李晨晨，王旻，張娟

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

抗體與小分子藥物一體化的完美“聯(lián)姻”
——解析抗體-藥物偶聯(lián)物之定點(diǎn)偶聯(lián)

李晨晨，王旻，張娟*

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

基于單抗的靶向療法已成為各種癌癥的重要治療手段，抗體與小分子藥物一體化的聯(lián)姻——抗體—藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugates，ADC）新藥獲得了突破性進(jìn)展。傳統(tǒng)ADC是將藥物與抗體的賴氨酸殘基或鏈間二硫鍵還原而產(chǎn)生的半胱氨酸殘基相偶聯(lián)而形成，其穩(wěn)定性差，易發(fā)生聚集，且其中藥物易脫落而產(chǎn)生非治療性毒副作用。而應(yīng)用近年發(fā)展起來的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)所獲ADC，除均一性好外，還保留了母體單抗的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，毒副作用也遠(yuǎn)低于具有相同偶聯(lián)比的傳統(tǒng)ADC，極有可能發(fā)展成為新一代重磅藥物。綜述4種ADC定點(diǎn)偶聯(lián)方法。

抗體—藥物偶聯(lián)物；定點(diǎn)偶聯(lián)；反應(yīng)性半胱氨酸；非天然氨基酸；酶法；二硫鍵改造

抗體藥物以高特異性、高穩(wěn)定性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)成為現(xiàn)代生物藥物發(fā)展的中流砥柱，幾乎每一株抗體都被寄予希望成為“重磅藥物”（blockbuster drug）而誕生。在抗腫瘤治療中，抗體藥物也已成為標(biāo)準(zhǔn)療法，但其單獨(dú)使用的療效常常不盡如人意[1-3]。近年來，抗體與小分子藥物的一體化聯(lián)姻——抗體-藥物偶聯(lián)物（antibodydrug conjugates，ADC）新藥獲得了突破性進(jìn)展，極有可能成長為抗體腫瘤療法中新一代重磅藥物。

ADC藥物是將細(xì)胞毒性藥物通過小分子連接臂（linker）連接至單抗，依靠單抗的獨(dú)特定位作用，使藥物結(jié)合并殺死癌細(xì)胞，彌補(bǔ)了細(xì)胞毒性藥物副作用偏大和單抗療效偏弱等缺陷[1-5]。表1展示了已上市及在研的部分ADC藥物信息。

傳統(tǒng)的ADC是將藥物偶聯(lián)在抗體的賴氨酸（Lys）殘基或是鏈間二硫鍵還原而產(chǎn)生的半胱氨酸（Cys）殘基上。由于一個(gè)抗體大約含有40個(gè)Lys，通過Lys偶聯(lián)而形成的ADC，其藥物-抗體的偶聯(lián)比(drug-to-antibody ratios, DAR）為0～8，但通過打開的鏈間二硫鍵偶聯(lián)，則會(huì)破壞抗體的完整性[1-5]。因此，由經(jīng)典方法產(chǎn)生的ADC是一個(gè)混合物，且不穩(wěn)定。近年來，有研究者運(yùn)用基因工程技術(shù)將抗體進(jìn)行改造，從而實(shí)現(xiàn)抗體與藥物的定點(diǎn)偶聯(lián)，由此所得ADC不僅具有十分均一的DAR，而且還表現(xiàn)出極好的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，大大提高了治療效果[6]。本文綜述抗體與藥物的4種定點(diǎn)偶聯(lián)方法：引入反應(yīng)性Cys或非天然氨基酸、酶法及對二硫鍵進(jìn)行改

造，并對這些定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)進(jìn)行分析，期望對ADC藥物 的研究和開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

表1 已上市及處于臨床研究階段的部分ADC藥物Table1 Some ADCs launched or in clininal trials

1 引入反應(yīng)性半胱氨酸實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)

