閆洪亮(綜述)，吳維光(審校)

(武警后勤學院附屬醫(yī)院婦產科，天津 300162)

微RNAs介導上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡的研究進展

閆洪亮△(綜述)，吳維光※(審校)

(武警后勤學院附屬醫(yī)院婦產科，天津 300162)

摘要：上皮性卵巢癌為最常見的卵巢癌，其起病隱匿、發(fā)展迅速且極易出現(xiàn)盆腹腔播散和腹膜后淋巴結轉移，5年生存率極低?？故С驳蛲鍪墙閷掀ば月殉舶┑陌l(fā)生和發(fā)展、轉移、化療耐藥的關鍵因素。微RNAs(miRNAs)在細胞的增殖和分化等多個生物過程中發(fā)揮重要作用，并且是腫瘤表觀遺傳學中主要機制之一。上皮性卵巢癌組織中出現(xiàn)相關miRNAs的異常表達，與卵巢癌發(fā)生進展、侵襲轉移的關系密切。

關鍵詞：上皮性卵巢癌；失巢凋亡；微RNAs

卵巢癌病變隱匿不易早期發(fā)現(xiàn)且病情發(fā)展迅速，易出現(xiàn)盆腹腔播散和腹膜后淋巴結轉移，居女性生殖道惡性腫瘤死因的首位。其中上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，占60%～90%，病死率位居第1位[1]。多年來婦產科專家不斷改進外科手術技術，研究新的化療方案，但5年總生存率仍徘徊在30%～40%。腫瘤轉移和化療耐藥是卵巢癌治療的難題，抗失巢凋亡是腫瘤細胞發(fā)生遠處轉移的機制之一，因此研究腫瘤細胞抗失巢凋亡成為防治腫瘤轉移的最新策略。微RNAs(microRNAs,miRNAs)異常表達是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的表觀遺傳學中的主要機制之一，作為內源性調節(jié)因子在基因轉錄后水平發(fā)揮作用，介導卵巢癌的發(fā)生、進展；其可能在卵巢癌抗失巢凋亡機制中發(fā)揮調節(jié)作用?，F(xiàn)就miRNAs與抗失巢凋亡機制在卵巢癌中的研究進展予以綜述，進一步探求miRNAs在卵巢癌抗失巢凋亡中的作用及其可能機制。

1抗失巢凋亡與卵巢癌

失巢凋亡是指細胞與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)失去接觸而誘導的一種程序性死亡形式，可防止脫落細胞發(fā)生種植或生長于原發(fā)灶外組織器官[2]。非錨定依賴生長和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是抗失巢凋亡的兩大特征。細胞凋亡程序缺陷是卵巢癌細胞抗失巢凋亡的主要原因，其機制如下。

1.1外源性受體途徑Fas途徑也稱為“外源性途徑”。當細胞與ECM分離后，細胞微絲蛋白與微管蛋白結構發(fā)生變化，可能導致Fas受體的表達水平增加3倍，F(xiàn)as配體增加1.5倍；Fas與Fas配體相互結合后的Fas相關死亡結構域蛋白募集及其下游死亡信號胱天蛋白酶8的激活，形成死亡誘導信號復合體,通過激活下游級聯(lián)反應，導致細胞凋亡[3]。抑癌基因p53的失活可抑制卵巢癌細胞Fas受體的外化和膜運輸，拮抗了失巢凋亡效應。

1.2內源性途徑線粒體途徑也稱內源性途徑。Bcl-2家族是線粒體膜電位和通透性的重要調節(jié)因子，包括抗凋亡蛋白和原凋亡蛋白，抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL)存在于線粒體外膜，通過穩(wěn)定外膜通透性而抑制細胞凋亡；原凋亡蛋白(如Bax、Bcl-xs、Bak、Bad、Bid、Bik)以無活性形式存在于胞質，當細胞與基質脫離后，其移位到線粒體外膜，對抗抗凋亡蛋白對線粒體外膜通透性的維護作用，主要通過調控細胞色素C的釋放，激活胱天蛋白酶9，啟動凋亡蛋白酶級聯(lián)反應調節(jié)細胞凋亡。研究證實，卵巢癌細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL高表達，當癌細胞脫離ECM后，抗凋亡蛋白通過抑制線粒體凋亡通路，阻止細胞凋亡[4]。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophin factor,BDNF)/酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)信號轉導通路:細胞受到相關信號刺激后BDNF從細胞質釋放到胞外，與胞膜高親和力受體TrkB的胞外區(qū)結合，發(fā)生二聚體化或磷酸化，激活下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號轉導通路，進而抑制線粒體途徑，促使腫瘤細胞逃避失巢凋亡。體內外實驗均顯示，BDNF/TrkB在卵巢交界性和惡性腫瘤中顯著高表達，隨臨床分期增高表達水平增高。王小萼等[5]通過構建失巢環(huán)境，用特異性配體BDNF刺激TrkB,發(fā)現(xiàn)細胞增殖率增加，并呈濃度依賴性。Vanhecke等[6]發(fā)現(xiàn)，給裸鼠乳腺癌模型注射BDNF抗體可減少腫瘤細胞的增殖。

