKL就是RIP3在細(xì)胞壞死信號(hào)通路中的底物，它對(duì)于細(xì)胞壞死非常重要［18］。

圖4 利用正向化學(xué)遺傳學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)RIP3下游底物蛋白——MLKL

4 總結(jié)與展望

許多生物學(xué)知識(shí)都來源于經(jīng)典遺傳學(xué)，然而僅僅利用經(jīng)典遺傳學(xué)方法來探索生物學(xué)系統(tǒng)的功能是不夠的。化學(xué)遺傳學(xué)研究方法是利用可透過細(xì)胞膜的生物活性小分子來快速、可逆、條件性地干擾靶標(biāo)蛋白的功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物學(xué)系統(tǒng)功能的定量時(shí)空可控。化學(xué)遺傳學(xué)作為經(jīng)典遺傳學(xué)方法的補(bǔ)充和延伸，很好地克服了經(jīng)典遺傳學(xué)研究方法所面臨的困難，進(jìn)一步推動(dòng)了我們對(duì)生物學(xué)的了解和認(rèn)知。目前來講，化學(xué)遺傳學(xué)研究還面臨著一些挑戰(zhàn)，例如:如何高效產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同且復(fù)雜的生物活性小分子;如何克服生物活性小分子在生物系統(tǒng)中存在的多效性難題(off targets效應(yīng))等。但我們相信，隨著有機(jī)合成技術(shù)的完善、蛋白結(jié)構(gòu)信息的積累以及一些新技術(shù)的出現(xiàn)，化學(xué)遺傳學(xué)研究方法將進(jìn)一步推動(dòng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，給人類社會(huì)帶來巨大的進(jìn)步。

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