杜　玥，趙　芳(綜述)，雷　紅(審校)

(武漢大學中南醫(yī)院心內科，武漢430071)

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PP1靶調節(jié)亞基的研究進展

杜玥△，趙芳(綜述)，雷紅※(審校)

(武漢大學中南醫(yī)院心內科，武漢430071)

摘要：蛋白磷酸酶1靶調節(jié)亞基(PNUTS)是主要位于細胞核內廣泛表達的蛋白質，其編碼基因位于染色體6P21.3,容易突變。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中PNUTS作為蛋白磷酸酶1(PP1)靶調節(jié)亞基，與PP1穩(wěn)定的結合，并調節(jié)其催化活性，在細胞有絲分裂不同時期與染色質共定位，通過調控多種靶分子參與細胞的增殖與凋亡。有關PNUTS的研究現(xiàn)已迅速成為生命科學領域研究的熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)PNUTS在細胞凋亡、腫瘤形成、衰老、心血管疾病發(fā)生發(fā)展等方面起著重要的作用。

關鍵詞：蛋白磷酸酶1靶調節(jié)亞基；蛋白磷酸酶1；細胞凋亡；腫瘤；衰老

Senescence

蛋白磷酸酶1靶調節(jié)亞基(protein phosphatase 1 nuclear-targeting subunit，PNUTS)也稱PPP1R10、CAT53、P99，是主要位于哺乳動物細胞核內廣泛表達的蛋白質[1]，其編碼基因位于染色體6p21.3，易突變，與遺傳性血色病有關[2]。含量最高的是睪丸、大腦與腸道[3]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1是細胞內主要的蛋白磷酸酶，它通過改變蛋白激酶的活性從而調節(jié)細胞分裂、肌肉收縮、基因表達、糖原代謝、神經(jīng)傳遞等生理過程[4-5]。最初發(fā)現(xiàn)PNUTS在哺乳動物細胞內作為蛋白磷酸酶1的靶向亞基與蛋白磷酸酶1α、蛋白磷酸酶1γ形成穩(wěn)定的復合物[6-8],進而調節(jié)蛋白磷酸酶1催化活性。PNUTS不僅在分子與細胞水平有著廣泛的研究及作用，近年來發(fā)現(xiàn)，其在器官與整體水平也參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)對PP1靶調節(jié)亞基的研究進展進行綜述。

1PNUTS結構

PNUTS結構中含有幾個有功能的區(qū)域[7,9-11]：含CX8CX5CX3H的鋅指結構，此結構同樣存在于應答基因Nup475/Tis11家族中，可能參與細胞增殖與凋亡調控；N端轉錄延長因子S-Ⅱ，參與轉錄啟動、RNApolⅡ延長。主要序列分析顯示PNUTS在其C端結構有富含組氨酸和甘氨酸的密集排列的RGG序列模體[12]，而此模體同樣存在于RNA結合蛋白中，通過RNA結合珠可將PNUTS-蛋白磷酸酶1復合物從哺乳動物細胞裂解物中分離出，且PNUTS與多聚A、G有較高結合力[13]，因此PNUTS可通過RGG序列模體與多聚A、G結合進而調節(jié)轉錄過程，以上結果表明，在哺乳動物細胞核中PNUTS在調節(jié)蛋白磷酸酶1與RNA相關復合物連接中起著重要作用。

2PNUTS的生物學功能及其機制

2.1PNUTS參與細胞缺氧應答調控多種細胞系中都可檢測到PNUTS的存在和編碼PNUTS的信使RNA，并且在缺氧環(huán)境下，它們的表達量顯著增多。許多病理條件都會導致缺氧的發(fā)生。Lee等[14]通過實驗發(fā)現(xiàn)，在缺氧或去鐵胺環(huán)境下，PNUTS在鼠腦內皮細胞和人胚腎293 細胞表達量較非缺氧對照組明顯上調，并且PNUTS的過表達增加了缺氧誘導的細胞死亡。啟動子分析證實，在編碼PNUTS基因的啟動區(qū)域有缺氧反應元件的存在，它在缺氧條件下表達缺氧誘導因子α。這表明編碼PNUTS的基因是一種新的缺氧誘導基因，它使細胞在缺氧環(huán)境下更易死亡。

