魏璽，張晟，高明

MDMX與CK1α對p53抑癌蛋白調(diào)節(jié)機制的研究進展

魏璽1，張晟1，高明2△

作為抑癌蛋白，p53參與了細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導過程，并在細胞周期調(diào)控、細胞凋亡及衰老等過程中發(fā)揮了重要的作用。鼠雙微基因（murine double minute，MDM）2和MDMX（又稱MDM4，murine double minute 4）是p53兩個重要的調(diào)控因子。其中，MDMX能夠通過與p53蛋白的相互作用以及轉(zhuǎn)錄后修飾來調(diào)節(jié)p53蛋白功能。雖然MDMX與MDM2蛋白結構同源，但是由于MDMX缺少E3連接酶，因此無法介導p53蛋白的降解。然而，MDMX本身能夠通過分子內(nèi)部結構的折疊與展開，與p53蛋白相互作用后調(diào)節(jié)其活性。在該過程中，MDMX的主要分子伴侶——CK1α（casein kinase 1 alpha）通過磷酸化MDMX并干擾其分子內(nèi)部結合，從而協(xié)同調(diào)節(jié)p53蛋白。因而，MDMX及CK1α對p53蛋白的調(diào)節(jié)是一個多步驟、多因素參與的復雜過程。本文擬就MDMX以及CK1α對p53蛋白的具體調(diào)節(jié)機制進行綜述。

腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53；酪蛋白激酶1α；p53蛋白；MDMX

p53作為一種重要的抑癌蛋白，在抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。p53的丟失或是突變能夠增加癌癥發(fā)生概率并導致惡性腫瘤進展［1］。p53作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞周期調(diào)控、衰老及凋亡等過程中發(fā)揮很重要的作用［2-4］。在正常生理條件下，鼠雙微基因4（MDMX，又稱MDM4，murine double minute 4）是p53的關鍵調(diào)節(jié)蛋白，而酪蛋白激酶（casein kinase，CK）1α又是MDMX重要的分子伴侶。本文主要就MDMX以及CK1α對p53蛋白的調(diào)節(jié)機制綜述如下。

1 MDMX對p53蛋白的調(diào)節(jié)機制

MDMX及鼠雙微基因2（murine double minute 2，MDM2）是p53的2個重要的調(diào)節(jié)蛋白，控制著p53蛋白的表達及轉(zhuǎn)錄活化。當p53被DNA損傷信號活化時，磷酸化的p53、MDM2及MDMX能夠協(xié)同、快速地出現(xiàn)反應。MDM2是一種經(jīng)典的p53轉(zhuǎn)錄活化靶點，能夠形成一種負反饋調(diào)節(jié)機制［5］。雖然MDMX缺少穩(wěn)定的E3連接酶激活機制，但是其在調(diào)節(jié)p53轉(zhuǎn)錄活性方面仍占主要地位［6］。動物實驗證明，在DNA損傷過程中，MDMX表達或者磷酸化是被共濟失調(diào)毛細血管擴張癥致病基因/細胞周期檢查點激酶2（ATM/ Chk2）路徑所活化。MDMX蛋白表達水平也能夠被應激水平下MDM2介導的泛素化激活。同時，MDMX的C端位點在DNA損傷后出現(xiàn)降解，而其中的2個磷酸化位點S342及S367分別被Chk2和ATM所活化［7］。

