高彩霞，喬田奎*，張 彬，袁素娟

（復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海201508）

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)是存在于哺乳動物且與Toll蛋白同源的分子，參與非特異性免疫。目前研究發(fā)現(xiàn)TLR9在多種腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，而且認(rèn)為TLR9的表達(dá)參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，影響著腫瘤的臨床分期；也有報(bào)道腫瘤細(xì)胞TLR9高表達(dá)與放化療抗拒有關(guān)，從而影響著腫瘤的放化療結(jié)果。本文通過對63例在我院進(jìn)行手術(shù)治療的肺癌患者腫瘤組織TLR9陽性表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在分析TLR9在肺癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)及其對肺癌患者術(shù)后放療生存的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2007年3月至2011年12月期間在本院進(jìn)行手術(shù)切除的肺癌患者術(shù)后組織標(biāo)本66例，病理蠟塊保存完好，術(shù)前均未接受放化療；其中鱗癌33例(角化型鱗癌和非角化性鱗癌各1例)，腺癌27例(乳頭狀腺癌1例、肺泡癌2例)，腺鱗癌3例，肉瘤樣癌3例，小細(xì)胞肺癌2例，黏液腺癌1例(腸癌肺轉(zhuǎn)移)；局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，同側(cè)肺內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移2例，發(fā)生胸壁腫瘤侵犯2例；剔除小細(xì)胞肺癌和肺轉(zhuǎn)移癌病例，最終選擇63例肺癌術(shù)后組織蠟塊作為本實(shí)驗(yàn)的有效組織標(biāo)本來源。

1.2 患者一般情況及隨訪資料

63例患者均在本院接受肺癌診斷和治療，其中男性52例，女性11例，年齡最小36歲，最大76歲，中位年齡63歲，有吸煙史42例，無吸煙史者21例；2例患者接受單側(cè)全肺切除術(shù)加局部淋巴結(jié)清掃，其余61例患者均為肺葉切除術(shù)加同側(cè)肺門及縱膈淋巴結(jié)清掃。按照國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)1997年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期12例、Ⅱ期35例、Ⅲ期12例、Ⅳ期4例(Ⅳ期患者中包括2例胸膜轉(zhuǎn)移，1例胸壁局部侵犯和1例心包癌結(jié)節(jié))；縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，35例無縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；術(shù)后未行放療者27例，術(shù)后放療者36例，25例患者接受了術(shù)后化療。術(shù)后化療始于手術(shù)后1月左右，簽訂化療知情同意書，化療以含鉑方案為主，NP(第1天和第8天蓋諾30 mg/m2，第1～3天順鉑30 mg/m2)方案13例；TP(第1天多西紫杉醇100 mg/m2或紫杉醇135～175 mg/m2，第1～3天順鉑30 mg/m2)方案10例，GP(第1天和第8天吉西他濱1000 mg/m2，第1～3天順鉑30 mg/m2)方案2例，以術(shù)后化療4個(gè)周期為準(zhǔn)，7例患者完成4個(gè)周期化療，13例患者完成2個(gè)周期化療，5例患者因反應(yīng)大未完成1個(gè)周期化療，25例患者平均術(shù)后化療2.5個(gè)周期。化療期間常規(guī)止吐鎮(zhèn)靜抗過敏治療，配合順鉑化療加大補(bǔ)液量并給予呋塞米治療；化療后1周復(fù)查血常規(guī)，白細(xì)胞降低者給與升白治療。

本組患者治療結(jié)束后3個(gè)月開始進(jìn)行隨訪，隨訪截止至2012年2月，術(shù)后2年每3個(gè)月隨訪1次，之后半年隨訪1次，隨訪時(shí)間最短為12個(gè)月，最長為56個(gè)月，中位隨訪時(shí)間38個(gè)月，期間記錄患者無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)；截止隨訪結(jié)束死亡58例，均死于腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，4例仍然健在，1例失訪，隨訪率為98.4%，隨訪形式以預(yù)約門診為主，信函或電話隨訪作為補(bǔ)充。

