赫 莉，韓海平，馮志星，張慧平，要兆旭，連 蕾，楊 雪

(1. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

論 著

RKIP和VEGF在喉鱗癌及喉鱗狀上皮不典型增生組織中的表達(dá)及臨床意義

赫 莉1，韓海平1，馮志星1，張慧平2，要兆旭1，連 蕾1，楊 雪1

(1. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

目的通過檢測(cè)Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)在喉鱗癌及喉鱗狀上皮不典型增生組織中的表達(dá)情況，分析二者在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用及可能分子機(jī)制。方法采用免疫組化方法檢測(cè)43例喉鱗癌組織、20例喉鱗狀上皮不典型增生組織及9例正常喉黏膜組織中RKIP、VEGF的表達(dá)情況，分析其臨床意義及二者之間的相關(guān)性。結(jié)果正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中RKIP表達(dá)陽性率逐漸降低，VEGF表達(dá)陽性率逐漸上升，喉鱗癌組織中RKIP表達(dá)陽性率顯著低于正常喉黏膜組織及喉鱗狀上皮不典型增生組織(P均<0.05)；有轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織中RKIP表達(dá)陽性率低于無轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織(P<0.05)，VEGF表達(dá)陽性率高于無轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織(P<0.05)。在正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中，RKIP與VEGF的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.324，P=0.006)。結(jié)論RKIP具有抑制喉鱗癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用，這可能是通過下調(diào)VEGF表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

Raf-1激酶抑制蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；免疫組化；喉鱗狀細(xì)胞癌；喉鱗狀上皮不典型增生

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，組織學(xué)上以鱗狀細(xì)胞癌最多見。喉鱗癌的發(fā)生先從喉正常黏膜發(fā)展至鱗狀上皮不典型增生，最終轉(zhuǎn)變?yōu)楹眵[狀細(xì)胞癌。Raf-1激酶抑制蛋白(Raf -1 kinase inhibitor protein，RKIP )被認(rèn)為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，具有抑制腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的功能，其表達(dá)水平在惡性腫瘤的發(fā)展及預(yù)后評(píng)估方面具有重要的指導(dǎo)作用[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular epidermal growth factor ,VEGF)是血管生成刺激因子，在腫瘤外侵、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。本研究通過檢測(cè)正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織、喉鱗癌組織中RKIP、VEGF的表達(dá)情況，以探討二者在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中的作用及可能機(jī)制，為喉鱗癌的診斷治療提供新的方法。

1 臨床資料

1.1一般資料 所有標(biāo)本取自白求恩國(guó)際和平醫(yī)院及邯鄲市中心醫(yī)院2007年1月—2014年2月收治患者，其中喉癌住院手術(shù)患者43例，男39例，女4例；年齡42～86歲，平均61歲；按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)TNM分類標(biāo)準(zhǔn)(2002)修訂的方案屬于聲門上型17例，聲門型26例；T1期11例，T2期11例，T3期8例，T4期13例；臨床Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期8例，Ⅳ期15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；術(shù)后病理均證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，均無遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。喉鱗狀上皮不典型增生手術(shù)患者20例，男18例，女2例；年齡46～64歲，平均52歲；不典型增生重度4例，中度9例，輕度7例。9例正常喉黏膜組織取自行全喉切除的喉癌患者，聲門型的喉癌在距原發(fā)灶邊緣0.5 cm以外的范圍采集，聲門上型的喉癌在距原發(fā)灶邊緣1.0cm 以外處采集，術(shù)后病理檢測(cè)均為分化良好且無腫瘤組織浸潤(rùn)的鱗狀上皮。所有病例資料完整，術(shù)前未接受放射治療及化學(xué)治療。