既往研究已證實，缺氧能夠促進p53富集與活化[15]，p53在缺氧誘導的細胞死亡機制中占有主要作用[16]。最近發(fā)現(xiàn)PNUTS還能增強p53的核定位、磷酸化與轉錄活性，活化的p53通過轉錄激活一些靶基因,如bax、puma、Bnip3L等誘導細胞發(fā)生凋亡。另外，PNUTS的過表達能促進原癌基因鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)與p53分離，促進MDM2自動泛素化，誘導MDM2的降解[14]。MDM2是p53的E3連接酶，可以導致p53的泛素化修飾并被蛋白酶體降解。這些結果表明，在缺氧條件下，PNUTS可通過調節(jié)p53相關基因的表達來促進細胞死亡。

2.2PNUTS參與細胞周期與凋亡的調控在離體條件下，PNUTS依賴蛋白磷酸酶1增強染色體解聚。Landsverk等[17]通過免疫熒光試驗對海拉細胞周期觀察發(fā)現(xiàn)，PNUTS通過模體與蛋白磷酸酶1連接后，可作為蛋白磷酸酶1的靶向亞單位促進染色體解聚，模體基因突變或模體被蛋白激酶A磷酸化都會阻斷體外連接過程。這種作用說明，PNUTS作為蛋白磷酸酶1全酶的一部分參與細胞的有絲分裂，如染色體解聚、紡錘體形成。在分裂間期，PNUTS與蛋白磷酸酶1分離，與染色質緊密連接。在有絲分裂末期重組核膜后，PNUTS靶向作用于重組細胞核，構成一個信號事件，促進下一周期有絲分裂間期染色體分離，并且發(fā)現(xiàn)在G1、S、G2、M期都有PNUTS的合成。PNUTS促進染色體解聚需要蛋白磷酸酶1與一個有功能的模體，但是如果抑制蛋白磷酸酶1結合位點對其解聚并無影響，這說明，在細胞核重建過程中，PNUTS并不是作為一種抑制劑來抑制蛋白磷酸酶1活性。Lee等[14]通過誘導細胞株使蛋白磷酸酶1與缺陷PNUTS結合，或在HEK239細胞中用小干擾RNA耗竭PNUTS，將導致細胞周期停滯在有絲分裂結束，染色質變?yōu)楫惓＃罱K導致凋亡細胞死亡。然而，還沒有試驗證明在人體內生理環(huán)境下PNUTS是如何影響染色體動態(tài)，也沒有研究PNUTS在有絲分裂早期階段對染色體形態(tài)產生的影響。

另外，De Leon等[18]發(fā)現(xiàn)，PNUTS參與Retinoblastoma (Rb)依賴型細胞凋亡的調節(jié)。在乳腺癌、直腸癌、卵巢癌細胞敲除PNUTS會激活Rb磷酸酶,進而導致轉錄因子E2F1從Rb釋放出來，而E2F1能以非依賴p53形式激活胱天蛋白酶的活性[11，19-20]，進而促進細胞凋亡。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Hs578T乳腺癌細胞經(jīng)過阿糖胞苷治療后PNUTS從蛋白磷酸酶1酶丟失，Rb去磷酸化[21]。所以，通過PNUTS-Rb途徑也可以調節(jié)細胞凋亡，在促凋亡治療中，PNUTS可作為潛在的靶點。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)，在人睪丸胚胎癌細胞中，miR-383通過靶向損耗PNUTS，誘導細胞周期停滯，進而抑制組蛋白2A變異體磷酸化，由于組蛋白2A變異體除了在DNA損傷修復中發(fā)揮重要作用，也在VDJ重組、精子減數(shù)分裂和性小體失活過程中必不可少，所以，此研究說明PNUTS參與miR-383 介導的男性不育患者精子形成過程中的DNA損傷，通過調節(jié)PNUTS的表達降低DNA損傷反應，有可能治療男性不育癥。

