胡擁軍, 王海娟, 王宏鑌, 楊曉燕, 李燕燕, 殷 飛

昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院, 昆明 650500

砷脅迫下不同砷富集能力植物內源生長素與抗氧化酶的關系

胡擁軍, 王海娟, 王宏鑌*, 楊曉燕, 李燕燕, 殷 飛

昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院, 昆明 650500

采用室內土培法，研究了砷脅迫(0，50，100和200 mg/kg)對鳳尾蕨屬中砷超富集植物大葉井口邊草(Pteriscreticavar.nervosa)和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)生物量、株高、葉片內源3-吲哚乙酸(IAA)含量、IAA氧化酶(IAAO)活性、砷含量、抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT)活性以及細胞膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)含量的影響，并用逐步回歸法分析了IAA 含量與砷含量、抗氧化酶活性、MDA含量之間的關系。此外，研究了100 mg/kg砷處理下IAA、IAAO、3種抗氧化酶和MDA的時間動態(tài)。結果表明，與對照(不加砷)相比，加砷處理下大葉井口邊草的株高和生物量未出現顯著變化，但劍葉鳳尾蕨在中、高濃度砷脅迫下則顯著降低；中、高濃度砷脅迫均使2種植物葉片含砷量、IAA含量顯著增加和IAAO活性顯著下降，但這種改變在大葉井口邊草中更為顯著；加砷處理使大葉井口邊草葉片3種抗氧化酶活性維持或增加，劍葉鳳尾蕨中SOD和CAT活性雖能維持，但POD活性則顯著下降，說明砷脅迫下大葉井口邊草具有更強的抗氧化能力。逐步回歸分析結果顯示，2種植物葉片IAA含量均與砷含量成顯著正相關，但在大葉井口邊草中，IAA含量還與CAT活性成顯著負相關。時間動態(tài)研究表明，第13天，大葉井口邊草具有最高的IAA含量、最低的IAAO活性以及最低的CAT活性，而劍葉鳳尾蕨中的變化規(guī)律則不明顯。因此，葉片保持較高的IAA含量、較低的IAAO和CAT活性有助于大葉井口邊草超量富集砷。

生長素; 3-吲哚乙酸(IAA); 砷; 抗氧化酶; 大葉井口邊草; 劍葉鳳尾蕨

自Ma等[1]、Chen等[2]發(fā)現鳳尾蕨屬植物蜈蚣草(Pterisvittata)能超富集砷以來，人們開始利用超富集植物去除土壤和水體中的砷，同時，圍繞蜈蚣草開展了很多該植物超富集砷的機理研究。目前國際公認的砷超富集植物有12種，其中11種為鳳尾蕨屬植物，另1種為裸子蕨科粉葉蕨屬植物[3]。因此，砷超富集植物主要來源于鳳尾蕨屬。但是，并非鳳尾蕨屬植物都能超富集砷，人們也發(fā)現了幾種不能超富集砷的鳳尾蕨屬植物，如Pterisstraminea、Pteristremula[4]、劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)[5]、半邊旗(Pterissemipinnata)[6]等。同屬中不同砷富集能力植物為比較生理學的研究提供了極好材料，國內外有很多研究者運用鳳尾蕨屬中不同砷富集能力植物作為供試材料，比較研究了兩類植物在砷吸收、轉運、耐性[7- 8]和根際特征[9]等方面的差異。

在理論上研究植物超富集砷機理、在實踐中注重提高植物砷富集量的同時，有一個不容忽視的問題是植物支撐其超富集砷的物質基礎研究。維持較好的生長狀況和高生物量是實現植物修復技術產業(yè)化的重要前提和基礎，而植物激素在其中起重要作用。植物激素在植物體內的含量雖然十分微量，但其在植物生長發(fā)育和逆境生理研究中卻占據著重要地位。長期以來，對脫落酸和乙烯的抗逆機理研究甚多，但近年來，生長素和細胞分裂素在植物抗逆研究中的作用和機理也備受關注。這兩類激素不同于其他植物激素的一個重要方面是：它們是植物存活所必需的。盡管其他植物激素可以作為調節(jié)植物某些特殊生長發(fā)育過程的開關，但是植物自始至終都需要一定量的生長素和細胞分裂素。在超富集植物中，這兩類激素的水平直接影響到植物的生長發(fā)育狀況和生物量。