研究發(fā)現(xiàn)，將抗體分子中某一氨基酸殘基突變成Cys，再利用其與藥物進(jìn)行特異性偶聯(lián)而合成ADC，這樣便可消除鏈間二硫鍵破壞所造成的影響。然而，如果突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)不恰當(dāng)，將會(huì)形成錯(cuò)誤的鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵[7-8]。Junutula等[7]研究開發(fā)了PHESELECTOR (Phage ELISA for Selection of Reactive Thiols) 技術(shù)（見圖1），即首先選出一些完全或部分暴露于抗體表面的氨基酸[如纈氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）等] 殘基，將其突變?yōu)镃ys；再利用噬菌體展示技術(shù)，將該Fab片段突變體展現(xiàn)于噬菌體表面，與馬來酰亞胺-PEO-生物素反應(yīng)；然后，經(jīng)ELISA方法篩選得到既保持抗原結(jié)合能力又能通過引入的Cys殘基與生物素(Biotin)成功偶聯(lián)（能結(jié)合鏈霉親和素）的突變體。同時(shí)，該研究團(tuán)隊(duì)以曲妥珠單抗（trastuzumab）的Fab片段為基礎(chǔ)，篩選出位于重鏈（HC）或輕鏈（LC）上符合上述條件的3個(gè)突變位點(diǎn)：HC-A114、HC-A175和LC-V110，并應(yīng)用此技術(shù)獲得含有反應(yīng)性Cys的IgG突變體THIOMAB，其與藥物的偶聯(lián)產(chǎn)物稱為TDC（THIOMAB-drug conjugates）。

圖1 PHESELECTOR 技術(shù)示意圖Figure 1 Schematic representation of PHESELECTOR

隨后，Junutula研究團(tuán)隊(duì)利用THIOMAB平臺(tái)，將曲妥珠單抗中HC-A114位點(diǎn)突變?yōu)镃ys，并通過含有BMPEO的連接臂偶聯(lián)DM1，成功構(gòu)建了TDC，即thiotrastuzumab-mepo-DM1（thio-TDM1）。LC/MS分析顯示，thio-TDM1的平均DAR為1.8，其中DAR為2的偶聯(lián)物占比達(dá)90%。且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，盡管thio-TDM1中偶聯(lián)的DM1數(shù)量較已上市的Kadcyla?（TDM1）要少（330vs560 μg·mm-2），對于過表達(dá)Her2的SK-BR-3細(xì)胞，這兩種偶聯(lián)物表現(xiàn)出相似的細(xì)胞表面抗原結(jié)合能力和細(xì)胞毒性；在Fo5小鼠乳腺癌模型（乳腺癌上皮細(xì)胞過表達(dá)人Her2）中，兩種偶聯(lián)物在相同的給藥劑量（10 mg·kg-1）下，可產(chǎn)生相似的療效；用于大鼠和獼猴時(shí)，在相同的給藥劑量（47 mg·kg-1）下，thio-TDM1產(chǎn)生的毒性遠(yuǎn)小于TDM1[9]。此外，將抗MUC16抗體中HC-A114位點(diǎn)突變?yōu)镃ys后，與MMAE偶聯(lián)，所產(chǎn)生的TDC也有類似優(yōu)點(diǎn)[10]。而在抗CD33抗體中引入反應(yīng)性Cys后，與DNA交聯(lián)劑吡咯苯二氮 二聚體偶聯(lián)，形成的TDC（SGN-CD33A）平均DAR為1.9，其中DAR為2的偶聯(lián)物占比達(dá)95%，該TDC藥物現(xiàn)已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)[11-12]。

Shen等[13]在曲妥珠單抗上選取了3個(gè)突變位點(diǎn)：HC-A114、LC-V205和Fc-S396，用于考察不同偶聯(lián)位點(diǎn)對TDC穩(wěn)定性的影響。這3個(gè)位點(diǎn)的區(qū)別在于溶劑可及性和周圍電荷環(huán)境的不同：Fc-S396位于最易觸及的部位，而HC-A114和LC-V205位點(diǎn)則呈部分暴露；LCV205位點(diǎn)周圍呈正電荷環(huán)境，而HC-A114和Fc-S396則處于相對中性的環(huán)境。當(dāng)將MMAE分別與含有上述不同突變位點(diǎn)的THIOMAB偶聯(lián)時(shí)，所得3種TDC具有相似的DAR（1.7～1.9）。體外活性實(shí)驗(yàn)表明，這3種TDC的抗原結(jié)合能力、SK-BR-3細(xì)胞（過表達(dá)Her2）內(nèi)化程度和細(xì)胞毒性均無差異，但是它們的血漿穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期以及體內(nèi)活性卻相差極大，其中，偶聯(lián)于LCV205位點(diǎn)的TDC穩(wěn)定性最好，血漿中37 ℃孵育96 h后未見降解。