1.3細胞間連接異常細胞間連接是高度特化的膜結合復合體，使相鄰細胞彼此粘連、交流，ECM是細胞間連接的蛋白質網絡，存在于細胞之間，細胞結合其上形成間接粘連，整合素在細胞與ECM粘連作用中發(fā)揮重要調節(jié)作用。整合素不僅發(fā)揮黏附因子的作用，而且是細胞內外信息傳遞的重要參與者。由ECM向細胞內傳遞生存信號主要通過黏著斑激酶/酪氨酸激酶-PI3K/Akt途徑，磷酸化的黏著斑激酶可直接激活PI3K分子，促進第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰基醇的生成，進一步激活Akt。Akt可間接抑制凋亡基因的表達，從而促進細胞存活[7]。當這一過程被阻斷，細胞由于缺乏生存信號的支持而啟動凋亡程序。黏蛋白CD24介導細胞與細胞、細胞與基質之間的黏附，在卵巢癌細胞失巢凋亡模型中CD24過表達并使發(fā)生細胞發(fā)生黏附，免于失巢凋亡[8]。卵巢癌細胞脫離外基質后，絲氨酸肽酶1表達缺失激活表皮生長因子受體/Akt生存途徑而賦予失巢細胞增殖和轉移的能力[9]。

1.4EMTEMT是指具有極性的上皮細胞轉換成具有移行能力的間質細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程[10]。通過改變細胞形態(tài)和減少細胞間黏附等機制促進腫瘤細胞轉移。上皮鈣黏蛋白是EMT的關鍵分子，表達水平與EMT的發(fā)生及腫瘤轉移能力呈負相關。在卵巢癌中TrkB過表達抑制鈣黏蛋白，激活EMT中的重要轉換因子Twist，亦可通過Twist-Snail信號途徑抗失巢凋亡[11]。CD157亦在上皮性卵巢癌中高表達，促進癌細胞EMT介導抗失巢凋亡過程[12]。

上皮性卵巢癌是女性生殖道常見惡性腫瘤，發(fā)病率位列第三，病情隱匿且發(fā)展迅速。目前首選治療手段是手術和以鉑類為主的化療，術后出現(xiàn)的轉移和化療過程中出現(xiàn)的耐藥與卵巢癌的預后密切相關。目前以抗失巢凋亡為切入點的研究已成為防止腫瘤細胞轉移和化療耐藥的新方向。

2miRNAs與抗失巢凋亡

miRNAs作為內源性因子在抗失巢凋亡過程中亦發(fā)揮調節(jié)作用，其可能為腫瘤生物治療開辟新的道路。miRNAs是18～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，這些小分子通過形成RNA誘導的沉默復合體靶向結合mRNA，在轉錄后水平發(fā)揮調節(jié)作用[13]。miRNAs不僅參與整個生命活動的進程，而且是腫瘤發(fā)生的表觀遺傳學機制中較常見的因素之一。