在重金屬脅迫下，外源添加生長素對植物重金屬吸收和生理生化的影響，目前已有一些報道。Lpez等[10]通過添加100 μmol/L IAA(吲哚乙酸，indole- 3-acetic acid)+0.2 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸，ethylene diamine tetraacetic acid)，使非超富集植物紫花苜蓿(Medicagosativa)葉片對鉛的富集量增加了28倍；都瑞軍[11]對鋅/鎘超富集植物滇苦菜(PicrisdivaricataVant.)的研究表明，經100 μmol/L IAA 處理，其葉片鉛富集量上升了46.5%；Liu等[12]在200 μmol/L 的含鉛培養(yǎng)液中添加100 μmol/L IAA后，在鉛富集植物東南景天(Sedumalfredii)的2種生態(tài)型中，地上部鉛含量顯著增加，但對根富集Pb無顯著影響；對豆科植物Sesbaniadrummondii的研究表明，添加100 μmol/L IAA或100 μmol/L NAA(萘乙酸，1-naphthlcetic acid)后，植物地上部Pb富集量分別增加了654%和415%[13]。Piotrowska-Niczyporuk等[14]研究了外源添加的生長素、細胞分裂素、赤霉素、茉莉酮酸和多胺對鎘、銅、鉛單一脅迫下一種綠藻(Chlorellavulgaris)生長和新陳代謝的影響，發(fā)現除茉莉酮酸使重金屬吸收增加外，外源添加的幾種植物激素減緩了金屬離子的毒性。從已有的研究看，通過外源添加植物生長調節(jié)劑的研究偏多，比較超富集與非超富集植物內源生長素含量水平的研究尚少，目前尚缺少這兩類植物內源激素水平是否存在差異的報道。

本研究通過室內土培實驗，研究砷超富集植物大葉井口邊草(Pteriscreticavar.nervosa)和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)在不同濃度砷脅迫下葉片中吲哚乙酸(IAA)含量、IAA氧化酶(indole- 3-acetic acid oxidase, IAAO)和幾種抗氧化酶活性的變化，以及中等砷濃度(100 mg/kg)脅迫下IAA、IAAO和抗氧化系統(tǒng)的時間動態(tài)，結合逐步回歸法揭示砷脅迫下兩種植物葉片內源生長素(IAA)的含量與抗氧化酶活性的關系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：將昆明理工大學呈貢校區(qū)梨園土風干過5 mm篩，取1/2梨園土、1/4河沙、1/4腐殖土進行充分混勻，并加入N、P、K營養(yǎng)元素作基肥(N∶P2O5∶K2O=0.15∶0.10∶0.15 g/kg土，干重)。供試土壤的基本理化性質見表1。

表1 供試土壤的基本理化性質Table 1 Basic physio-chemical characteristics of soil used (n=3)

—: 未檢出; 表中數值以平均值±標準差表示

供試植物：砷超富集植物大葉井口邊草(P.creticavar.nervosa)和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)初生小苗分別采自昆明理工大學校園和云南省紅河州河口縣附近橡膠林中。帶回溫室后進行修剪并于清潔土壤中適應性培養(yǎng)2個月，選取長勢良好、大小一致的幼苗植株(8—9 cm高、帶7—8片小葉)進行盆栽試驗。

1.2 實驗設計

在供試土壤中進行加砷處理，分別添加0、50、100和200 mg/kg 4個濃度(以Na3AsO4·12H2O形式加入，砷濃度以純砷計)，平衡6周后裝盆(每盆1 kg)，每個處理重復3次。另外分別取6個大盆(每盆裝添加了100 mg/kg砷土壤20 kg)分為2組，分別種植2種植物，進行2種植物相關指標的時間動態(tài)測定(從第1天開始，每7d取1次樣，直到第49天)。2種植物培養(yǎng)49d后收獲，先用自來水清洗，再用1%鹽酸浸泡10 min以去除植物表面附著的砷，最后用自來水和蒸餾水反復沖洗，用濾紙吸干植物表面水分，裝入自封袋，放入冰箱在-18 ℃保存?zhèn)溆?。另取一部分植物于烘?05 ℃殺青30 min，在70 ℃下烘干至恒重，磨碎混勻，稱取0.2 g左右樣品，用HNO3-H2O2在130 ℃下加熱消化，經過濾、定容后測定植物砷含量。

1.3 測定方法

植物砷含量測定參照馬麗等[21]的原子熒光法(北京瑞利儀器有限公司，AF- 610D)；IAA氧化酶(IAAO)測定采用張志良[22]分光光度法；葉片內源IAA測定采用王若仲等[23]、Liu等[24]的方法并加以修改：采集2種植物葉片立即放入液氮中，稱取鮮樣2 g，用80%甲醇(10 mL/g FW, FW表示鮮重)研磨成勻漿(加入少量2,6-二叔丁基- 4-甲基苯酚，避免光照)、4 ℃下浸提過夜，經4 ℃下高速離心(10000 r/min、20 min)，殘渣用5 mL g-1次-180%甲醇洗提兩次，合并上清液，40 ℃減壓濃縮后經聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVPP)、二乙基氨基乙基交聯葡聚糖凝膠(diethyl amino ethyl sephadex gel, DEAE)和Sep-Pak C18小柱等進行固相萃取，再經50%甲醇洗脫、流動相定容后上高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)分析(美國安捷倫科技有限公司，1200系列)。HPLC條件：色譜柱為反相液相C18色譜柱(5 μm, 4.6×250 mm)，流動相為甲醇- 1%乙酸=40∶60(體積分數)溶液，柱溫為45℃，流速為0.6 mL/min，紫外檢測波長268 nm。