1.3 術(shù)后放療

依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National C omprehensive Cancer Network，NCCN)肺癌治療指南進(jìn)行肺癌術(shù)后放療，針對切緣陽性患者和Ⅱb以上患者行術(shù)后放療，放療前進(jìn)行卡氏評分和肺功能測定，靜脈血化驗(yàn)血常規(guī)和肝腎功能，簽訂放療知情同意書。共36例患者接受術(shù)后放療，肺癌術(shù)后1～3個(gè)月開始術(shù)后放療，或化療后進(jìn)行術(shù)后放療。常規(guī)三維適形放療體膜制作-定位-計(jì)劃，CT掃描層厚4 mm，定位掃描圖像直接傳輸至治療計(jì)劃系統(tǒng)(treatment planning system，TPS)，常規(guī)勾畫體表、肺臟、心臟及脊髓，腫瘤臨床靶區(qū)(clinical target volume，CTV)包括氣管支氣管斷端、同側(cè)肺門淋巴結(jié)區(qū)、隆突下淋巴結(jié)區(qū)，右側(cè)肺癌患者術(shù)后靶區(qū)CTV包括血管前氣管后淋巴結(jié)區(qū)，左肺癌患者術(shù)后靶區(qū)CTV包括主動脈弓上淋巴結(jié)區(qū)和主動脈窗淋巴結(jié)區(qū)，CTV外放5 mm為計(jì)劃靶區(qū)(planning target volume，PTV)；計(jì)劃要求95%等劑量線覆蓋PTV，6 MV X射線三維適形放療，三野或四野等中心照射，常規(guī)分割，處方劑量2 Gy/次，雙肺平均劑量≤18 Gy，雙肺V20(接受20 Gy照射的肺體積與肺總體積之比)≤30%，心臟劑量限制45 Gy，脊髓劑量限制45 Gy。對于手術(shù)切緣陽性患者，治療50 Gy后縮野至支氣管斷端加量至56～60 Gy。36例患者均按計(jì)劃完成術(shù)后放療，未發(fā)生嚴(yán)重的放療合并癥。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 免疫組化SP法腫瘤組織蠟塊4 μm切片固定，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，將切片置于0.01 mol/L(pH 6.0)檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行微波抗原熱修復(fù)，中高火修復(fù)40 min，室溫冷卻30 min，PBS沖洗；3% H2O2室溫處理10 min，山羊血清室溫孵育10 min，滴加稀釋的一抗(鼠抗人TLR9單克隆抗體購自美國Abcam公司，TLR9稀釋比1∶100)，4 ℃過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗(購自福州邁新生物技術(shù)有限公司)，37 ℃孵育20 min，DAB顯色(DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；經(jīng)蘇木精對比染色后脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4.2 結(jié)果判斷TLR9蛋白陽性信號定位于細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按染色細(xì)胞數(shù)和染色程度綜合判斷，最終結(jié)果采用雙評分法：①按陽性細(xì)胞百分率評分。＜25%為0分，≥25%～50%為1分，≥50%～75%為2分，≥75%為3分；②按染色強(qiáng)度評分。無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加，0～1分為-，2～3分為+，4～5分為++，6分為+++，其中++～+++視為TLR9陽性表達(dá)，-～+視為TLR9陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件，TLR9與各臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行術(shù)后放療單因素生存分析，采用對數(shù)Log-Rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行術(shù)后放療生存多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 TLR9表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，TLR9蛋白定位于肺癌組織的腫瘤細(xì)胞質(zhì)中，呈均勻的棕黃色顆粒樣物質(zhì)，而正常肺泡細(xì)胞內(nèi)未見TLR9蛋白陽性表達(dá)(見圖1)；63例肺癌患者中TLR9陽性表達(dá)43例陽性表達(dá)率為68.3%；其中TLR9強(qiáng)陽性(+++)表達(dá)5例，TLR9未見表達(dá)5例。

2.2 TLR9陽性表達(dá)率與肺癌的臨床病理特征分析

根據(jù)不同臨床病理特征的TLR9表達(dá)情況進(jìn)行單因素分析，見表1。結(jié)果顯示：TLR9表達(dá)陽性率在肺癌不同性別、年齡、吸煙史、病變部位、有無術(shù)后放化療、病理類型、TNM分期以及不同的腫瘤分化程度中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)；原發(fā)腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不同的患者中，TLR9陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，提示TLR9表達(dá)與肺癌的腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

2.3 TLR9表達(dá)對肺癌患者術(shù)后生存的影響

截止隨訪結(jié)束，58例患者死亡，5例仍存活，OS中位值為34.0個(gè)月，PFS中位值為23.4個(gè)月，63例肺癌患者中，TLR9陰性和陽性表達(dá)的患者中位PFS依次為32.0±2.7和21.0±0.9，中位OS依次為47.0±8.0和31.0±1.1，TLR9陰性表達(dá)較TLR9陽性表達(dá)患者的PFS明顯延長，TLR9陰性表達(dá)患者具有一個(gè)較長的OS。

進(jìn)一步對36例術(shù)后放療患者以不同TLR9表達(dá)水平(陰性或陽性)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、病理類型(鱗癌或腺癌)以及腫瘤直徑進(jìn)行Kaplan-Meier單因素生存分析，采用對數(shù)Log-Rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示(見表2)：肺癌病理類型與術(shù)后放療患者的PFS有相關(guān)性(χ2=6.67，P=0.01)，而對術(shù)后放療患者的OS生存影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)；淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對術(shù)后放療患者生存的OS影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.01，P=0.01)，對PFS的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06)；腫瘤直徑對術(shù)后放療患者生存的PFS和OS均顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，腫瘤組織的TLR9表達(dá)狀態(tài)對PFS和OS均有影響(P均=0.00)，TLR9陰性表達(dá)的肺癌術(shù)后放療患者具有較為明顯的PFS和OS優(yōu)勢。