1.2材料 山羊抗人RKIP多克隆抗體，為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。鼠抗人VEGF多克隆抗體，即用型二步法免疫組織化學(xué)試劑盒，光譜超敏SP法試劑盒和濃縮型DAB試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，4 μm連續(xù)切片，切片經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、中性樹膠封片等步驟處理。所有病理切片由3名病理醫(yī)師在不知病例資料和腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)的前提下閱片。對(duì)每張病理切片在高倍(×400)鏡下至少觀察10個(gè)不重復(fù)視野，判斷細(xì)胞著色率和著色強(qiáng)度。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 染色細(xì)胞內(nèi)有棕色顆粒為陽性表達(dá)。①RKIP表達(dá)參考文獻(xiàn)[2]采用半定量評(píng)分法判定：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞<10%為1分，陽性細(xì)胞占10%～50%為2分，陽性細(xì)胞>50%～80%為3分，陽性細(xì)胞>80%為4分;染色強(qiáng)度按陰性、弱、中、強(qiáng)染色分別評(píng)為0～3分。最終評(píng)分按2個(gè)指標(biāo)的乘積判定，0～3分為陰性(-)，4～8分為弱陽性(+)，9～12分為強(qiáng)陽性()。②VEGF表達(dá)參考文獻(xiàn)[2]采用半定量評(píng)分法判定：陽性細(xì)胞<25%為0分，陽性細(xì)胞占25%～50%為1分，陽性細(xì)胞>50%～75%為2分，陽性細(xì)胞>75%為3分; 染色強(qiáng)度按陰性、弱、中、強(qiáng)染色分別評(píng)為0～3分。最終評(píng)分按2個(gè)指標(biāo)的乘積判定，0～3分為陰性(-)，4～8分為弱陽性(+)，9～12分為強(qiáng)陽性()。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)，RKIP與VEGF的相關(guān)性比較采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中RKIP和VEGF鏡下表達(dá)情況 RKIP、VEGF染色陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，在正常喉黏膜的鱗狀上皮基底層中，RKIP多為陰性表達(dá)，在基底層以上的細(xì)胞層次中，RKIP多為陽性表達(dá),見圖1。在喉鱗癌組織中分化較好的腫瘤細(xì)胞RKIP陽性表達(dá)較多，見圖2。VEGF的表達(dá)情況則與之相反，見圖3和圖4。

圖1 正常喉黏膜組織RKIP染色陽性表達(dá)情況(×400)

圖2 喉鱗癌組織RKIP染色陽性表達(dá)情況(×400)

圖3 正常喉黏膜組織VEGF染色陽性表達(dá)情況(×400)

圖4 喉鱗癌組織VEGF染色陽性表達(dá)情況(×400)

2.2不同組織中RKIP和VEGF陽性表達(dá)情況 喉鱗癌組織中RKIP表達(dá)陽性率顯著低于正常喉黏膜組織及喉鱗狀上皮不典型增生組織(P均<0.05)，喉鱗狀上皮不典型增生組織與正常喉黏膜組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中VEGF表達(dá)陽性率有依次升高趨勢(shì)，但各組織間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 不同組織中RKIP和VEGF表達(dá)情況 例(%)

注：①與喉鱗癌組織比較，P<0.05。

2.3RKIP與VEGF在喉鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RKIP表達(dá)陽性率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，VEGF表達(dá)陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；不同年齡、腫瘤發(fā)病部位、T分期、臨床分期、腫瘤分化程度間二者表達(dá)陽性率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 RKIP與VEGF在喉鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

注：①與無轉(zhuǎn)移比較，P<0.05。

2.4RKIP與VEGF的表達(dá)相關(guān)性分析 將RKIP與VEGF在正常喉黏膜組織、鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中的表達(dá)情況做Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果二者呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.324，P=0.006)。見表3。