2.3PNUTS參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展Kavela等[23]發(fā)現(xiàn)，PNUTS在食管鱗狀細胞癌和腺癌中表達較正常組織上調，且無論在腫瘤(食管癌、結腸癌、乳腺癌[24]、胰腺癌)還是正常組織中,PNUTS與第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)含量呈正相關。PTEN是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因,其產物PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶活性和脂質磷酸酶活性。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)通路為體內主要的生存信號通路，激活后可通過催化多種蛋白質磷酸化而促進腫瘤細胞生長,抑制凋亡[25]。研究表明，在細胞核內PTEN可通過其脂質磷酸酶活性使PI3K的下游靶分子磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸脫磷酸，從而阻斷PI3K/AKT信號通路來實現(xiàn)其抗腫瘤作用[26]。PTEN-PI3K/AKT信號轉導通路失衡后，一方面會促進腫瘤的發(fā)生與進展,另一方面還可參與腫瘤的免疫逃逸[27]。近年來發(fā)現(xiàn)，PNUTS通過靶向作用于PTEN的脂質結合域(C2區(qū)域)而將PTEN分離出細胞核，阻斷下傳功能，從而積極調節(jié)PI3K/AKT信號通路，發(fā)揮其促進腫瘤細胞發(fā)生與發(fā)展,調控內皮、血管生成等作用。以上機制表明，通過與PTEN作用，PNUTS扮演著潛在原癌基因的角色[23]。

2.4PNUTS參與衰老過程Kim等[28]全基因組目標分析實驗表明，PNUTS通過模體與端粒末端重復序列結合因子2(telomeric repeat binding factor,TRF2)結合降低端?？s短。TRF2是一種端粒結合蛋白，可以重塑端粒DNA的T環(huán)結構，保護3′末端單鏈G尾不被DNA外切酶、連接酶識別，進而維持端粒DNA結構穩(wěn)定、防止染色體端-端融合、參與細胞增殖、分化、凋亡及衰老過程。此外，它還可以作為一種樞紐蛋白，通過線性序列碼招募不同的信號分子來調節(jié)端粒[29-31]。TRF2與模體結合對維持端粒的穩(wěn)定起著重要的作用。

Landsverk等[32]發(fā)現(xiàn)，DNA損傷促進PNUTS移位到損傷處并在G2-M檢查點修復雙鏈DNA。在未受干擾細胞用小干擾RNA抑制PNUTS表達能激活G2期檢查點，而在電離輻射誘導的DNA損傷后延長G2期檢查點，激活細胞周期檢測點激酶1。Landsverk更進一步用增強綠色熒光蛋白標記PNUTS發(fā)現(xiàn)，DNA損傷后大量PNUTS迅速并短暫地集中于DNA損傷位點，抑制G2期阻滯。并且，電離輻射后，缺乏PNUTS的細胞克隆存活率下降。以上研究說明，PNUTS通過降低端粒縮短，減輕DNA損傷，從而延緩衰老。

2.5PNUTS參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展心肌是最容易發(fā)生缺血/再灌注損傷的組織，目前的觀念認為，心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生與細胞凋亡、白細胞作用以及自由基、鈣、pH等的反常有關[6]。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是由體內外因素觸發(fā)細胞內死亡程序而導致的細胞自主的有序的自然死亡過程。在心肌細胞凋亡過程中，PNUTS是其關鍵性元件，其異常表達可引起心肌細胞凋亡，并導致心肌衰老[33]。