表1 肺癌的臨床病理特征與TLR9表達(dá)

表2 36例肺癌患者術(shù)后放療生存Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果

2.4 肺癌術(shù)后放療生存因素的Cox回歸分析

將肺癌術(shù)后放療生存的各因素作為自變量統(tǒng)一納入Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，進(jìn)行鱗癌或腺癌的肺癌病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑和TLR9表達(dá)對肺癌術(shù)后放療生存的預(yù)測分析，見表3。結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TLR9表達(dá)是肺癌術(shù)后放療生存的獨(dú)立預(yù)測因素(P值分別為0.020和0.003)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相對危險(xiǎn)度為2.809，TLR9表達(dá)的相對危險(xiǎn)度為4.603，表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TLR9表達(dá)是預(yù)測肺癌術(shù)后放療生存的風(fēng)險(xiǎn)因子。

表3 肺癌術(shù)后放療生存的Cox回歸結(jié)果

3 討論

TLR9屬于胞內(nèi)受體，主要識別細(xì)菌和病毒DNA中的非甲基化CpG DNA配體，是TLRs的主要成員之一。已有研究證明[1-6]，TLR9在乳腺癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌組織中表達(dá)增加，通過上調(diào)TLR9表達(dá)，一方面可以激活核轉(zhuǎn)錄因子AP-l、NF-κB促進(jìn)腫瘤的生長，另一方面通過炎癥介質(zhì)合成增加參與腫瘤微環(huán)境的形成，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響腫瘤的臨床分期[7]。

本研究針對63例肺癌患者，利用免疫組化SP法檢測TLR9蛋白表達(dá)，結(jié)果TLR9蛋白在正常肺泡細(xì)胞中未見表達(dá)；而在肺癌組織中的陽性表達(dá)率為68.3%(43/63)，其中TLR9強(qiáng)陽性表達(dá)5例(見圖1)；進(jìn)一步將肺癌患者以性別、年齡、吸煙史、病變部位、腫瘤病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、TNM分期和術(shù)后有無放療進(jìn)行分組，比較組間TLR9表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移與TLR9表達(dá)相關(guān)，腫瘤直徑越大和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TLR9陽性率越高。而由于本研究例數(shù)較少，盡管與腫瘤TNM分期相關(guān)性的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是P值達(dá)到0.056，因此更傾向于TLR9表達(dá)可能與肺癌TNM分期的存在相關(guān)性，與Qiu等[8]對乳腺癌TLR9在腫瘤體積大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分期較晚的患者中表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果相一致；在與肺癌性別、年齡、病理類型(鱗癌或腺癌)和腫瘤分化程度的相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

放射治療是肺癌最重要的局部治療手段，理論上術(shù)后放療能有效增加腫瘤局部的控制率，減少局部腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Douillard等[9]研究中，840例非小細(xì)胞肺癌患者有232例接受術(shù)后放療，僅有術(shù)后病理N2期(pN2)患者能從術(shù)后放療中獲得生存優(yōu)勢，其5年生存率提高僅有13%，多數(shù)患者最終死于腫瘤局部復(fù)發(fā)或淋巴結(jié)多發(fā)轉(zhuǎn)移，因此肺癌術(shù)后放療結(jié)果的影響因素仍不明朗。本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)[10]，CpG ODN7909通過激活TLR9信號通路增加了放射抗拒肺癌細(xì)胞的放射敏感性，而TLR9表達(dá)狀態(tài)對于肺癌術(shù)后放療患者的生存是否有影響，這方面的臨床研究還未見報(bào)道。本研究通過對36例肺癌術(shù)后放療患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示出TLR9陽性表達(dá)和腫瘤直徑越大的患者PFS和OS均較短；對于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其術(shù)后放療的OS明顯縮短；傳統(tǒng)理論認(rèn)為，鱗癌屬對放射治療敏感的腫瘤，研究結(jié)果顯示病理類型(鱗癌或腺癌)對術(shù)后放療生存的PFS有影響。這無疑體現(xiàn)了肺癌術(shù)后放療增加局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移控制率的優(yōu)勢，從而利于術(shù)后患者的生存。將以上影響術(shù)后放療生存的諸因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示TLR9表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肺癌術(shù)后放療生存的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，其相對危險(xiǎn)度分別為4.603和2.809，因此TLR9高表達(dá)和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均不利于肺癌術(shù)后放療患者的生存，TLR9則可能成為預(yù)測肺癌術(shù)后放療生存的新的分子生物學(xué)因子。

通過本研究可以看出，TLR9信號通路的激活與肺癌腫瘤大小以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，并且對肺癌術(shù)后放療的預(yù)后產(chǎn)生影響。因本研究例數(shù)較少，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可能出現(xiàn)偏差，希望今后針對更大樣本量進(jìn)行深入的研究。

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