與常規(guī)ADC相比，通過PHESELECTOR技術(shù)獲得的相應(yīng)TDC雖然表現(xiàn)出更好的治療效應(yīng)，但也存在缺陷：展示在噬菌體表面的Fab片段無需經(jīng)任何處理即可與馬來酰亞胺反應(yīng)，而全長抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，引入的Cys可以和培養(yǎng)基中谷胱甘肽等含巰基的物質(zhì)形成二硫鍵，所以還需將其還原成游離的形式才能進(jìn)行偶聯(lián)，但與此同時(shí)，抗體的鏈間二硫鍵也會(huì)被打開，這又需再次氧化以恢復(fù)成完整的抗體；而且，在THIOMAB形成的整個(gè)過程中，這個(gè)額外引入的巰基也有可能在抗體的2個(gè)Fab間錯(cuò)誤地形成二硫鍵[9-12]。

2 引入非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)

有研究者利用遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)，合成一個(gè)可以識(shí)別終止密碼子的tRNA，并設(shè)計(jì)能催化非天然氨基酸連接在該tRNA上的氨酰tRNA合成酶，構(gòu)成氨酰tRNA合成酶/tRNA正交對；然后，將抗體的DNA序列中某一氨基酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，再協(xié)同這一正交對，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外合成含有非天然氨基酸的抗體[14]。由于引入的非天然氨基酸含有一些特殊官能團(tuán)，如疊氮基、酮基、炔基等，致使藥物與抗體能更輕易地實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵在于，獲得嚴(yán)格正交的分子對，利用其高反應(yīng)特異性將非天然氨基酸定點(diǎn)引入抗體分子中。

2.1 細(xì)胞內(nèi)翻譯引入非天然氨基酸

Axup等[15]以曲妥珠單抗的Fab片段為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了3個(gè)突變體，每個(gè)突變體分別在HC或LC的不同位點(diǎn)（HC-A121、LC-S202和LC-K169）引入一個(gè)琥珀突變密碼子（UAG），并與對乙酰苯丙氨酸（pAcF，1）氨酰tRNA合成酶/tRNA正交分子對在大腸桿菌中共表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)位置含有pAcF的Fab片段突變體；同時(shí)，將正交分子對的DNA序列整合在CHO-K1細(xì)胞的基因組中，表達(dá)出含有琥珀突變位點(diǎn)（HC-A121）的IgG全長抗體。ESI-MS分析顯示，表達(dá)出的3個(gè)Fab片段和1個(gè)全長IgG在突變位點(diǎn)處插入了pAcF，且抗體分子產(chǎn)量均與未引入突變的母體單抗相當(dāng)。全長抗體突變體上的酮基通過與含有羥胺基團(tuán)的連接臂形成肟鍵，從而將MMAF偶聯(lián)至pAcF位點(diǎn)，得到偶聯(lián)率達(dá)95%、DAR為2的ADC。實(shí)驗(yàn)顯示，在荷有Her2過表達(dá)的MADMB-435細(xì)胞（乳腺下種植105個(gè)細(xì)胞）的C.B-17/SCID小鼠模型中，單劑量給予該ADC（5 mg·kg-1），即可在2周內(nèi)清除腫瘤，且該ADC在小鼠體內(nèi)的清除率與母體單抗相當(dāng)[（0.31±0.03）vs（0.3±0.11）mL·h-1·kg-1]。

