班劍嬌, 馮 佳, 王志強(qiáng), 謝樹蓮

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006

理化因子對(duì)谷皮菱形藻細(xì)胞密度及中性脂含量的影響

班劍嬌, 馮 佳, 王志強(qiáng), 謝樹蓮*

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006

以高脂微藻谷皮菱形藻(NitzschiapaleaNY025)為實(shí)驗(yàn)材料，探討了利用光密度法和尼羅紅熒光染色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞中性脂含量的可行性，進(jìn)而研究了溫度、光強(qiáng)及培養(yǎng)基中N、P、Si含量對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和中性脂積累的影響。結(jié)果表明：(1)谷皮菱形藻在675nm處存在最大吸收峰，細(xì)胞密度與OD675之間存在良好的線性關(guān)系，利用光密度法和尼羅紅熒光染色法表征谷皮菱形藻生物量和中性脂含量操作簡(jiǎn)單，適用于高通量樣品的測(cè)定；(2)谷皮菱形藻在20℃，光強(qiáng)160 μmol m-2s-1時(shí)生長(zhǎng)最快，在20℃，光強(qiáng)200 μmol m-2s-1時(shí)，有利于中性脂積累；(3)培養(yǎng)基中N、P、Si濃度分別為80、120、100 mg/L時(shí)，有利于谷皮菱形藻細(xì)胞生長(zhǎng)，其中，N元素影響最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P與P×Si對(duì)藻株生長(zhǎng)作用均為顯著。培養(yǎng)基中N、P、Si濃度分別為80、120、50 mg/L時(shí)，利于中性脂積累，其中，N元素影響最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均為顯著；(4)可采用兩步培養(yǎng)法，先使谷皮菱形藻細(xì)胞大量增殖，而后適當(dāng)改變培養(yǎng)條件，以增加脂質(zhì)合成。

谷皮菱形藻; 理化因子; 細(xì)胞密度; 中性脂

隨著人類社會(huì)不斷發(fā)展，對(duì)能源的需求量越來越大，已導(dǎo)致石油等化石能源緊缺，能源危機(jī)問題突顯。尋求潔凈的可再生能源成為目前的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。生物柴油作為石油的替代品具有巨大的應(yīng)用潛力，已引起了廣泛關(guān)注[1- 3]。

利用微藻資源生產(chǎn)生物柴油具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，如光合效率高，生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)周期短，不需要占用大量耕地，而且細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通過生物技術(shù)手段易于改造，油脂組成符合生物柴油生產(chǎn)的要求等。因此，微藻也被認(rèn)為是最有潛力的生物柴油生產(chǎn)原料[4]。

目前，關(guān)于微藻的選育已有一些報(bào)道[5- 7]。谷皮菱形藻(Nitzschiapalea)隸屬于硅藻門(Bacillariophyta)，菱形藻科(Nitzschiaceae)，廣泛分布于江河湖海等各種水體中，為廣鹽性藻種[8]，是一種在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種類[9]。作者在前期研究中已發(fā)現(xiàn)該種具有生長(zhǎng)速度快、油脂產(chǎn)率高的特點(diǎn)，是一種較理想的高脂藻種[10]。

硅藻內(nèi)部的理化成分與其生長(zhǎng)的環(huán)境相關(guān)[11- 12]，溫度、光強(qiáng)、pH、培養(yǎng)基成分等的改變都會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)部脂質(zhì)含量與組成。利用各種培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)藻細(xì)胞內(nèi)部油脂含量的提升。本文以作者前期篩選的一株高脂谷皮菱形藻為研究對(duì)象，進(jìn)行了溫度、光強(qiáng)和培養(yǎng)基中N源、P源、Si源的用量對(duì)該藻生長(zhǎng)量及中性脂積累量的逐級(jí)優(yōu)化，以期為開發(fā)微藻生物柴油種質(zhì)資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)

谷皮菱形藻(NitzschiapaleaNY025)，分離自山西省汾河上游，為作者前期篩選到的具產(chǎn)油潛力藻株。將實(shí)驗(yàn)材料接種至D1培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)中，通過在D1培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的N源、P源、Si源對(duì)該藻株進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OD值與細(xì)胞密度線性關(guān)系的確立

開啟紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行聯(lián)機(jī)操作。取谷皮菱形藻藻液，以D1培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行最大吸收峰的波長(zhǎng)掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)為675nm。選取同一時(shí)期不同濃度的藻液，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，測(cè)定不同濃度藻液OD675值，以O(shè)D675為縱坐標(biāo)，細(xì)胞濃度為橫坐標(biāo)，生成相關(guān)性曲線，并建立細(xì)胞密度與OD675之間的回歸方程。