表3 RKIP與VEGF的表達(dá)相關(guān)性分析 例

3 討 論

晚期喉鱗癌無論手術(shù)或放療，療效均不佳，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明。RKIP是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)家族成員之一，是廣泛存在于人體組織中的一種高度保守的蛋白[3],它通過參與絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信號(hào)通路、核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信號(hào)通路、G蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路等多條信號(hào)通路發(fā)揮自身作用，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化[4-6]。RKIP是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力；其表達(dá)下調(diào)能夠使腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定性下降，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲力、轉(zhuǎn)移力增加，促進(jìn)周圍侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)生。陳彥等[7]在RKIP低表達(dá)與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移和NF-κB信號(hào)通路活化相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，RKIP可能是鼻咽癌的一個(gè)轉(zhuǎn)移抑制蛋白，RKIP表達(dá)下調(diào)可能通過活化NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。胡那日蘇等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)RKIP表達(dá)的減少或缺失與腺樣囊性癌、口腔涎腺黏液表皮樣癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喉鱗癌組織中RKIP表達(dá)陽性率顯著低于正常喉黏膜組織及喉鱗狀上皮不典型增生組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RKIP表達(dá)陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示RKIP與喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，RKIP表達(dá)陽性率低的喉鱗癌更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，RKIP可抑制喉鱗癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究中喉鱗狀上皮不典型增生組織與正常喉黏膜組織相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于樣本量小或者免疫組化方法的敏感度尚不足以反映其差異，這一問題有待于進(jìn)一步研究。

VEGF是血管生成刺激因子，它能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性相結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增強(qiáng)血管通透性，是作用最強(qiáng)的血管生成因子之一[10]。許多實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)過程中需要血管為其提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以VEGF在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，有轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織中VEGF表達(dá)陽性率高于無轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織，故認(rèn)為VEGF的表達(dá)上調(diào)可能是促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制之一。

綜上所述，在正常喉黏膜到喉鱗狀上皮不典型增生再到喉鱗癌的逐漸轉(zhuǎn)變過程中，RKIP表達(dá)是逐漸下降的，VEGF表達(dá)是逐漸上升的，RKIP與VEGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。由此推測(cè)，RKIP具有抑制喉鱗癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用，其可能的分子機(jī)制為RKIP通過某些途徑下調(diào)了VEGF的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抑制喉鱗癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用。

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Expressions and clinical significance of RKIP, VEGF in laryngeal squamous cell carcinoma, laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia

HE Li1, HAN Haiping1, FENG ZHI Xing1, ZHANG Huiping2, YAO Zhaoxu1, LIAN Lei1, YANG Xue1

(1.Handan Central Hospital, handan 056001, Hebei, China; 2.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to observe the expressions and clinical significance of Raf-1 kinase inhibitor protein (RKIP), vascular endothelial growth factor (VEGF) in laryngeal squamous cell carcinoma and laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia, and analyze the action of RKIP, VEGF in the occurrence and development of laryngeal squamous cell carcinoma as well as the possible molecular mechanisms. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of RKIP and VEGF in 43 cases of laryngeal squamous cell carcinoma tissue, 20 cases of laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia tissue and 9 cases of normal larynx squamous epithelium tissue. The clinical significance and correlation of them were analyzed. Results The expression of RKIP in normal larynx squamous epithelium tissues, laryngeal squamous cell carcinoma tissues and laryngeal squamous cell carcinoma tissues was decreased gradually, and the positive rate of VEGF expression was increased gradually. RKIP expression in laryngeal squamous cell carcinoma tissues was lower than that in normal larynx squamous epithelium tissues and laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia tissue (allP<0.05). RKIP expression in squamous cell carcinoma tissues with metastasis was significantly lower than that in squamous cell carcinoma tissues without metastasis (P<0.05), and VEGF expression was significantly higher than that in squamous cell carcinoma tissues without metastasis (P<0.05). In all cases, RKIP expression had negative correlation with VEGF expression (r=-0.324,P=0.006).Conclusion The RKIP may have the action of inhibition migration and metastasis in laryngeal squamous cell carcinoma by down-regulating VEGF expression.

Raf-1 kinase inhibitor protein; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry; laryngeal squamous cell carcinoma; laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia

赫莉，女，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科工作。

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(20150462)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.27.001

R-33

A

1008-8849(2015)27-2965-04

2015-03-30