1.4 數據處理

實驗數據用SAS 9.2軟件進行單因素或雙因素方差分析，并用Tukey′s HSD法進行多重比較。顯著性差異水平P取0.05，極顯著差異水平P取0.01。用Origin 8.0軟件進行作圖，SPSS 14.0軟件對數據進行多元逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 砷脅迫對植物生長的影響

在不同濃度砷脅迫下，砷超富集植物大葉井口邊草的生物量與對照(0 mg/kg)相比無顯著變化；非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨的生物量在低、中砷濃度處理下與對照相比無顯著差異(P>0.05)，但在高砷濃度處理下則顯著降低(P<0.05)(圖1)。

砷脅迫下大葉井口邊草的株高與對照相比差異不顯著。劍葉鳳尾蕨在中、高濃度砷脅迫下株高與對照相比顯著下降，低砷濃度下則與對照無顯著差異。雙因素方差分析結果顯示，2種植物之間、砷處理濃度之間對植物的生物量和株高均有極顯著影響(P<0.01)，兩者交互作用對株高具有極顯著影響(圖1)。

圖1 砷脅迫對植物生物量和株高的影響

2.2 砷脅迫下植物葉片對砷的吸收

圖2 砷脅迫下植物葉片的砷含量

從圖2可知，培養(yǎng)結束時(49d)2種植物葉片中砷含量與對照相比均顯著增加，但大葉井口邊草比劍葉鳳尾蕨增加顯著。在200 mg/kg處理下，大葉井口邊草葉片含砷量達(324.45±8.47) mg/kg，而劍葉鳳尾蕨中只有(49.17±4.99)mg/kg。雙因方差分析結果表明，2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對植物葉片砷含量具有極顯著差異。

2.3 砷脅迫對植物體內吲哚乙酸(IAA)含量的影響

2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對植物葉片IAA含量具有極顯著差異。隨著砷處理濃度的增加，除50 mg/kg砷處理下2種植物葉片中IAA含量與對照相比均無顯著差異外，100和200 mg/kg砷濃度處理均使IAA含量顯著增加，但大葉井口邊草比劍葉鳳尾蕨增加顯著，兩者達到極顯著差異水平(圖3)。

圖3顯示添加100 mg/kg砷后兩種植物葉片中IAA含量隨時間的動態(tài)變化。大葉井口邊草在培養(yǎng)13天時葉片中IAA含量達到最高，之后有所下降，但在第43天時又達到第2個高峰；劍葉鳳尾蕨在培養(yǎng)過程中葉片IAA含量總體呈上升趨勢，但整體含量水平較大葉井口邊草低。雙因素方差分析結果表明，2種植物之間、培養(yǎng)時間之間以及兩者交互作用對植物葉片中IAA含量具有極顯著差異。

圖3 砷脅迫下植物葉片中吲哚乙酸(IAA)含量和100 mg/kg處理下的時間動態(tài)

2.4 砷脅迫對植物體內IAA氧化酶(IAAO)活性的影響

從圖4可知，低濃度砷(50 mg/kg)脅迫下2種植物葉片中的IAAO活性與對照相比無顯著差異，但在中、高濃度砷脅迫下均較各自的對照有顯著降低，但在大葉井口邊草中降低更為顯著。雙因素方差分析結果表明，2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對植物葉片IAAO含量具有極顯著差異。

圖4顯示添加100 mg/kg砷后兩種植物葉片中IAAO活性隨時間的動態(tài)變化。隨著培養(yǎng)時間的延長，大葉井口邊草在培養(yǎng)13d時，IAAO活性顯著降低，在第3周左右又恢復到原來活性，之后總體呈下降趨勢；劍葉鳳尾蕨除了在培養(yǎng)37d時有短暫顯著降低外，總體上活性保持在較高水平。雙因素方差分析結果表明，2種植物之間、培養(yǎng)時間之間以及兩者交互作用對植物葉片IAAO活性均具有極顯著差異。

圖4 砷脅迫下植物葉片吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性和100 mg/kg處理下的時間動態(tài)

圖5 砷脅迫下植物葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量

2.5 砷脅迫下植物葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量

2.5.1 培養(yǎng)結束時的變化

如圖5所示，大葉井口邊草在50 mg/kg砷處理時CAT活性與對照相比顯著增加，而中、高濃度砷處理下CAT活性又顯著降低，但能保持在與對照持平的水平；劍葉鳳尾蕨葉片中CAT活性在不同濃度砷處理下均顯著降低。除中等砷濃度處理外，大葉井口邊草葉片中的SOD活性均比對照顯著增加，但劍葉鳳尾蕨在各砷濃度處理時SOD活性均無顯著變化。大葉井口邊草葉片中POD活性在不同濃度砷處理下較對照顯著增加，而劍葉鳳尾蕨葉片中POD活性則無顯著變化。2種植物在不同濃度砷脅迫下葉片中MDA含量均顯著增加，其中，大葉井口邊草葉片MDA含量在低濃度砷處理時便顯著增加，但在中、高濃度砷處理時而又顯著回落；劍葉鳳尾蕨葉片中MDA含量在加砷處理時均顯著增高(圖5)。