1996年MDMX第一次被鑒定出來，后來證實為MDM2的同源結合蛋白。MDMX結構上與MDM2相似，與MDM2 C端RING結構域形成異二聚體，加強了MDM2對于p53的泛素化降解能力［8-9］。另外，MDM2能夠泛素化并降解MDMX，最終產(chǎn)生相對穩(wěn)定的MDM2、MDMX及p53蛋白［10-11］。MD?MX過表達能夠在多數(shù)表達野生型p53的腫瘤以及腫瘤細胞系出現(xiàn)。有研究顯示208例腦膠質(zhì)瘤患者中有5例出現(xiàn)MDMX擴增及過表達［12］。最近研究發(fā)現(xiàn)MDMX在視網(wǎng)膜母細胞瘤中出現(xiàn)擴增及過表達［13-14］。近30%的腫瘤細胞監(jiān)測中，MDMX不僅過表達而且轉(zhuǎn)錄增加，總的來說這些表現(xiàn)與p53野生型的表現(xiàn)有關。另一項研究顯示，一系列腫瘤如乳腺癌、大腸癌及肺癌中會出現(xiàn)MDMX的過表達［15］。所有病例中，MDMX的過表達與p53野生型相關，并缺乏MDM2的擴增［15-16］。另外，MDMX過表達也能夠阻止Ras誘導的細胞成熟前凋亡，以及MDMX能夠與Ras相配合轉(zhuǎn)化細胞，使其在裸鼠中形成腫瘤。總之，MDMX能夠抑制p53活性，并且減少突變體引起的活性消失從而促進腫瘤的發(fā)生［15］。

MDMX轉(zhuǎn)錄后修飾包括磷酸化、泛素化及乙?；?。其中，被MDM2泛素化的MDMX是最早記錄的MDMX轉(zhuǎn)錄后修飾［17-18］。MDM2的RING結構域被認為是與MDMX相互作用以及提供E3連接酶功能。這個作用被可變閱讀框（alter?nate reading frame，ARF）以及DNA損傷所刺激，并與MDM2的ARF功能相關。有意思的是，ARF抑制了MDM2 E3連接酶的降解活性作用，并促進p53和MDM2這2個蛋白的穩(wěn)定。換句話說，ARF被認為是促進MDM2依賴的MDMX降解。這也說明，p53被ARF激活后，增強MDMX的降解以及減少p53的泛素化［19］。另外，核小體應激反應也能夠通過L11-MDM2相互作用以及原癌基因損傷，進一步降解MDMX蛋白［20］。MDMX對于p53的生理功能的重要性已被MDMX敲除小鼠的致死性所證實，然而這種致死性可以被協(xié)同敲除p53基因所反轉(zhuǎn)［21］。

對于MDMX活性的最初報道是p53內(nèi)源性目的基因?qū)е碌漠愇槐磉_抑制了p53誘導轉(zhuǎn)錄活性［2］。這個作用依賴于p53-MDMX之間的結合域。p53的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域是MDMX/ p53以及MDM2/p53之間的相互作用所必需的［15］。這表明MDMX能夠抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，而這種作用是通過干擾p53結合于目的基因的啟動子來實現(xiàn)的。

MDMX通過MDM2的RING結構域與MDM2結合并影響p53與MDM2的穩(wěn)定性。一項研究顯示MDMX通過干擾MDM2的自身泛素化從而穩(wěn)定MDM2不被降解［22］。另一項研究顯示，通過siRNA敲除MDMX能夠降低MDM2水平，而增加了p53蛋白的表達［23］。有研究在U20S和MCF-7細胞系中應用siRNA敲除MDMX后，增加了MDM2和p53的蛋白表達水平［24］。而另一研究顯示將MCF-7細胞系中敲除MDMX，并不影響MDM2或p53的蛋白水平［15］。其他研究發(fā)現(xiàn)，MDMX水平的增高能夠通過防止MDM2的降解及MDM2依賴的泛素化，從而穩(wěn)定p53蛋白［6］。這種作用被認為是降低MDM2誘導的p53核內(nèi)輸出以及有效降解p53蛋白的結果。

以上研究結果的分歧之處在于MDMX和MDM2的比例是否能夠決定p53的總體效果。如果MDMX與MDM2的比例接近1∶1，p53決定MDM2依賴的蛋白降解；若MDMX表達水平高于MDM2，MDMX抑制MDM2介導的p53降解。進一步講，MDMX水平增高，MDM2和MDMX競爭結合p53，MDM2有可能被MDMX所取代。在這種情況下，MDMX抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，而不依賴于MDM2［25］。