1.2.2 培養(yǎng)溫度的選擇

設(shè)置5個(gè)溫度梯度，即15，18，20，22，25℃，考察不同溫度對(duì)谷皮菱形藻生長(zhǎng)及中性脂積累的影響。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液，接種至含D1培養(yǎng)基的20 mL試管中，初始接種OD675= 0.07±0.01，置于不同溫度的微電腦光照培養(yǎng)箱(SPX- 250B-G型，上海博訊)中靜置培養(yǎng)，光強(qiáng)為120 μmol m-2s-1，光暗比12h∶12h，每日搖動(dòng)數(shù)次。每個(gè)測(cè)定設(shè)3個(gè)重復(fù)。

生長(zhǎng)量測(cè)定方法：自接種日起，取240μL藻液加入透明的96孔酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)藻液在OD675處的吸光值；中性脂含量測(cè)定方法[13- 14]：取240μL藻液加入黑色96孔酶標(biāo)板中，加入1μL尼羅紅染液，混勻后37℃黑暗孵育10min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)598nm激發(fā)光，543nm散發(fā)光處的熒光強(qiáng)度，扣除未接藻的培養(yǎng)基染色后的熒光強(qiáng)度。繪制谷皮菱形藻生長(zhǎng)及中性脂積累變化曲線，并通過比較相對(duì)吸光值及熒光值增長(zhǎng)量得到最佳培養(yǎng)溫度。之后在該溫度下，進(jìn)行下一步光照強(qiáng)度的優(yōu)化。

相對(duì)吸光值增長(zhǎng)量=(OD675 8-OD675 1)/7

式中,OD675 8為培養(yǎng)第8天時(shí)藻液吸光值，OD675 1為接種時(shí)藻液吸光值。

熒光值增長(zhǎng)量=(L8-L1)/7

式中,L8為培養(yǎng)第8天時(shí)藻液熒光值，L1為接種時(shí)藻液熒光值。

1.2.3 光照強(qiáng)度的選擇

設(shè)置3個(gè)光強(qiáng)梯度，120、160、200 μmol m-2s-1，考察不同光強(qiáng)對(duì)谷皮菱形藻生長(zhǎng)及中性脂積累的影響。取一定量的藻液，接種至含D1培養(yǎng)基的20 mL試管中，初始接種OD675=0.125±0.01，置于不同光強(qiáng)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為20℃，每個(gè)測(cè)定設(shè)3個(gè)重復(fù)。生長(zhǎng)量與中性脂含量變化測(cè)定方法同1.2.2。選用中性脂積累量最大時(shí)的光強(qiáng)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因子的水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 N、P、Si三因素正交實(shí)驗(yàn)

N源、P源、Si源分別選用NaNO3、K2HPO4與KH2PO4、Na2SiO3·9H2O。根據(jù)文獻(xiàn)[12- 13]并基于D1培養(yǎng)基配方，設(shè)計(jì)N、P、Si三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)(表1)。實(shí)驗(yàn)選用L27(313)正交設(shè)計(jì)表(表2)。配制27組添加不同含量N、P、Si的培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)期的藻液，離心并用各組培養(yǎng)基清洗兩次，再將離心收集的材料分別接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，每組設(shè)3個(gè)平行。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光強(qiáng)為200 μmol m-2s-1，溫度為20℃。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

測(cè)定藻株在不同培養(yǎng)條件下的吸光值與熒光值增長(zhǎng)量，繪制相應(yīng)曲線。吸光值增長(zhǎng)量=(OD675 10-OD675 1)，OD675 10為培養(yǎng)第10天時(shí)藻液吸光值，OD675 1為接種時(shí)藻液吸光值，熒光值增長(zhǎng)量=(L10-L1)，L8為培養(yǎng)第10天時(shí)藻液熒光值，L1為接種時(shí)藻液熒光值。參照相關(guān)文獻(xiàn)[15]對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，得出谷皮菱形藻生長(zhǎng)及中性脂積累的最優(yōu)N、P、Si水平組合。

