饒朝龍，彭成

烏頭堿對(duì)bcl-2基因表達(dá)影響作用的定量研究

饒朝龍，彭成

目的：研究烏頭類中藥對(duì)bcl-2基因表達(dá)的影響，探討烏頭類中藥毒性作用機(jī)制。方法：建立熒光定量PCR反應(yīng)體系；體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別以500，100，50和10 μg．mL-1濃度的烏頭堿作用于細(xì)胞，37℃染毒1.5 h，熒光定量PCR儀檢測(cè)。結(jié)果：烏頭堿作用下，bcl-2基因表達(dá)量增加，且不同劑量組呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：烏頭類中藥具有促進(jìn)bcl-2基因表達(dá)的作用，可能是其毒效作用的重要因素。

烏頭堿；bcl-2基因；毒性；定量

烏頭類(Aconite)中藥具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、溫經(jīng)止痛等功效?，F(xiàn)代藥理研究也證實(shí)其具有強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，在臨床上應(yīng)用廣泛。而其又乃有毒之品，臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究均表明其具有神經(jīng)和心臟等毒性。以烏頭堿（Aconitine，AC）為代表的雙酯型二萜生物堿是烏頭類中藥的主要活性成分，具有顯著的生理活性；但其同時(shí)也是引起毒性作用的主要成分。本課題組前期應(yīng)用彗星試驗(yàn)研究表明，烏頭堿對(duì)細(xì)胞DNA具有損傷作用，提示其具有遺傳毒性作用[1]。大量文獻(xiàn)報(bào)道提示烏頭堿與細(xì)胞凋亡有關(guān)，而bcl-2基因被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中最重要的調(diào)控基因之一。基于凋亡發(fā)生過(guò)程及其機(jī)制的復(fù)雜性，本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量分析在烏頭堿作用下bcl-2蛋白表達(dá)的變化情況，以進(jìn)一步明確其作用模式和結(jié)局通路[2]，探討烏頭類中藥的毒性作用機(jī)制和特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝腫瘤細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞，由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 受試藥品和試劑 烏頭堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.00%，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；TRIZOL試劑，invitrogen公司；iScriptTM cDNA Synthesis Kit，BIO-RAD公司。

1.1.3 主要儀器 Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 以改良的Dubico培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。收獲進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105～5×105個(gè)/mL，接種于24孔板，1 mL/孔。

1.2.2 RNA提取及質(zhì)量分析 提取細(xì)胞總RNA。其完整性分析用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察；GE NanoVue超微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度分析。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR，以所得總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物，反應(yīng)體系如表1。先將Oligo(dT)18和RNA混勻，用DEPC水將體積補(bǔ)充至6 μL，在PCR儀上70℃，變性10 min取出冰浴2 min后短暫離心，在冰上加入提前配制好的其余混合物。混合均勻后再次放入PCR儀42℃反應(yīng)1 h，70℃反應(yīng)10 min，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)NCBI公布的基因全長(zhǎng)分別設(shè)計(jì)bcl-2F/ bcl-2R作為熒光定量PCR引物，bcl-2 F：ATCGCCCTGTGGATGACTGA；bcl-2 R：CCAGGAGAAATCAAACAG

AGGC；選取actin作為內(nèi)參基因，引物為ActF和ActR，ActF：TCCACGAAA

C T A C C T T C A A C T C C；A c t R：ATGGTGGTGCCGCCAGACA。

利用RNA提取試劑盒從目的材料中提取高質(zhì)量的Total RNA，所得RNA使用BIO-RAD公司的iScriptTM cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在PCR儀上25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min，所得cDNA用Nuclease-free water 稀釋10倍，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量PCR 所用試劑盒為BIO-RAD 公司的SsoFastTM EvaGreen ?Superemix，具體體系如表2所示，反應(yīng)程序?yàn)?95℃變性2 min后，進(jìn)入95℃ 10 s，60℃1 min的45個(gè)循環(huán)，最后從65℃到95℃進(jìn)行溶解曲線分析，去除引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增。每個(gè)樣品均重復(fù)三次以避免加樣誤差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用iQ5-Cycler進(jìn)行分析，分析方法為ΔΔCt法。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.2.5 烏頭堿處理細(xì)胞 待接種細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入烏頭堿，使受試物染毒終濃度分別為500 μg．mL-1，100 μg．mL-1，50 μg．mL-1和10 μg．mL-1，置37℃孵箱染毒1.5 h。

1.2.6 烏頭堿處理后bcl-2基因表達(dá)水平檢測(cè) 提取Total RNA，反轉(zhuǎn)錄后按上述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA的質(zhì)量分析

圖中RNA條帶清晰，亮度高，無(wú)彌散帶，提取的RNA質(zhì)量好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 細(xì)胞Total RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)體系的建立

引物的擴(kuò)增曲線（Ct值在15～30之間）、溶解曲線（為單一主峰）以及標(biāo)準(zhǔn)曲線（相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99）均符合實(shí)驗(yàn)要求，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 引物擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

A、B分別為bcl-2和actin基因定量引物的擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 不同劑量烏頭堿作用下bcl-2基因的表達(dá)分析