雙因素方差分析結果表明，2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對植物葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量具有極顯著差異。

2.5.2 培養(yǎng)過程中的時間動態(tài)

從圖6可知，大葉井口邊草葉片中CAT活性在培養(yǎng)13d時呈顯著下降趨勢，之后又回升至培養(yǎng)結束；劍葉鳳尾蕨葉片CAT活性在培養(yǎng)7d時顯著降低，至19d時又顯著增加，至培養(yǎng)結束時均無顯著變化。大葉井口邊草葉片中SOD活性在前25d無顯著變化，在第25—37天間則顯著升高，到第43天又顯著降低；劍葉鳳尾蕨葉片中SOD活性在培養(yǎng)第13天時顯著降低，第37天時才有顯著升高，之后又有所下降。大葉井口邊草葉片中POD活性在培養(yǎng)第7天時有短暫降低，之后保持升高趨勢，到第37天時達到最高峰；劍葉鳳尾蕨葉片中POD 活性在培養(yǎng)第7天時也有顯著降低，之后則無顯著變化。第31天前，大葉井口邊草和劍葉鳳尾蕨葉片MDA含量均在第7天和第19天出現兩次高峰，但劍葉鳳尾蕨比大葉井口邊草具有更高的MDA 含量，第31天后，2種植物的MDA含量基本趨于一致(圖6)。

圖6 100 mg/kg處理下植物葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量的時間動態(tài)

雙因素方差分析結果表明，2種植物之間、培養(yǎng)時間之間以及兩者交互作用對植物葉片中抗氧化酶活性及丙二醛含量均具有顯著差異。

2.6 逐步回歸分析

令y為植物葉片中IAA含量，x1為植物葉片中砷含量，x2為 植物葉片中SOD活性，x3為植物葉片中POD活性，x4為 植物葉片中CAT活性，x5為 植物葉片中MDA含量，對2種植物分別進行多元逐步回歸分析，得到大葉井口邊草y=51.207+0.166x1-0.132x4，P=0.0001，F=70.987，r=0.97；劍葉鳳尾蕨y=23.948+0.565x1，P=0.01，F=22.210，r=0.83。因此，大葉井口邊草和劍葉鳳尾蕨葉片中IAA含量均分別與其葉片中砷含量成顯著正相關，而大葉井口邊草葉片中IAA含量還與其葉片中CAT活性成顯著負相關。

3 討論

本文研究了砷超富集植物大葉井口邊草和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨經不同濃度砷處理后葉片IAA含量、砷含量、抗氧化酶活性以及IAA含量與抗氧化系統(tǒng)之間的關系。結果表明，在中、高濃度砷脅迫下，砷超富集植物大葉井口邊草葉片中IAA平均含量分別為56.68和45.38 ng/g FW，而非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨中則分別為27.01和30.59 ng/g FW(圖3)。因此，在中、高濃度砷脅迫下砷超富集植物比非砷超富集植物擁有顯著高的IAA水平。隨著砷脅迫濃度增加，2種植物葉片中IAA含量均顯著增加，但砷超富集植物比非砷超富集植物增加顯著。砷超富集植物中相對高的生長素含量水平一方面保證了其在砷污染土壤上的生長，另一方面可能有助于植物超富集砷，2種植物葉片砷含量均值分別是324.45和49.17 mg/kg(圖2)。有研究表明，在外源添加IAA后，紫花苜蓿[10]、滇苦菜[11]、東南景天[12]的葉片對Pb的富集顯著增加；同樣Fassler等[25]在對向日葵添加10-10mol/L IAA時植物葉片的干重顯著增加并且葉片中Pb和Zn含量也顯著增加。由此可見，在外源添加一定濃度IAA后，植物吸收和轉運了一部分IAA，進入植物體內的IAA在加強了植物抵抗重金屬污染脅迫能力的同時，也提高了植物吸收重金屬的能力[25]。在相對高的生長素支持下，超富集植物大葉井口邊草在高濃度砷脅迫下植物的生物量與對照相比無顯著影響，而非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨在同樣處理下生物量則顯著受抑制(圖1)。