圖2 SPAAC 反應(yīng)Figure 2 SPAAC reaction

變形促進(jìn)的疊氮-辛炔環(huán)加成反應(yīng)（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）是環(huán)八炔基和疊氮基團(tuán)間的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)，可形成三氮唑并環(huán)八烷基偶聯(lián)物（見圖2）[16]。該反應(yīng)無需銅（Ⅰ）的催化，具有高效、條件溫和等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種生物偶聯(lián)反應(yīng)。Xiao等[17]在曲妥珠單抗的HC-A121和LC-110位點(diǎn)分別引入琥珀突變密碼子（UAG）和赭石突變密碼子（UAA），并與2個(gè)正交分子對(pAcF氨酰tRNA合成酶/tRNA和N-t-2-疊氮乙氧羰基-L-賴氨酸（AzK，2）氨酰tRNA合成酶/tRNA共同轉(zhuǎn)入Freestyle293-F細(xì)胞中，生成在相應(yīng)位點(diǎn)處分別含有2個(gè)非天然氨基酸的曲妥珠單抗突變體——trastuzumabpAcF/AzK。其中引入的非天然氨基酸pAcF和AzK分別含有乙?；鶊F(tuán)和疊氮基團(tuán)，它們可分別與linker-MMAF（含有羥胺基團(tuán)）和DIBO-AF488（含有炔基）通過肟鍵和SPAAC反應(yīng)相連接，形成抗體-藥物/熒光素雙偶聯(lián)物（trastuzumab-MMAF/DIBO）。LC/MS分析表明，這2個(gè)修飾物的成功偶聯(lián)率達(dá)90%。且在過表達(dá)Her2的SK-BR-3細(xì)胞表面抗原結(jié)合以及內(nèi)化實(shí)驗(yàn)中，雙偶聯(lián)產(chǎn)物trastuzumab-MMAF/DIBO完全保持了母體單抗的活性。

上述偶聯(lián)方法雖可在抗體的特定部位引入能參與偶聯(lián)反應(yīng)的特殊官能團(tuán)，但實(shí)現(xiàn)起來同樣面臨缺陷：由于氨酰tRNA合成酶/tRNA對往往不是嚴(yán)格正交，故可能會(huì)在突變位點(diǎn)引入結(jié)構(gòu)相似的其他天然氨基酸，或使翻譯提前終止；而且，含有非天然氨基酸的氨酰tRNA也能干擾內(nèi)源性終止密碼子，造成細(xì)胞自身蛋白的錯(cuò)誤翻譯；此外，這些非天然氨基酸本身多數(shù)具有細(xì)胞毒性。為此，一些研究者開始探索利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)來引入非天然氨基酸。

2.2 細(xì)胞外翻譯引入非天然氨基酸

無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是指利用細(xì)胞抽提物中的蛋白質(zhì)合成元件、并添加底物和能量所構(gòu)成的以mRNA為模板的體外翻譯系統(tǒng)。對疊氮基甲基-L-苯丙氨酸（pAMF，3）是在苯丙氨酸（Phe）基礎(chǔ)上引入一個(gè)疊氮基團(tuán)而形成的非天然氨基酸，其可高效地進(jìn)行SPAAC反應(yīng)，但多項(xiàng)研究顯示，不能有效構(gòu)建pAMF氨酰tRNA合成酶/tRNApAMF正交對。Zimmerman等[18]先是利用體外翻譯系統(tǒng)作為一個(gè)高通量篩選平臺(tái)，從1 760個(gè)克隆中篩選出一株高保真性的pAMF氨酰tRNA合成酶B03；隨后，在曲妥珠單抗的HC-S136位點(diǎn)引入琥珀突變密碼子（UAG），并利用篩選出的B03酶、tRNA以及具適合比例的氧化型谷胱甘肽（GSSG）/還原型谷胱甘肽（GSH），在大腸桿菌抽提物中對該抗體突變體進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果，由此得到的抗體中，可見pAMF特異性的插入突變位點(diǎn)，而未見有其他類似結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸[如Phe、酪氨酸(Tyr)等]插入，同時(shí)也未出現(xiàn)翻譯提前終止的截短體。而且，該抗體突變體中的pAMF基團(tuán)能與含有DBCO的MMAF-linker通過SPACC反應(yīng)連接，偶聯(lián)形成的ADC純度大于90%。