Boon等[34]通過實驗發(fā)現(xiàn)，老齡實驗小鼠(18～20月齡)較幼齡鼠(6～8周)心肌細胞內PNUTS表達量高，且通過蛋白印跡方法證實了在小鼠心肌細胞中PNUTS的水平能被miR-34a下調。他們在熒光素酶基因序列下游接入PNUTS的3′-UTR 從而構建了一個新的可表達的報告基因。載入miR-34a后發(fā)現(xiàn)，熒光素酶的活性被抑制，但對3′-UTR內的miR-34a結合區(qū)域中有突變的報告基因無影響。相反，抑制miR-34a的表達將增強熒光素酶的活性，基于反轉錄酶法的實驗也證明，miR-34a與PNUTS的3′-UTR相結合。從而證明了PNUTS是miR-34a直接作用的靶點。

此研究進一步發(fā)現(xiàn)，用慢病毒導入鼠體內使之超表達PNUTS，此時心肌細胞內由H2O2誘導的凋亡顯著下降，由miR-34a介導的增強細胞凋亡的作用消除，說明PNUTS能抑制心肌細胞凋亡；實驗還發(fā)現(xiàn)，通過腺病毒介導基因轉染技術，使心肌組織中高表達PNUTS，結果顯著改善小鼠心肌梗死后心肌收縮力的下降[34]。

已發(fā)現(xiàn)，miR-34a在心臟中的水平是最高的，在人體及鼠心肌細胞內miR-34a的表達量與年齡呈正相關，通過抑制miR-34a的表達可以減少心肌細胞的凋亡。其中，更深入的動物實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠急性心肌梗死后miR-34a表達量明顯增加，對其行Antagomir-34a 治療2 周后，觀察到小鼠心臟的射血分數(shù)及心室壁運動相關參數(shù)均有改善。Zhao等[35]發(fā)現(xiàn)，高糖能誘導H9c2心肌細胞高表達miR-34a，并導致細胞凋亡。由于PNUTS是miR-34a直接作用的靶點，且通過PNUTS的降低端粒縮短，減輕DNA損傷反應作用抑制心肌細胞凋亡，因此可推測，PNUTS在糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，而且miR-34a-PNUTS可能是缺血性心臟病進程的一條通路。增強PNUTS的表達可在誘導梗死心肌的恢復、保護缺血事件后心臟功能的過程中發(fā)揮作用，將PNUTS的誘導措施引入缺血性心臟病的治療無疑是一個新亮點。

3展望

基礎和臨床研究均顯示,PNUTS在腫瘤、心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。雖然根據(jù)PNUTS的各種作用機制進行臨床治療在理論上是可行的，但目前的研究距臨床應用還有相當長的路要走。例如，PNUTS表達是否穩(wěn)定，其表達水平受何種因素干擾等還少見報道。相信隨著對PNUTS研究的不斷深入，其與心血管疾病、腫瘤，甚至與其他疾病的關系和具體機制將逐漸被闡釋，有望將PNUTS從分子生物水平工具轉化為臨床手段，進而為疾病的防治提供新的靶點。

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Research Progress of Phosphatase 1 Nuclear-Targeting SubunitDUYue,ZHAOFang,LEIHong. (DepartmentofCardiology，ZhongnanHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430071,China)

Abstract:Phosphatase 1 nuclear-targeting subunit (PNUTS) is a ubiquitously expressed protein and its coding gene is on chromosome 6P21.3,with easy mutation.Previous studies have found that PNUTS functions as a nuclear regulatory subunit of PP1,forms a stable complex with PP1 and regulates PP1 catalytic activity in mammalian cells.PNUTS os colocalized with chromatin at distinct phases during mitosis,involved in cell proliferation and apoptosis by regulating various target molecules.Research related to PNUTS is now a hotspot in the field of life science.Recent studies have found that PNUTS plays an important role in the development of apoptosis,tumorigenesis,senescence,cardiovascular diseases and other physiological contexts.

Key words:Protein phosphatase 1 nuclear-targeting subunit; Protein phosphatase 1; Apoptosis; Tumor;

收稿日期：2014-08-25修回日期：2014-11-24編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.012

中圖分類號：R54;R73

文獻標識碼:A

文章編號：1006-2084(2015)13-2335-03