吳坤等[26]以煙草(NicotianatabacumL．)為材料，添加不同濃度鎘(0，5，25，50 mg/L)進行實驗，發(fā)現當鎘濃度為5 mg/L時，煙草葉片中IAA含量顯著上升，但隨著鎘濃度的增加IAA含量顯著下降。在本研究中也發(fā)現隨砷處理濃度增加，劍葉鳳尾蕨葉片IAA含量也顯著增加，并未出現下降情況，這表明砷脅迫下劍葉鳳尾蕨體內的IAA含量能夠維持，以保證其能夠在砷污染土壤上健康生長，未觀察到受害癥狀。實驗中發(fā)現，劍葉鳳尾蕨在100 mg/kg濃度處理后一段時間除了長勢較慢和植株矮小外，仍有大部分幼苗長出且無明顯受害，大葉井口邊草在同樣情況下則能保持旺盛生長。劍葉鳳尾蕨葉片中IAA的維持可能與其體內的較低的砷含量尚不構成毒害以及IAAO活性降低有關。面對砷脅迫，兩類植物均需先將有限的能量和資源分配到如何存活而不是大量富集砷上。但是，劍葉鳳尾蕨比大葉井口邊草具有更高的IAAO活性，從而降低了體內的IAA含量。研究表明，生長素在植物體內的穩(wěn)態(tài)經常被各種逆境脅迫(鹽性、干旱、寒冷、機械損傷和金屬脅迫等)所打破[27- 29]，從而改變了植物的生長和發(fā)育。生長素的作用具有明顯的兩重性，低濃度生長素促進植物生長，高濃度時植物生長則受抑制。然而，這其中的濃度高低也有一相對閾值，在相對高的IAA濃度下，IAA能夠促進煙草BY- 2的細胞分裂[30]。生長素的原初誘導基因的兩個典型代表是SAUR和GH3基因家族[31- 32]，只有植物細胞中生長素足夠高時細胞中的GH3基因才會最大量表達，而高濃度生長素促使SAUR在莖的伸長區(qū)也表達增強[33]。

一般植物在重金屬脅迫下體內的活性氧(ROS)會大量增加，導致植物內發(fā)生代謝紊亂，從而對植物的生長和產量產生不利影響。植物將采取各種措施消除活性氧，如不斷提高各種抗氧化酶的活性。本研究表明，在砷脅迫下，與對照(不加砷)相比，大葉井口邊草葉片中CAT、SOD和POD活性能夠維持或增加，從未出現下降趨勢， POD活性增加尤為顯著，表明其具有強大的清除自由基能力。在劍葉鳳尾蕨中，雖然SOD和POD活性在各砷處理中與對照相比均未出現顯著變化，但CAT活性則一直保持降低趨勢，說明其清除ROS的能力比大葉井口邊草低。

本研究對大葉井口邊草葉片中IAA含量與砷含量、抗氧化酶活性和丙二醛含量進行逐步回歸分析，得出IAA含量與CAT活性成顯著負相關。在中、高濃度砷脅迫下，大葉井口邊草葉片CAT活性與低濃度砷脅迫相比有顯著下降(圖5)，隨著CAT活性下降，細胞中有一定量的H2O2積累。長期以來，植物體內的H2O2被看成是一種毒素，但是，H2O2也可作為一個細胞的信號分子和一些基因表達的調節(jié)劑[34]，H2O2參與了細胞信號轉導途徑從而導致對非生物脅迫的適應[35]。另外，在生長素信號通道和氧化還原作用的信號通道之間的動態(tài)相互影響能夠靈活地對細胞的新陳代謝作出高度響應[36- 37]。還有研究表明，H2O2可作為信號分子促進生長素誘導的不定根形成[38]。據報道，植物組織能耐受高濃度的H2O2，范圍為102—2×105μmol/L，原因是植物抗氧化反應系統(tǒng)的設計更多的是為了控制細胞氧化還原電位狀態(tài)，而不是將H2O2完全清除[39]。此外，本研究逐步回歸分析結果表明，由于CAT活性降低帶來了IAA含量增加。生長素過量時也會抑制植物生長，但是，植物體內的IAA絕大多數以非活性的共價化合物形式存在[40]。內源IAA的濃度受3個主要的過程調節(jié)：生物合成、降解和結合反應[41]，GH3基因家族的多個成員是IAA-酰胺連接酶，能使生長素與氨基酸結合，從而降低了自由態(tài)生長素的含量，很多生長素會和糖苷、酰胺基結合[42]。結合途徑對植物來說具有重要的生理意義，可以有效調節(jié)植物組織中內源生長素的含量[40]，因此，大葉井口邊草中相對高的IAA水平有利于生長素在自由態(tài)和結合態(tài)中的轉化。然而，非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨中，中、高濃度砷脅迫下的CAT活性與對照相比無顯著變化(圖5)，也未發(fā)現該種植物中CAT與IAA的相關性。因此，在大葉井口邊草中，低濃度砷處理下CAT活性顯著升高有利于清除細胞內出現的活性氧，但是仍能將活性氧(如H2O2)維持在一定水平，隨著砷脅迫濃度的提高，CAT活性又顯著下降，使細胞內的IAA有所增加。雖然在高砷處理時大葉井口邊草中CAT活性有顯著下降，但能維持在與對照(不加砷)一致的水平，有利于植物體內抗氧化與維持相對高含量IAA的平衡。除我們的研究表明在砷超富集植物中葉片IAA含量受CAT調節(jié)外，最近有研究表明，添加外源生長素(0—25 nmol/L)能增加野生型西紅柿(Solanumlycopersicum)根尖H2O2的含量，并存在劑量-效應關系，這表明在根的生長部位，H2O2含量也受生長素的調節(jié)[43]。生長素能刺激羥基自由基的形成，進而能增加細胞壁的伸展性[44]。因此，生長素和氧自由基的作用關系和調節(jié)規(guī)律非常復雜，還有很多工作需要開展。