目前，利用大腸桿菌抽提物進(jìn)行體外翻譯的研究已較為成熟。研究表明，原核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)不能對抗體進(jìn)行糖基化修飾，而且表達(dá)的產(chǎn)物中帶有內(nèi)毒素；相比之下，真核來源的體外翻譯系統(tǒng)則更適合進(jìn)行抗體大分子的表達(dá)，且真核細(xì)胞裂解物中含有源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒小囊泡，其中富含能輔助蛋白質(zhì)正確折疊、促進(jìn)二硫鍵形成的多種分子伴侶以及參與糖基化修飾的酶類[18-20]。Stech等[20]嘗試?yán)美ハx細(xì)胞裂解物合成了含有非天然氨基酸的scFv抗體片段，并成功將其用于與藥物的偶聯(lián)，但偶聯(lián)產(chǎn)物中仍保留有N端信號(hào)肽序列。由此看來，真核體外翻譯系統(tǒng)雖有利于抗體的非天然氨基酸修飾，但此體外翻譯平臺(tái)尚有待進(jìn)一步的開發(fā)和完善。

3 通過酶法實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)

此方法是指，通過基因工程技術(shù)，人為地致使抗體中產(chǎn)生能被某些酶所識(shí)別的相關(guān)氨基酸序列，再利用酶對底物的特異性，將其中的特定氨基酸殘基進(jìn)行改造修飾，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)[21]。

3.1 利用甲酰甘氨酸生成酶

甲酰甘氨酸生成酶（formylglycine-generating enzyme，F(xiàn)GE）可以識(shí)別一個(gè)五肽序列CXPXR[C、P、R分別為Cys、脯氨酸（Pro）和精氨酸（Arg），X為Ser、Ala、蘇氨酸（Thr）或甘氨酸（Gly）]，并將其中的Cys氧化成甲酰甘氨酸（fGly）[22]，而產(chǎn)生的甲?；鶊F(tuán)可以通過HIPS反應(yīng)與藥物形成穩(wěn)定的C- C鍵，將藥物偶聯(lián)在抗體上（見圖3）。 Drake等[23]通過該途徑，在曲妥珠單抗的C端引入LCTPSR序列，并于整合有FGE基因的CHO細(xì)胞中表達(dá)，得到的抗體在相應(yīng)位點(diǎn)含有fGly基團(tuán)。隨后，該研究團(tuán)隊(duì)通過引入不同的氨基酸[谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）和磷酸Tyr]對連接臂進(jìn)行修飾，并與DM1偶聯(lián)，產(chǎn)生不同ADC（4a、4b、4c、4d），考察不同連接臂對偶聯(lián)產(chǎn)物的影響[24]。結(jié)果顯示，ADC產(chǎn)物的偶聯(lián)率達(dá)90%，平均DAR為1.6，單體率為95%，其中，ADC 4d的血漿穩(wěn)定性最好，在人血漿(37 ℃)中1周和2周的降解率分別為3%和17%；通過這些極為相似的連接臂偶聯(lián)所得ADC其體內(nèi)外活性卻存在很大差異，在NCI-N87荷瘤鼠模型中， ADC 4b對大體積瘤體（瘤體積大于400 mm3）的抑制活性顯著高于ADC 4a，且其起效也快。

圖3 通過FGE和HIPS反應(yīng)進(jìn)行的藥物與抗體上氨基酸共價(jià)連接Figure 3 Covalent binding of drug and the amino acid in antibody through FGE and HIPS reaction

3.2 利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶

谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（transglutaminase，TG）可以識(shí)別LLQGA五肽序列[L、Q、G、A分別為亮氨酸（Leu）、谷氨酰胺（Gln）、Gly和Ala]，并能催化其中Gln的γ-酰胺基團(tuán)與含有伯胺的化合物形成異肽鏈（見圖4）。

圖4 TG催化的伯胺與Gln上γ-酰胺基團(tuán)共價(jià)連接Figure 4 Covalent binding of primary amine and the γ-carbonylamid group in Gln by TG catalysis