相關miRNAs異常表達在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNAs在腫瘤細胞中異常表達主要由以下原因引起[14]:①染色體局部區(qū)域增多,丟失或異位；②轉錄因子的異常表達和激活；③轉錄后的修飾；④miRNAs加工過程的改變。腫瘤細胞抗失巢凋亡時細胞增殖代謝均發(fā)生改變，稱為細胞凋亡缺陷，miRNAs在其中發(fā)揮著重要調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞脫離ECM后會上調miR-125b的表達，miR-125b可使胞外信號調節(jié)激酶磷酸化和p53基因過表達而保護間充質干細胞免于失巢凋亡[15]。miRNAs在肝臟腫瘤細胞抗失巢凋亡中也發(fā)揮重要作用，如miR-221在肝癌中表達缺失，其缺失可靶向上調BDNF表達，抑制細胞凋亡[16]。miR-200c經過靶向調節(jié)E盒結合鋅指蛋白(zinc finger E-box binding protein,ZEB)1和ZEB2，促進腫瘤細胞的EMT，從而賦予乳腺癌細胞抗失巢凋亡的能力[17]。研究發(fā)現(xiàn)，提高乳腺癌和子宮內膜癌中miR-200c的表達水平，可以增高腫瘤細胞的失巢凋亡敏感性[18]。研究顯示，miRNAs的異常表達與腫瘤發(fā)生進展相關，并在其中發(fā)揮著樞紐作用[19]。

抗失巢凋亡機制,即細胞凋亡程序的缺陷是腫瘤細胞惡性生物學行為的主要根源之一。miRNAs異常表達作為腫瘤表觀遺傳學機制之一，明確miRNAs在腫瘤細胞凋亡缺陷中的作用，對腫瘤的進一步診斷、基因治療有深遠意義。

3miRNAs與卵巢癌

腫瘤表觀遺傳學機制是指不依賴DNA序列變化的基因活性可遺傳性的改變[20]。miRNAs的表達受DNA甲基化和組蛋白修飾等調控，同時miRNAs也可通過調節(jié)DNA甲基化水平或改變組蛋白修飾等參與表觀遺傳調控網絡。研究證實,miRNAs與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其靶基因可以是抑癌基因，定位于擴增區(qū)，使其表達上調，發(fā)揮抑癌基因樣作用，亦可以是癌基因。miRNAs編碼基因多位于腫瘤相關基因位點和脆性染色體區(qū)域。在卵巢癌發(fā)病機制的研究中，最近發(fā)現(xiàn)miRNAs在卵巢癌浸潤與侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，通過對89例卵巢癌組織標本進行miRNAs差異性表達篩查發(fā)現(xiàn),較正常卵巢組織，卵巢癌組織中miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141顯著高表達，而miR-199a、miR-140、miR-145、miR-125b1出現(xiàn)表達缺失[21]。

3.1miRNAs與卵巢癌侵襲轉移腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落后大部分會啟動凋亡程序發(fā)生失巢凋亡，只有極少數的細胞能夠存活，浸潤周圍組織及脈管系統(tǒng)而發(fā)生侵襲和轉移。脫離ECM的癌細胞需逃避機體的免疫防御、承受機械性壓力和剪切力等才得以形成微小轉移灶。在此過程中細胞內的凋亡程序亦發(fā)生紊亂。研究顯示，miRNAs在卵巢癌的轉移中發(fā)揮重要作用。miR-200家族的編碼基因定位于染色體區(qū)域1p36.33(200b、200a和429)和12p13.31(200c和141)，在卵巢癌中亦出現(xiàn)這兩個區(qū)域經常出現(xiàn)點突變，甚至染色體缺失或易位。卵巢癌細胞中出現(xiàn)miR-200a表達缺失，其靶基因ZEB1/ZEB2表達水平增高進而抑制上皮鈣黏素表達，誘導卵巢癌細胞發(fā)生EMT，促進侵襲轉移；采用轉染技術上調miR-200a的表達后，發(fā)現(xiàn)EMT過程逆轉，抑制侵襲轉移[22]。miR-200c、miR-429除了直接靶向作用于ZEB1和ZEB2介導腫瘤細胞上皮-間質轉換外，還通過靶向調節(jié)TrkB等基因介導腫瘤細胞的失巢凋亡抵抗，從而賦予其轉移和侵襲的能力[23]。周星辰和邱麗華[24]在轉移能力不同的兩種卵巢癌細胞株中檢測miR-7的作用，發(fā)現(xiàn)miR-7可下調表皮生長因子受體的表達抑制細胞的增殖及侵襲轉移能力。用反義寡核苷酸抑制miR-21上調發(fā)現(xiàn)第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因表達上調，以及抗細胞凋亡基因Bcl-2低表達，最終誘導腫瘤細胞凋亡[25]。miR-101在卵巢癌中低表達，從而對EZH2基因抑制不足，導致已分化細胞產生有意義的漸變重編程，回歸到未分化狀態(tài)，即產生了癌變[26]。綜上可知，miRNAs可通過介導細胞間連接、EMT等抗失巢凋亡途徑介導卵巢癌轉移，不僅在卵巢癌發(fā)生的早期階段發(fā)揮重要調控作用，也與其預后密切相關。