此外，本研究的時間動態(tài)研究表明，在第13天，砷超富集植物大葉井口邊草具有最高的IAA含量、最低的IAAO活性以及最低的CAT活性，而劍葉鳳尾蕨中的變化規(guī)律則不明顯，這三者之間的調控機理特別是CAT在生長素含量調節(jié)中的作用需要進一步深入研究。

4 結論

本研究表明，砷超富集植物大葉井口邊草在中、高濃度砷脅迫下能夠維持生長，而非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨生長則受抑制，這一方面是因為大葉井口邊草葉片中抗氧化酶活性(CAT、SOD和POD)能夠維持或增加，從而能夠抵抗砷毒害導致的氧化脅迫，而劍葉鳳尾蕨中這3種抗氧化酶的活性則無顯著變化或顯著減少，說明其抗氧化能力比大葉井口邊草低；另一方面則與砷脅迫下大葉井口邊草葉片中內源IAA含量比劍葉鳳尾蕨增加顯著、且具有更低的IAAO活性有關，而相對高的內源IAA含量能夠維持其在植物內的合成、運輸和分配的平衡，從而更好地促進植物細胞的分裂和分化。2種植物葉片IAA含量均與砷含量成顯著正相關，但大葉井口邊草葉片IAA含量還與CAT活性成顯著負相關，因此，葉片保持較高的IAA含量、較低的IAAO和CAT活性有助于大葉井口邊草超量富集砷。

致謝：云南省煙草科學研究院楊光宇副研究員幫助植物激素測定，昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院潘波教授幫助寫作，特此致謝。

[1] Ma L Q, Komar K M, Tu C, Zhang W H, Cai Y, Kennelley E D. A fern that hyper-accumulates arsenic a hardy, versatile, fast-growing plant helps to remove arsenic from contaminated soils. Nature, 2001, 409(6820): 579- 579.

[2] Chen T B, Wei C Y, Huang Z C, Huang Q F, Lu Q G, Fan Z L. Arsenic hyperaccumulatorPterisvittataL. and its arsenic accumulation. Chinese Science Bulletin, 2002, 47(11): 902- 905.

[3] Zhao F J, Ma J F, Meharg A A, McGrath S P. Arsenic uptake and metabolism in plants. New Phytologist, 2009, 181(4): 777- 794.

[4] Meharg A A. Variation in arsenic accumulation-hyperaccumulation in ferns and their allies. New Phytologist, 2003, 157(1): 25- 31.

[5] Singh N, Ma L Q, Srivastava M, Rathinasabapathi B. Metabolic adaptations to arsenic-induced oxidative stress inPterisvittataL. andPterisensiformisL. Plant Science, 2006, 170(2): 274- 282.

[6] Wang H B, Ye Z H, Shu W S, Li W C, Wong M H, Lan C Y. Arsenic uptake and accumulation in fern species growing at arsenic-contaminated sites of southern China: field surveys. International Journal of Phytoremediation, 2006, 8(1): 1- 11.

[7] Huang J W, Poynton C Y, Kochian L V, Elless M P. Phytofiltration of arsenic from drinking water using arsenic-hyperaccumulating ferns. Environmental Science & Technology, 2004, 38(12): 3412- 3417.

[8] Caille N, Zhao F J, McGrath S P. Comparison of root absorption, translocation and tolerance of arsenic in the hyperaccumulatorPterisvittataand the nonhyperaccumulatorPteristremula. New Phytologist, 2005, 165(3): 755- 761.

[9] Gonzaga M I S, Ma L Q, Santos J A G, Matias M I S. Rhizosphere characteristics of two arsenic hyperaccumulatingPterisferns. Science of the Total Environment, 2009, 407(16): 4711- 4716.

[10] López M L, Peralta-Videa J R, Benitez T, Gardea-Torresdey J L. Enhancement of lead uptake by alfalfa (Medicagosativa) using EDTA and a plant growth promoter. Chemosphere, 2005, 61(4): 595- 598.

[11] 都瑞軍. 化學螯合劑和植物激素提高超富集植物提取重金屬效率 [D]. 廣州: 中山大學, 2010.

[12] Liu D, Li T, Yang X, Islam E, Jin X, Mahmood Q. Enhancement of lead uptake by hyperaccumulator plant speciesSedumalfrediiHance using EDTA and IAA. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2007, 78(3/4): 280- 283.

[13] Israr M, Sahi S V. Promising role of plant hormones in translocation of lead inSesbaniadrummondiishoots. Environmental Pollution, 2008, 153(1): 29- 36.

[14] Piotrowska-Niczyporuk A, Bajguz A, Zambrzycka E, Godlewska-Zykiewicz B. Phytohormones as regulators of heavy metal biosorption and toxicity in green algaChlorellavulgaris(Chlorophyceae). Plant Physiology and Biochemistry, 2012, 52: 52- 65.

[15] Cakmak I, Horst W J. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalysis and peroxidase activities in root tips of soybeanGlycinemax. Physiologia Plantarum, 1991, 83(3): 463- 468.