Farias等[25]將抗M1S1抗體中HC和LC的C端分別插入LLQGA和GGLLQGA（G、L、Q、A分別為Leu、Gln、Gly和Ala）序列，并基于TG的催化作用與MMAD偶聯(lián)，得到的ADC其平均DAR分別為1.9和1.8，單體率分別為99%和98.5%。結(jié)合LC-MS/MS分析產(chǎn)生的高分辨率肽段圖譜和系統(tǒng)性片段化分析技術(shù)的考察，發(fā)現(xiàn)上述所得ADC中約有1.3%的抗體在HC-Q295殘基處形成了額外的偶聯(lián)位點(diǎn)，原因可能是TG對底物的要求并不嚴(yán)格而將去糖基化的抗體上HC-Q295位點(diǎn)視作其底物所致，而正常抗體由于HC-N297位點(diǎn)會(huì)發(fā)生糖基化修飾而阻礙TG對附近HC-Q295位點(diǎn)的識(shí)別。于是，該研究小組將抗體上HC-Q295位點(diǎn)突變?yōu)镠C-N295，并再次對其偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明這一脫靶偶聯(lián)效應(yīng)消失。

對于TG介導(dǎo)的催化反應(yīng)，由于疏水性的藥物是溶解在有機(jī)溶劑中的，且其空間位阻較大，這些都不利于TG的催化；相比之下，水溶性小分子銜接物則能實(shí)現(xiàn)高效連接。鑒于此，Dennler等[26]利用N-糖酰胺酶F（PNGaseF）將曲妥珠單抗去糖基化后暴露出HC-Q295位點(diǎn)，然后利用含有2個(gè)官能團(tuán)的小分子銜接物（一端為伯胺基團(tuán)，另一端為疊氮基團(tuán)），在TG的催化下，先在抗體的此位點(diǎn)引入化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)，再將含環(huán)八炔基藥物-linker（DOBC-PEG4-vc-PAB-MMAE）通過SPAAC反應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián)（見圖5），由此經(jīng)酶-化學(xué)法兩步形成的ADC其偶聯(lián)效率得以提高，僅用1.25倍劑量的藥物，即可達(dá)到100%（DRA為2.0）的偶聯(lián)率，且均一性極好。

圖5 酶-化學(xué)法兩步定點(diǎn)偶聯(lián)形成ADCFigure 5 Formation of ADC through two-step site-specific conjugation by chemo-enzymatic approach

最近，Lhospice等[27]將抗CD30抗體cAC10（Adcetris?的母體單抗）上N297位點(diǎn)突變?yōu)镼297，這樣的抗體自然不會(huì)發(fā)生糖基化，但卻會(huì)在HC上形成2個(gè)TG催化位點(diǎn)（Q295和Q297），因此，通過該法改造后的一個(gè)抗體能偶聯(lián)4個(gè)藥物分子。動(dòng)物體內(nèi)放射性同位素實(shí)驗(yàn)顯示，與Adcetris?相比，由改造后抗體形成的ADC在腫瘤部位有較高的攝取率[即注射后24 h每克腫瘤組織的放射性同位素含量：（17.84±2.2）%vs（10.5±1.8）%]，而對正常組織的毒性更低。且動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明，其在單劑量為0.3 mg·kg-1時(shí)的藥效略高于Adcetris?。

經(jīng)TG催化處理后，去糖基化抗體上HC-Q295殘基即可作為ADC偶聯(lián)位點(diǎn)。然而，由于缺少糖基化修飾的抗體不能執(zhí)行Fc段功能，且不能與FcRn受體結(jié)合，因此其抗體功能會(huì)削弱且體內(nèi)循環(huán)半衰期也會(huì)縮短[28]。但對于ADC來說，由于糖基側(cè)鏈可與內(nèi)皮細(xì)胞以及腎臟細(xì)胞表面的受體結(jié)合，故攜帶至相應(yīng)部位的毒性藥物會(huì)造成非特異性損傷。為此，抗體部分的糖基化修飾對形成的ADC的影響仍有待于進(jìn)一步研究。