2 研究結(jié)果

2.1 OD值與細(xì)胞密度的線性關(guān)系

谷皮菱形藻藻液的波長(zhǎng)掃描顯示(圖1)，在675nm處存在最大吸收峰。且在60s內(nèi)，谷皮菱形藻沉降不明顯(圖2)，短時(shí)間內(nèi)不影響吸光值的測(cè)定。谷皮菱形藻的細(xì)胞密度與光密度OD675之間，存在良好的線性關(guān)系(圖3)，相應(yīng)的回歸方程為OD675=0.10179C-0.00247，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.99782。因此可通過測(cè)定OD675來間接表示細(xì)胞密度，進(jìn)而表征藻株生長(zhǎng)狀況。

圖1 谷皮菱形藻的光譜掃描圖

圖2 OD675隨時(shí)間的變化曲線

圖3 吸光度與細(xì)胞密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同溫度下谷皮菱形藻生長(zhǎng)量及中性脂含量

圖4顯示了不同溫度下，谷皮菱形藻的生長(zhǎng)情況?？梢钥闯龉绕ち庑卧逶诟鱾€(gè)溫度條件下均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度有一定差異。5個(gè)溫度梯度下的吸光值增長(zhǎng)量，可以看出藻株的生長(zhǎng)量先上升后下降，在20℃時(shí)達(dá)到最大。

圖4顯示了不同溫度下，谷皮菱形藻的熒光值變化情況?？梢钥闯鰺晒庵岛孔兓淮蟆?個(gè)溫度梯度下的熒光值增長(zhǎng)量，結(jié)果顯示，藻株中性脂含量先升高后下降，在20℃下中性脂產(chǎn)量最大。

圖4 溫度對(duì)谷皮菱形藻生長(zhǎng)及中性脂含量的影響

2.3 不同光照強(qiáng)度下谷皮菱形藻生長(zhǎng)量及中性脂含量

圖5顯示了在120、160、200 μmol m-2s-1光強(qiáng)下，谷皮菱形藻的生長(zhǎng)情況?？梢钥闯龉绕ち庑卧逶诓煌鈴?qiáng)下的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似，生長(zhǎng)速度差異不大。3個(gè)光強(qiáng)梯度下的吸光值增長(zhǎng)量，可以看出藻株在160 μmol m-2s-1時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大。

圖5顯示了不同光強(qiáng)下，谷皮菱形藻的熒光值變化情況?？梢钥闯鰺晒庵岛侩S著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。3個(gè)光強(qiáng)梯度下的熒光值增加量，結(jié)果顯示，在200 μmol m-2s-1時(shí)中性脂產(chǎn)量最大。

圖5 光照強(qiáng)度對(duì)谷皮菱形藻生長(zhǎng)及中性脂含量的影響

2.4 培養(yǎng)基N、P、Si正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)可以看出，對(duì)于藻株吸光值增長(zhǎng)量來說，極差RN>RP>RSi，即N含量對(duì)藻株生長(zhǎng)影響最大，其次為P，最后是Si，對(duì)于T值來說，N2P1Si1最大，因此最佳組合為N2P1Si1，即N、P、Si濃度分別為80、120 、100 mg/L時(shí)，谷皮菱形藻生長(zhǎng)量最大。而對(duì)于藻株熒光值增長(zhǎng)量來說，極差值RN>RSi>RP，即N對(duì)中性脂積累影響最大，Si次之，P影響最小，根據(jù)t值可知，N2P1Si3最大，因此最佳組合為N2P1Si3，即當(dāng)培養(yǎng)基中N、P、Si濃度分別為80、120、50 mg/L時(shí)，谷皮菱形藻的中性脂積累最多。

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行了方差分析，N、P、Si對(duì)谷皮菱形藻生長(zhǎng)影響的方差分析如表3所示。由結(jié)果可知，F(xiàn)N、FP、FSi、FN×P、FP×Si均大于Fα，因此N、P、Si三因子以及交互作用下N×P與P×Si作用均為顯著，因子N×Si作用不顯著。各因素的最優(yōu)水平為N2P1Si1，此時(shí)谷皮菱形藻生長(zhǎng)量達(dá)到最大。表4中的結(jié)果顯示了N、P、Si對(duì)谷皮菱形藻中性脂產(chǎn)量影響的方差分析，F(xiàn)N、FSi、FN×P、FN×Si均大于Fα，因此因子N、Si及交互作用下N×P、N×Si的作用均為顯著，因子P與P×Si作用不顯著，N2P1Si3的均值最大，為最有利于中性脂積累的水平組合。

表3 正交實(shí)驗(yàn)對(duì)谷皮菱形藻生長(zhǎng)影響的方差分析Table 3 ANOVA of orthogonal experiment for effects of N, P, Si on the growth of Nitzschia palea