[16] Grat?o P L, Polle A, Lea P J, Azevedo R A. Making the life of heavy metal stressed plants a little easier. Functional Plant Biology, 2005, 32(6): 481- 494.

[17] Stobrawa K, Lorenc-Plucińska G. Changes in antioxidant enzyme activity in the fine roots of black poplar (PopulusnigraL.) and cottonwood (PopulusdeltoidesBartr. ex Marsch) in a heavy metal-polluted environment. Plant and Soil, 2007, 298(1/2): 57- 68.

[18] Andre C M, Larondelle Y, Evers D. Dietary antioxidants and oxidative stress from a human and plant perspective: a review. Current Nutrition & Food Science, 2010, 6(1): 2- 12.

[19] Meharg A A. Ecological impact of major industrial chemical accidents. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 1994, 138: 21- 48.

[20] Elobeid M, G?bel C, Feussner I, Polle A. Cadmium interferes with auxin physiology and lignification in poplar. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(3): 1413- 1421.

[21] 馬麗, 王海娟, 楊曉燕, 胡擁軍, 王宏鑌. Fe3+對3種水生植物吸收不同形態(tài)砷的影響. 農業(yè)環(huán)境科學學報, 2013, 32(6): 1111- 1121.

[22] 張志良, 瞿偉菁. 植物生理學實驗指導. 北京: 高等教育出版社, 2003: 188- 190.

[23] 王若仲, 肖浪濤, 藺萬煌, 曹庸, 卜曉英. 亞種間雜交稻內源激素的高效液相色譜測定法. 色譜, 2002, 20(2): 148- 150.

[24] Liu H T, Li Y F, Luan T G, Lan C Y, Shu W S. Simultaneous determination of phytohormones in plant extracts using SPME and HPLC. Chromatographia, 2007, 66(7/8): 515- 520.

[25] F?ssler E, Evangelou M W, Robinson B H, Schulin R. Effects of indole- 3-acetic acid (IAA) on sunflower growth and heavy metal uptake in combination with ethylene diamine disuccinic acid (EDDS). Chemosphere, 2010, 80(8): 901- 907.

[26] 吳坤, 吳中紅, 邰付菊, 韓瑩, 謝寶恩, 袁祖麗. 鎘脅迫對煙草葉激素水平、光合特性、熒光特性的影響. 生態(tài)學報, 2011, 31(16): 4517- 4524.

[27] Pfeiffer W, H?ftberger M. Oxidative burst inChenopodiumrubrumsuspension cells: induction by auxin and osmotic changes. Physiologia Plantarum, 2001, 111(2): 144- 150.

[28] Cheong Y H, Chang H S, Gupta R, Wang X, Zhu T, Luan S. Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding, pathogen, abiotic stress, and hormonal responses inArabidopsis. Plant Physiology, 2002, 129(2): 661- 677.

[29] Joo J H, Yoo H J, Hwang I, Lee J S, Nam K H, Bae Y S. Auxin-induced reactive oxygen species production requires the activation of phosphatidylinositol 3-kinase. FEBS Letters, 2005, 579(5): 1243- 1248.

[30] Chen J G. Dual auxin signaling pathways control cell elongation and division. Journal of Plant Growth Regulation, 2001, 20(3): 255- 264.

[31] Hagen G, Kleinschmidt A, Guilfoyle T. Auxin regulated gene expression in intact soybean hypocotyl and excised hypocotyl sections. Planta, 1984, 162(2): 147- 153.

[32] McClure B A, Hagen G, Brown C S, Gee M A, Guilfoyle T J. Transcription, organization and sequence of an auxin-regulated gene cluster in soybean. Plant Cell, 1989, 1(2): 229- 240.

[33] Hagen G, Martin G, Li Y, Guilfoyle T J. Auxin-induced expression of the soybean GH3 promoter in transgenic tobacco plants. Plant Molecular Biology, 1991, 17(3): 567- 579.

[34] Hung S H, Yu C W, Lin C H. Hydrogen peroxide functions as a stress signal in plants. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 2005, 46(1): 1- 10.

[35] Kuz′niak E, Urbanek H. The involvement of hydrogen peroxide in plant responses to stresses. Acta Physiologiae Plantarum, 2000, 22(2): 195- 203.

[36] Pasternak T, Potters G, Caubergs R, Jansen M A K. Complementary interactions between oxidative stress and auxins control plant growth responses at plant, organ, and cellular level. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(418): 1991- 2001.

[37] Tognetti V B, Mühlenbock P, Van Breusegem F. Stress homeostasis-the redox and auxin perspective. Plant Cell and Environment, 2012, 35(2): 321- 333.

[38] Su G X, Zhang W H, Liu Y L. Involvement of hydrogen peroxide generated by polyamine oxidative degradation in the development of lateral roots in soybean. Journal of Integrative Plant Biology, 2006, 48(4): 426- 432.