4 通過二硫鍵改造實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)

當(dāng)抗體的鏈間二硫鍵被打開后，還原的Cys可以通過和雙反應(yīng)性試劑反應(yīng)，將兩條鏈重新連接起來，即以這個(gè)雙反應(yīng)性試劑替換傳統(tǒng)的鏈間二硫鍵。據(jù)此，利用連接有藥物的雙反應(yīng)性試劑，可將藥物定位于抗體的二硫鍵位點(diǎn)，形成ADC（見圖6）。而且，雙反應(yīng)性試劑的分子質(zhì)量小，不足以影響抗體分子的空間結(jié)構(gòu)。下面分別介紹2種雙反應(yīng)性試劑在對抗體鏈間二硫鍵進(jìn)行改造而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)并形成ADC中的應(yīng)用。

圖6 通過二硫鍵改造定點(diǎn)偶聯(lián)形成ADCFigure 6 Formation of ADC through site-specific conjugation by disulfide re-bridge approach

4.1 利用新一代馬來酰亞胺試劑

通過親電基團(tuán)取代馬來酰亞胺的3、4位，形成新一代馬來酰亞胺試劑（next generation maleimide，NGM），其可構(gòu)成藥物-linker（5），并作為雙反應(yīng)性試劑，能與親核性的Cys反應(yīng)，從而將2條具有Cys的抗體單鏈橋連起來，并致使所攜藥物與抗體偶聯(lián)，形成ADC[29-30]。Schumacher等[31]利用此方法，將DOX與曲妥珠單抗偶聯(lián)，結(jié)果，CE-SDS分析顯示，所得ADC的產(chǎn)率為52% ～ 69%，完整抗體的比例占74%；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，以硒酚為還原劑時(shí)，可特異性地將DOX偶聯(lián)在Fab片段的二硫鍵上，且不改變兩條HC間的二硫鍵，從而得到DAR為2的ADC，這樣的偶聯(lián)方式可以將疏水藥物在空間上分開，增加ADC的穩(wěn)定性。

4.2 利用雙烷基化試劑

利用雙烷基化試劑構(gòu)建的藥物-linker（6）中對甲基苯磺?；呛芎玫碾x去基團(tuán)，可發(fā)揮雙反應(yīng)性試劑作用，其在反應(yīng)過程中，能生成含有雙鍵的中間體，并與2個(gè)Cys發(fā)生加成反應(yīng)，形成三碳橋而橋連抗體的2條單鏈，最終偶聯(lián)得到ADC（見圖7）。Badescu等[32]利用該方法，將MMAE通過一個(gè)含24個(gè)PEG單位的分子鏈分別偶聯(lián)在曲妥珠單抗的Fab片段和全長抗體上，結(jié)果，實(shí)驗(yàn)顯示，MMAE與Fab片段的偶聯(lián)產(chǎn)物，純度高（95%以上），且無沉淀產(chǎn)生；MMAE與全長抗體偶聯(lián)得到的ADC平均DAR為2.3，其中DAR為4的偶聯(lián)產(chǎn)物占比達(dá)78%。與NGM橋聯(lián)法相比，該法的最大優(yōu)勢在于能獲得穩(wěn)定性很好的ADC，其所得ADC于37 ℃血清中孵育5 d后未見降解，而在相同條件下，NGM偶聯(lián)相同藥物所獲ADC的降解率卻可達(dá)50%。

利用雙反應(yīng)性試劑進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，不需在DNA水平上對抗體進(jìn)行改造，且偶聯(lián)產(chǎn)物的DAR均一性很好。更重要的是，經(jīng)ELISA檢測表明，上述2種雙反應(yīng)性試劑偶聯(lián)方法所獲ADC均完全保留了與抗原的結(jié)合能力，提示，改造后的二硫鍵未對抗體的空間結(jié)構(gòu)造成影響。

圖7 利用雙烷基化試劑將藥物定位于二硫鍵處Figure 7 Conjugation of a drug to a disulfide bridge using bis-alkylating reagent