3.2miRNAs與卵巢癌耐藥化療耐藥是制約卵巢癌5年生存率的重要因素，以鉑類為主的化療方案在化療初期可取得顯著療效，miRNAs的異常表達對卵巢癌的耐藥產生影響。有學者發(fā)現(xiàn)，卵巢漿液性癌耐藥組織中has-miR-210、has-miR-1307表達差異上調，has-miR-134表達差異下調[27]。對順鉑耐藥的卵巢癌細胞中miR-130a水平降低，而同時耐藥因子巨噬細胞集落刺激因子的表達明顯增高。miR-16可通過靶向下調上皮性卵巢癌細胞Bal-2蛋白，增強卵巢癌順鉑耐藥細胞對順鉑誘導凋亡的敏感性，發(fā)揮逆轉耐藥的作用[28]。

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中發(fā)生miR-204基因位點缺失的概率為44.63%，miR-204在平滑肌細胞鈣化和骨小梁細胞應激時內質網改變中發(fā)揮重要作用。Imam 等[29]用相關軟件預測人BDNF mRNA 3′非編碼區(qū)存在miR-204的作用靶點,并通過熒光素酶基因報告系統(tǒng)證實miR-204可直接作用于BDNF mRNA 3′非編碼區(qū)，抑制 BDNF mRNA及其蛋白表達，從而促使癌細胞失巢凋亡。在胃癌、乳腺癌、子宮內膜癌等研究中均發(fā)現(xiàn)miR-204亦具有抗轉移作用[30]。

4結語和展望

卵巢癌發(fā)病率逐年升高，癌細胞轉移和耐藥是目前急需攻克的兩個難題。失巢凋亡是防止卵巢癌細胞發(fā)生轉移的重要物理屏障，極少數癌細胞獲得了抗失巢凋亡能力，大大增加了卵巢癌惡性生物學行為。多年來，對腫瘤細胞抗失巢凋亡的認識逐漸完善，尤其是體外失巢凋亡模型的建立為體外研究腫瘤的轉移提供了技術支持。研究發(fā)現(xiàn)，從DNA到蛋白質及信號通路等多種途徑都介導著腫瘤失巢凋亡，抗失巢凋亡可能是腫瘤發(fā)生遠處轉移的主要機制之一，并為腫瘤侵襲和轉移研究提供了新視角。目前BDNF/TrkB通路已成為卵巢癌生物治療的靶點[31]。

隨著表觀遺傳學的提出和后基因組學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)miRNAs在腫瘤細胞抗失巢凋亡中的作用受到廣泛關注。卵巢癌中出現(xiàn)一系列miRNAs的異常表達，參與了卵巢癌發(fā)生轉移和耐藥等多個環(huán)節(jié)，并與預后相關。研究顯示， miR-204在卵巢癌中出現(xiàn)表達下調或缺失，但其在上皮性卵巢癌抗失巢凋亡中的作用和機制尚不明確[28]。從miRNAs角度探討卵巢癌的發(fā)病機制，進一步提高卵巢癌患者的生存率，仍任重而道遠。

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The Research Progress of MicroRNAs Mediated Epithelial Ovarian Cancer Cells Anoikis Resistance

YANHong-liang,WUWei-guang.

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitaloftheChinesePeople′sArmedForcesLogisticCollege,Tianjin300162,China)

Abstract:Epithelial ovarian cancer is the most common type of ovarian cancer,with insidious onset,rapid development and is easy to disseminate to pelvic peritoneal and retroperitoneal lymph node,and its 5-year survival rate is extremely low.Anoikis suppression is a key factor to mediate the development,metastasis,chemotherapy resistance of epithelial ovarian carcinoma.MicroRNAs(miRNAs) play an crucial role in cell proliferation and differentiation in multiple biological processes,and is also one of the main mechanisms of epigenetics.Abnormal expression of miRNAs has appeared in epithelial ovarian cancer,meanwhile there is a close relationship with the progression,invasion and metastasis of ovarian cancer.

Key words:Epithelial ovarian cancer; Anoikis; MicroRNAs

收稿日期：2014-04-15修回日期：2014-07-19編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.017

中圖分類號：R71

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)04-0618-03