[39] Slesak I, Libik M, Karpinska B, Karpinski S, Miszalski Z. The role of hydrogen peroxide in regulation of plant metabolism and cellular signaling in response to environmental stresses. Acta Biochimica Polonica, 2007, 54(1): 39- 50.

[40] 許智宏, 薛紅衛(wèi). 植物激素作用的分子機理. 上海: 上海科學技術出版社, 2012: 6- 7.

[41] Normanly J, Slovin J P, Cohen J D. Rethinking auxin biosynthesis and metabolism. Plant Physiology, 1995, 107(2): 323- 329.

[42] Elobeid M, Polle A. Interference of heavy metal toxicity with auxin physiology // Gupta D K, Sandalio L M, eds. Metal Toxicity in Plants: Perception, Signaling and Remediation. Berlin: Springer-Verlag, 2012: 249- 259.

[43] Ivanchenko M G, den Os D, Monhausen G B, Dubrovsky J G, Bednarova A, Krishnan N. Auxin increases the hydrogen peroxide (H2O2) in tomato (Solanumlycopersicum) root tips while inhibiting root growth. Annals of Botany, 2013, 112(6): 1107- 1116.

[44] Liszkay A, Kenk B, Schopfer P. Evidence for the involvement of cell wall peroxidase in the generation of hydroxyl radicals mediating extension growth. Planta, 2003, 217(4): 658- 667.

The relationship between endogenous auxin and antioxidative enzymes in two plants with different arsenic-accumulative ability under arsenic stress

HU Yongjun, WANG Haijuan, WANG Hongbin*, YANG Xiaoyan, LI Yanyan, YIN Fei

FacultyofEnvironmentalScienceandEngineering，KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China

Up to now, 11 arsenic hyperaccumulators and 4 non-hyperaccumulators inPterisgenus have been reported. The non-hyperaccumulators could be used as controls to reveal the responsive mechanisms of hyperaccumulators to arsenic pollution. Auxin plays an important role in plant cell growth, differentiation and division. In the present research, one arsenic hyperaccumulator (Pteriscreticavar.nervosa)and one non-hyperaccumulator (Pterisensiformis) were selected fromPterisgenus to evaluate the effects of arsenic stress (0, 50, 100 and 200 mg/kg) on the plant biomass, height, frond indole- 3-acetic acid (IAA) contents, arsenic accumulation, the activities of IAA oxidase and antioxidative enzymes (superoxide dismutase SOD, peroxidase POD and catalase CAT), as well as the content of malondialdehyde (MDA, a per-oxidation product of cell membrane lipid) using a pot experiment. The relationship among the contents of IAA, arsenic concentration, activities of 3 antioxidative enzymes and MDA contents in the fronds of two plants were also analyzed by step regression statistical method. In addition, the variation of IAA, IAAO, SOD, POD, CAT and MDA in two plants exposed to 100 mg/kg arsenic with culture time was examined. No significant difference was observed in the biomass and height ofP.creticavar.nervosaunder arsenic stress compared to the control (0 mg/kg), but a significant decrease was noted inP.ensiformisunder medium or high arsenic stress. The concentrations of arsenic and IAA increased but the activity of IAAO decreased in the fronds of two plants exposed to medium or high arsenic stress, but this change was more significant inP.creticavar.nervosa. The activities of 3 antioxidative enzymes could maintain or increase in the fronds ofP.creticavar.nervosaexposed to arsenic stress, but a significant decrease of POD was observed inP.ensiformis, in which the activities of SOD and CAT could maintain. Therefore, much stronger antioxidative ability was shown inP.creticavar.nervosaexposed to arsenic stress. The results from step regression analysis showed a significantly positive correlation between the IAA contents and arsenic concentrations in the fronds of two plants, and a significantly negative correlation was also observed between the IAA contents and CAT activities in the fronds ofP.creticavar.nervosa. The result from time-course effect research showed that the highest IAA contents, the lowest IAAO and CAT activity were found in the 13th days in the culture process ofP.creticavar.nervosaexposed to 100 mg/kg, but similar result was not observed forP.ensiformis. Therefore, a higher IAA contents, a lower IAAO and CAT activities may have contributed to arsenic hyperaccumulation inP.creticavar.nervosa.

auxin; indole- 3-acetic acid (IAA); arsenic; antioxidative enzymes;Pteriscreticavar.nervosa;Pterisensiformis

國家自然科學基金資助項目(31360132); 云南省中青年學術和技術帶頭人后備人才項目(2012HB007)

2013- 12- 02;

2014- 08- 13

10.5846/stxb201312022863

*通訊作者Corresponding author.E-mail: whb1974@126.com

胡擁軍, 王海娟, 王宏鑌, 楊曉燕, 李燕燕, 殷飛.砷脅迫下不同砷富集能力植物內源生長素與抗氧化酶的關系.生態(tài)學報,2015,35(10):3214- 3224.

Hu Y J, Wang H J, Wang H B, Yang X Y, Li Y Y, Yin F.The relationship between endogenous auxin and antioxidative enzymes in two plants with different arsenic-accumulative ability under arsenic stress.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3214- 3224.