5 結(jié)語

傳統(tǒng)方法制得的ADC，其批次間差異較大，很難制定一個(gè)對其進(jìn)行藥物分析以及體內(nèi)外活性考察的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；此外，小分子藥物具有強(qiáng)疏水性，偶聯(lián)較多數(shù)量藥物（DAR為4以上）的ADC極易發(fā)生聚沉，穩(wěn)定性降低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，相比于傳統(tǒng)ADC，定點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)生的ADC其藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)極好，大大降低了由于藥物脫落而導(dǎo)致的非治療性毒副作用，因而其有更寬的治療窗。表2總結(jié)了本篇綜述所介紹的4種ADC定點(diǎn)偶聯(lián)方法的各自特點(diǎn)，它們雖然各自都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，但較之傳統(tǒng)的非定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)均有其不可比擬的優(yōu)勢，定點(diǎn)偶聯(lián)將成為ADC未來發(fā)展的必然趨勢。

今后對ADC定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)的研究，還可進(jìn)一步探討連接臂、偶聯(lián)位點(diǎn)以及偶聯(lián)藥物對ADC的影響。

表2 4種ADC定點(diǎn)偶聯(lián)方法的特點(diǎn)Table2 Characteristics of 4 site-specific conjugation methods for ADC

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[專家介紹] 張娟：博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。1997年畢業(yè)于中國藥科大學(xué)，2009年獲中國藥科大學(xué)微生物與生化藥學(xué)博士學(xué)位。2007年，赴英國帝國理工學(xué)院博士聯(lián)合培養(yǎng)；2013-2014年，作為公派學(xué)者赴美國加州大學(xué)洛杉磯分校(UCLA)醫(yī)學(xué)院Morrison教授實(shí)驗(yàn)室從事抗骨髓瘤抗體研究工作；中國生化藥物雜志編委；入選江蘇省“青藍(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人、江蘇省第四期“333工程”第三層次培養(yǎng)對象、中國藥學(xué)會(huì)青年生物藥物科學(xué)家。

張娟副教授主要從事新型抗腫瘤抗體研究和開發(fā)工作，基于噬菌體展示抗體文庫、雜交瘤及抗體人源化技術(shù)獲得多株單克隆抗體，并進(jìn)行創(chuàng)新型雙靶點(diǎn)抗體、抗體融合蛋白及抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的研究和開發(fā)，近5年主持及主要負(fù)責(zé)5項(xiàng)省部級(jí)抗體研究項(xiàng)目，授權(quán)抗體專利3項(xiàng)，公開抗體專利5項(xiàng)，發(fā)表SCI及中文核心論文40余篇。

Perfect Coupling of Antibodies with Small Molecule Drugs: Site-specifc Conjugation for Antibody-Drug Conjugates

LI Chenchen, WANG Min, ZHANG Juan
(School of Life Science & Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Antibody based targeted therapy has become more and more popular in anti-cancer therapy.Coupling of antibodies with small molecule drugs——antibody-drug conjugate(ADC) which is a new class of therapeutics has got a breakthrough.Conventional conjugation methods are based on lysine and cysteine residues and the ADCs yielded by these methods have poor stability.They are prone to aggregation and the conjugated drugs are easy to shed resulting in non-therapeutic side effects.The ADCs produced by the site-specifc conjugation techniques developed recently have homogeneous drug-to-antibody ratios (DAR), similar pharmacokinetics with their parental antibodies and far less side effects than those of the conventional ADC with the same DAR.So the improved ADCs are expected to become a new generation of blockbuster drugs.Four site-specifc conjugation methods for ADCs were reviewed herein.

antibody-drug conjugate; site-specifc conjugation; reactive cysteine; unnatural amino acid; enzyme-based method; disulfde bond modifcation

R918

A

1001-5094（2015）04-0283-10

接受日期：2014-03-03

項(xiàng)目資助：國家自然科學(xué)基金（NO.81273425，81473125）；“青藍(lán)工程”江蘇省中青年學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)對象項(xiàng)目

*通訊作者：張娟， 副教授；

研究方向：抗體藥物的研究與開發(fā)；

Tel：025-83271483；E-mail：juancpu@126.com