免疫熒光實驗研究間接顯示內(nèi)源性MDMX位于細胞質(zhì)內(nèi)，而當MDM2共表達時則刺激MDMX向核內(nèi)聚集。同時，

這個作用不依賴于p53，但是需要MDMX與MDM2蛋白的RING結構域作用以及MDM2的核定位信號系統(tǒng)［6］。另有研究報道p53能夠不依賴于MDM2而將MDMX引入核內(nèi)。然而，需要注意的是MDMX引入核內(nèi)能夠發(fā)生在p53/MDM2缺乏的小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryo fibroblast，MEFs）的DNA損傷之后［23］。這表明MDMX細胞核內(nèi)定位機制不依賴于MDM2和p53［26］。重要的是，后來發(fā)現(xiàn)Chk2介導的MDMX S367磷酸化以及MDMX與14-3-3結合后，能夠暴露隱藏的核定位信號并誘導MDMX進入核內(nèi)，進而調(diào)控p53蛋白功能［27］。

Chen等［28］研究顯示，應用蛋白片段釋放實驗（proteolytic fragment release，PFR）解析MDMX分子內(nèi)結構的相互作用，實驗發(fā)現(xiàn)了MDMX分子內(nèi)部相互作用以及其自動抑制作用機制：MDMX通過分子自身結構折疊與展開，與p53蛋白相互結合，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)p53蛋白作用。在這個過程中，MDMX依靠p53結合域與p53蛋白的N端初始結合后，酸性結構域（Acidic Domain）與RING結構域二次作用于p53蛋白的核心結構域，從而抑制p53與DNA結合。也有作者在小鼠模型中點突變或者截去MDMX的RING結構域后，發(fā)現(xiàn)p53蛋白活性發(fā)生改變以及小鼠胚胎發(fā)生死亡［29-30］。綜上，MDMX對于p53蛋白的調(diào)控作用是一個多步驟相互作用、多因素相互影響的復雜過程。

2 CK1α協(xié)同MDMX對p53蛋白的調(diào)節(jié)機制

分子生物實驗顯示，MDMX通過與MDM2形成異聚體從而調(diào)節(jié)p53的降解［8-9］。動物實驗顯示，小鼠敲除MDMX后導致p53活性的增強［21］。然而，MDMX怎樣通抑制p53蛋白還沒有被明確闡述。MDMX純化后發(fā)現(xiàn)CK1α和14-3-3是2個主要的結合蛋白。MDMX-14-3-3相互作用首先通過MDMX 367位點的磷酸化，而后MDMX核輸入后的泛素化作用所激活。另一重要結合蛋白CK1α則與MDMX中間結構域相結合，包括酸性結構域和鋅指結構。其中，RING鋅指結構是位于MDMX相對保守的序列區(qū)域，也是MDMXMDM2形成異二聚體以及MDMX與CK1α相互作用的主要結構。而CK1α發(fā)揮作用是需要在MDMX進一步磷酸化的基礎上來實現(xiàn)的［31］。

MDMX磷酸化直接作用于p53活性及MDMX降解。DNA損傷之后的MDMX有效降解取決于Chk2的S342、S367以及ATM的S403三個位點的磷酸化。進一步講，Chk2介導的MDMX上的S367位點磷酸化，對于刺激14-3-3的結合、MDMX細胞核移入及MDM2的降解有重要作用。另一些研究顯示紫外線損傷導致了Chk-1介導的367位點磷酸化［20，27］。MDMX磷酸化減弱了去泛素化酶（deubiquitylat?ing enzyme，DUB）HAUSP/USP7的親和力，而DUB對于MDM2、MDMX以及p53蛋白水平調(diào)節(jié)具有重要作用［32］。MDMX基礎磷酸化發(fā)生在CDK2激酶和CK1α的絲氨酸96和289兩個位點。絲氨酸96位點磷酸化為了調(diào)控MDM2在細胞內(nèi)的位置，而CK1α介導的磷酸化則影響MDMX-p53之間的作用。MDMX的絲氨酸289位點被證實是CK1α的主要磷酸化位點。筆者發(fā)現(xiàn)CK1α被藥物抑制或者敲除后，或者與DNA損傷藥物合用時，會導致p53的激活。因而，內(nèi)源性CK1α對于p53的調(diào)節(jié)很重要［33］。CK1α富含絲/蘇氨酸激酶并調(diào)節(jié)多種細胞路徑，比如Wnt/β-catenin通路。有研究顯示小鼠模型腸道內(nèi)特異性敲除CK1α后，導致Wnt通路中β-catenin的表達穩(wěn)定以及體內(nèi)p53和p21表達水平的增加，最終導致細胞增殖［33］。