與陰性對(duì)照組相比，烏頭堿作用組細(xì)胞的bcl-2蛋白表達(dá)量增加（p＜0.05），且不同劑量組呈現(xiàn)出劑量-反應(yīng)關(guān)系。

圖3 不同劑量烏頭堿作用下bcl-2蛋白的表達(dá)量

3 討論

bcl-2基因?qū)儆赽cl-2基因家族，是一種重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，在多種類型細(xì)胞凋亡的調(diào)控方面起著重要作用[3]。基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，bcl-2基因處于凋亡調(diào)控的終末部分，其表達(dá)的Bcl-2蛋白可能阻止DNA損傷后激活凋亡機(jī)制的信號(hào)到達(dá)其靶位，中斷凋亡感應(yīng)子和效應(yīng)子階段的聯(lián)系，因而B(niǎo)cl-2蛋白的過(guò)表達(dá)會(huì)打破細(xì)胞的自穩(wěn)平衡機(jī)制，產(chǎn)生凋亡抑制作用，從而使得受損或突變細(xì)胞不能得到及時(shí)的清除和修復(fù)[4]。

烏頭堿是烏頭類中藥的代表性毒性成分和有效成分之一，其毒性研究對(duì)于探討烏頭類中藥的毒效相關(guān)性具有重要意義。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)可以較好地反映凋亡相關(guān)因子表達(dá)的變化[5]，本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)表明，烏頭堿可以使bcl-2基因的表達(dá)量增加，且不同劑量組呈現(xiàn)出明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，與本課題組前期采用流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果一致。流行病學(xué)理論認(rèn)為劑量-反應(yīng)關(guān)系的存在對(duì)于因果聯(lián)系的推斷具有積極意義。本結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)烏頭類藥物具有促進(jìn)bcl-2基因表達(dá)的作用，細(xì)胞凋亡的抑制作用增強(qiáng)，從而使得損傷無(wú)法通過(guò)凋亡的主動(dòng)途徑被修復(fù)并得以固定下來(lái)，從而產(chǎn)生細(xì)胞形態(tài)和功能的進(jìn)一步損傷。此外，本課題組還研究了烏頭類生物堿對(duì)ras基因、p53基因等凋亡相關(guān)基因的作用。上述研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步明確烏頭類中藥的毒效作用模式和結(jié)局通路。

由于人肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞具有和人類相似的代謝能力，可作為化學(xué)物短期體外遺傳學(xué)評(píng)價(jià)常規(guī)試驗(yàn)的指示細(xì)胞，因而，歐盟等機(jī)構(gòu)均認(rèn)為，在體外試驗(yàn)中使用HepG2細(xì)胞可以得到模擬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其結(jié)果用于評(píng)價(jià)DNA損傷作用時(shí)更具實(shí)際意義。目前已在體外試驗(yàn)研究中得到了廣泛的應(yīng)用[6]。

[1] 饒朝龍,彭成.應(yīng)用彗星試驗(yàn)檢測(cè)烏頭類生物堿致細(xì)胞DNA損傷作用[J].中藥與臨床,2010,1(2):36.

[2] 周宗燦.毒作用模式和有害結(jié)局通路[J].毒理學(xué)雜志,2014, 28(1):1.

[3] 王曉輝,朱玉真.硫酸鎳誘導(dǎo)小鼠卵巢細(xì)胞P53、P16、Bcl-2蛋白表達(dá)的研究[J].毒理學(xué)雜志,2008,22(5):377.

[4] Thompson CB.Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment of Disease[J].Science,1995, 267(12):1456.

[5] 孫云峰,王浩,蔣寧,等.消癰潰得康對(duì)胃潰瘍模型大鼠生長(zhǎng)因子和凋亡相關(guān)因子的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19 (5):186.

[6] 單蕾,范雪梅,王義明,等.中藥復(fù)方四味肝泰對(duì)荷瘤小鼠和HepG2肝癌細(xì)胞的影響[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012,14(2):1428.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

Quantitative study on the effect of aconitine on the expression of bcl-2 gene

RAO Chao-long, PENG Cheng // (School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To study the effect of aconitic alkaloid on the expression of bcl-2 gene, and explore the mechanism of toxicity.Method:The reaction system of Q-RT-PCR was established. HepG2 cell was cultivated in vitro, then treated with aconitine (500，100，50 and 10 μg．mL-1) respectively for 1. 5 h at 37℃. And then the cell was determined with Q-RT-PCR.Result:After treated by aconitine, the amount of expression of bcl-2 gene was increased significantly. And its dose-response relationship was observed.Conclusion:Aconitic alkaloid plays an important role in promoting bcl-2 gene expression which may be the mechanism of aconitic toxicity.

Aconitine; bcl-2 gene; toxicity; quantifcation

R 285.5

A

1674-926X(2015)04-005-03

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2012CB723502）；四川省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2012JYZ006）；四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（12ZA044）；四川省科技廳“中藥藥理四川省青年基金科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)”（2014TD0007）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

饒朝龍，男，教授，主要從事中藥毒理學(xué)研究Email：raochaolong@sina.com.cn

彭成，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥毒理學(xué)研究 Email：pengchengchengdu@126.com

2015-02-15