3 討論

谷皮菱形藻最大吸收峰的波長(zhǎng)為675nm，藻液細(xì)胞密度不同，其色素含量也不同，因而吸光值也有差異[16]。由研究結(jié)果可知，細(xì)胞密度與光密度OD675之間，存在良好的線性關(guān)系，因此利用光密度法代替細(xì)胞計(jì)數(shù)來表征谷皮菱形藻生物量是可行的，且該方法操作步驟簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，有利于高通量樣品的計(jì)數(shù)。本文使用尼羅紅熒光染色法來間接表示細(xì)胞中性脂的含量，無需對(duì)樣品進(jìn)行干燥、破碎，操作簡(jiǎn)單，尤其適用于高通量樣品的測(cè)定，需要注意的是操作應(yīng)在較暗環(huán)境下進(jìn)行，以防熒光淬滅。

表4 N、P、Si對(duì)谷皮菱形藻中性脂產(chǎn)量影響的方差分析Table 4 ANOVA of orthogonal experiment for effects of N, P, Si on neutral lipid accumulation of Nitzschia palea

培養(yǎng)溫度的變化對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)與脂質(zhì)積累都有較大的影響。本文研究結(jié)果顯示在溫度為20℃時(shí)，最有利于谷皮菱形藻生長(zhǎng)量與中性脂的積累，這與陳書秀等[17]的研究結(jié)果是一致的。Renaud[18]也報(bào)道過，在20℃時(shí)最適于小新月菱形藻Nitzschiaclosterium與鏟狀菱形藻N.paleacea的生長(zhǎng)與脂質(zhì)積累，這是由于溫度過高或過低都將影響藻細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性，溫度最適時(shí)，酶活性最高，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)與脂質(zhì)積累達(dá)到平衡。最佳生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累溫度是20℃，也提示我們，在進(jìn)行谷皮菱形藻大量培養(yǎng)時(shí)，不僅可以采用密閉式光反應(yīng)器培養(yǎng)，也有可能在合適的季節(jié)進(jìn)行室外開放式跑道池培養(yǎng)，以降低成本。

本文的研究結(jié)果顯示，在光強(qiáng)為160 μmol m-2s-1時(shí)最有利于谷皮菱形藻的生長(zhǎng)，而中性脂積累的最佳光強(qiáng)要高于此值。早在1974年Orcutt就發(fā)現(xiàn)，高光強(qiáng)能促進(jìn)Nitzschiacloserium細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成[19]，其他學(xué)者也有類似報(bào)道[20- 21]，可見適當(dāng)增加光強(qiáng)可以有效促進(jìn)中性脂的積累。有報(bào)道指出微藻中性脂大量積累一般發(fā)生于穩(wěn)定期[22]，即晚于細(xì)胞增殖最快的對(duì)數(shù)期，這也提示人們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中可以采用兩步培養(yǎng)法，先在光強(qiáng)160 μmol m-2s-1下培養(yǎng)，以使細(xì)胞大量增殖，而后再增加光強(qiáng)培養(yǎng)，以使中性脂得到大量合成。

正交實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果顯示，對(duì)于藻細(xì)胞生長(zhǎng)，N元素影響最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P與P×Si對(duì)藻株生長(zhǎng)作用均為顯著，因此在藻株培養(yǎng)過程中，三因子都應(yīng)該重點(diǎn)考慮。N、P、Si濃度分別為80、120、100mg/L時(shí)，生長(zhǎng)最好。對(duì)于中性脂積累，N影響最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均為顯著，因此基于中性脂積累的藻株培養(yǎng)中，N、Si應(yīng)優(yōu)先考慮。N、P、Si的含量分別為80、120、50 mg/L時(shí)，最利于藻細(xì)胞中性脂積累。N缺乏與Si缺乏在一定程度上可以增大中性脂的積累，可能是因?yàn)榈氐娜狈?dǎo)致蛋白質(zhì)合成的減少，從而使代謝途徑朝脂肪和碳水化合物方向發(fā)展，而Si的缺乏被認(rèn)為是促使某種合成脂質(zhì)的酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致脂質(zhì)含量增加[23]。這也再次提示我們，在采用兩步培養(yǎng)時(shí)，可以先以細(xì)胞增殖為目的，而后再降低Si濃度，以增加脂質(zhì)合成。