有研究結果表明CK1α能夠通過干擾MDMX分子內(nèi)部之間作用而增強MDMX與p53之間的親和力［34］。在這個相互作用的過程中，CK1α不僅協(xié)同促進MDMX的N端結合到p53蛋白上，而且增強MDMX的酸性結構域與p53核心結構域的結合，從而調(diào)節(jié)p53蛋白功能。在MDMX與p53蛋白的發(fā)生二次結合作用的過程中，MDMX酸性結構域（AD結構域）對于p53正向或者反向的作用，取決于其分子伴侶CK1α是否存在。在CK1α缺乏的情況下，MDMX的AD結構域能夠模仿p53自動抑制結構域，封閉了p53的自身抑制功能。反之，如果CK1α存在情況下，MDMX的AD結構域不再封閉p53的N端，而是進一步與p53蛋白的核心結構域形成二次結合，從而抑制p53的DNA結合功能。這種機制是需要DNA損傷信號的緊密調(diào)節(jié)。先前研究顯示DNA損傷過程中Chk2介導的MDMX的367位點磷酸化，干擾了MDMXCK1α之間的相互作用。這個過程抑制了MDMX-p53復合物的結合，隱藏了MDMX與p53蛋白結合位點，減弱了其對p53蛋白的抑制調(diào)節(jié)功能［35］。因此，DNA損傷過程通過抑制MDM2介導的泛素化穩(wěn)定了p53蛋白功能，而且通過中和MDMX的抑制作用，增加了p53與目的DNA的結合［35］。

總之，MDMX的自身調(diào)控以及CK1α的協(xié)同調(diào)節(jié)過程是p53抑癌蛋白分子調(diào)控的主要機制。而對這種調(diào)節(jié)機制的進一步研究為以后MDMX抑制性藥物的發(fā)現(xiàn)提供了新的思路。

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（2015-06-12收稿 2015-06-30修回）

（本文編輯 閆娟）

Research progress of regulation mechanism of MDMX and CK1α in p53 tumor suppressor protein

WEI Xi1，ZHANG Sheng1，GAO Ming2△
1 Department of Diagnostic and Therapeutic Ultrasonography，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2 Thyroid Cancer Department△

As a tumor suppressor，p53 is activated by numerous cellular and environmental signals，and plays a critical

tumor suppressor protein p53；casein kinase 1 alpha；p53；murine double minute 4

R730

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.031

，2012，586（10）:1390-1396.

10.1016/j.febslet.2012.02.049.

國家自然科學基金青年項目（81401412）

1天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院超聲診療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室（郵編300060），2甲狀腺頸部腫瘤科

魏璽（1982），男，醫(yī)學博士，主要從事超聲分子診斷及分子生物學的研究

△通訊作者E-mail：gaoming68@aliyun.com

role in the cell cycle regulation，cell apoptosis and senenscence.The murine double minute（MDM）2 and double minute mu?rine 4（MDMX）are two important regulators.MDMX is a p53 binding protein with strong sequence homology to MDM2，but lacks ubiquitin ligase activity，and which is unable to target p53 for proteasomal degradation.MDMX regulates p53 activity through its binding with p53 and its postranscriptional modification.MDMX in the closed and open structure binds to p53 to regulate its activity.As the main partner of MDMX，casein kinase 1 alpha（CK1α）disrupts the intramolecular binding in MD?MX in the cooperation to regulate p53 activity.The process of MDMX and CK1α in the regulation of p53 is multi-step and complicated.In this paper the mechanism of MDMX and CK1α in the regulation of p53 protein was reviewed.