4 結(jié)論

(1)谷皮菱形藻在675nm時(shí)，細(xì)胞密度與光密度OD675之間，存在良好的線性關(guān)系，利用光密度法表征谷皮菱形藻生物量步驟簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，有利于高通量樣品的計(jì)數(shù)。采用尼羅紅熒光染色法間接表示細(xì)胞中性脂的含量，無需對(duì)樣品進(jìn)行干燥、破碎，操作簡(jiǎn)單，適用于高通量樣品的測(cè)定。

(2)谷皮菱形藻在20℃，光強(qiáng)160 μmol m-2s-1時(shí)生長(zhǎng)最快，在20℃，光強(qiáng)200 μmol m-2s-1時(shí)，最有利于脂質(zhì)積累。

(3)培養(yǎng)基中N、P、Si濃度分別為80、120、100 mg/L時(shí)，有利于谷皮菱形藻細(xì)胞生長(zhǎng)，其中，N元素影響最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P與P×Si對(duì)藻株生長(zhǎng)作用均為顯著。培養(yǎng)基中N、P、Si濃度分別為80、120、50 mg/L時(shí)，利于中性脂積累，其中，N元素影響最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均為顯著。

(4)可采用兩步培養(yǎng)法，先使谷皮菱形藻細(xì)胞大量增殖，而后適當(dāng)改變培養(yǎng)條件，以增加脂質(zhì)合成。

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Effects of physical and chemical factors on the growth and neutral lipid content ofNitzschiapalea

BAN Jianjiao, FENG Jia, WANG Zhiqiang, XIE Shulian*

SchoolofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

An algal strain,NitzschiapaleaNY025, was chosen as experimental materials for its high-lipid content. The feasibility of optical density method used for cell growth determination was investigated first. Then Nile red fluorescence was used for determining the relative neutral lipid contents because neutral lipid content was a key standard of choosing algae in biodiesel production. Furthermore, the effects of temperature, light intensity, nitrogen, phosphorus and silicon on the cell growth and neutral lipid contents ofN.paleawere investigated. The results showed that: (1) The maximum absorption ofN.paleaexisted at 675nm, and the absorption showed a good linear relationship with cell density. Therefore, the growth ofN.paleacould be obtained by measuring OD675. Optical density method and Nile red fluorescence possessed advantage of simple operation, so they were suitable for high-throughput sample analysis. (2) The optimum temperature was 20℃ for increasing the cell density and neutral lipid content ofN.palea. The finest light intensity for the growth ofN.paleawas 160 μmol m-2s-1, while the best light intensity for neutral lipid accumulation was 200 μmol m-2s-1. It is suggested that increasing light intensity appropriately might increase neutral lipid contents in algal cells. (3) Under the optimum temperature and light intensity, the orthogonal experiments of nitrogen, phosphorus and silicon were designed to research into their effects on the growth and neutral lipid contents ofN.palea. The influence of nitrogen on the growth ofN.paleawas the most significant, then the factor phosphorus and the last one was factor silicon. The growth ofN.paleawas influenced significantly by factors nitrogen, phosphorus, silicon and interaction factors nitrogen with phosphorus, nitrogen with silicon. The optimum growth rate was obtained when the content of nitrogen, phosphorus and silicon were 80 mg/L, 120 mg/L and 100 mg/L, respectively. The influence of factor nitrogen on neutral lipid accumulation was the most significant, next was factor silicon and the last one was factor phosphorus. Neutral lipids accumulation was influenced significantly by factors nitrogen, silicon and interaction factors nitrogen with phosphorus, nitrogen with silicon. The maximum neutral lipid accumulation was obtained when the concentration of nitrogen, phosphorus and silicon were 80 mg/L, 120 mg/L and 50 mg/L, respectively. (4) In conclusion, the lipid synthesis can be improved by two-step method. First the cell density ofN.Paleawas increased, and after gathering plenty of cells the culture conditions changed to increase neutral lipid contents.

Nitzschiapalea; physical and chemical factors; cells density; neutral lipid

2013- 06- 21;

2014- 05- 30

10.5846/stxb201306211754

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xiesl@sxu.edu.cn

班劍嬌, 馮佳, 王志強(qiáng), 謝樹蓮.理化因子對(duì)谷皮菱形藻細(xì)胞密度及中性脂含量的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(10):3349- 3356.

Ban J J, Feng J, Wang Z Q, Xie S L.Effects of physical and chemical factors on the growth and neutral lipid content ofNitzschiapalea.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3349- 3356.