謝星光, 戴傳超, 蘇春淪, 周佳宇, 王宏偉, 王興祥

1 南京師范大學生命科學學院, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心, 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室, 南京 210023 2 中國科學院土壤環(huán)境與修復重點實驗室(南京土壤研究所), 南京 210008 3 中國科學院紅壤生態(tài)實驗站, 江西省紅壤生態(tài)研究重點實驗室, 鷹潭 335211

內生真菌對花生殘茬腐解及土壤酚酸含量的影響

謝星光1, 戴傳超1, 蘇春淪1, 周佳宇1, 王宏偉1, 王興祥2,3,*

1 南京師范大學生命科學學院, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心, 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室, 南京 210023 2 中國科學院土壤環(huán)境與修復重點實驗室(南京土壤研究所), 南京 210008 3 中國科學院紅壤生態(tài)實驗站, 江西省紅壤生態(tài)研究重點實驗室, 鷹潭 335211

土壤中花生殘茬是導致連作障礙的原因之一。為了探討施加內生真菌Phomopsisliquidambari(B3)對加速花生殘茬腐解、改善連作花生土壤環(huán)境、緩解花生連作障礙的作用及其可能機理，通過向土壤中添加花生(Archishypogaea)殘體，利用盆栽試驗探討了施加B3對花生殘茬腐解率、土壤部分酚酸物質和酶活性的影響。結果表明：與CK相比，在萌發(fā)期和苗期，添加B3處理顯著加快殘茬腐解，提高纖維素木質素降解率，增加土壤中對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量；在花生整個生育期，施加B3顯著調節(jié)了土壤中漆酶、錳過氧化物酶(Manganese peroxidase, MnP)、木質素過氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性的動態(tài)變化，這種變化有利于花生殘茬快速腐解和酚酸類化感物質的及時轉化。開花期之后施加B3處理土壤酚酸含量顯著降低，花生莢果增產(chǎn)19.9%。實時定量PCR結果表明內生真菌B3在土壤中30 d內可以被檢測，并對復雜多樣的酚酸類物質具有廣譜高效的降解能力。由此說明，施加內生真菌B3可以顯著加快連作土壤中花生殘茬腐解，進而通過減少土壤酚酸含量來緩解由殘茬腐解引起的連作障礙。

花生殘茬; 連作障礙; 酚酸; 內生真菌; 土壤酶活

花生是我國重要的油料作物，2011年我國花生播種面積450多萬hm2，約占油料作物總面積的35%[1]。由于長期連作，花生連作障礙比較普遍[2]。導致花生連作障礙的因素多種多樣[3- 5]，其中前茬花生殘體及其腐解物往往造成土壤功能和特性下降[6]、微生物區(qū)系失衡[7]、影響種子萌發(fā)和幼苗生長[8- 9]以及土傳病原菌增加等往往是抑制花生生長的主要因素[2,10- 11]。土壤酚酸類化感物質積累是作物殘茬腐解產(chǎn)生連作障礙的直接原因，主要通過影響植物細胞膜通透性[12]、礦質元素吸收[13]、光合作用[14]及蛋白質和DNA合成[15]等多種途徑直接抑制作物生長。

內生真菌是指生長于植物組織細胞間，宿主不表現(xiàn)出感染癥狀的一類真菌[16]。前期發(fā)現(xiàn)，接種內生真菌Phomopsisliquidambari(B3)15 d后，秸稈表面出現(xiàn)空洞和縫隙以及入侵到秸稈表面的B3菌體，木質素的阻礙被去除從而顯著增強還田秸稈降解[17- 18]。B3在促進茅蒼術(Atractylodeslancea)凋落物快速降解的初期階段還加快了4-羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 4-HBA)、香草酸(Vanillic acid, VA)和香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)的釋放[19]；連作花生土壤中施加內生真菌B3可以顯著提高花生產(chǎn)量、增加花生根瘤數(shù)及改善土壤微生態(tài)環(huán)境[20]。但連作土壤施加內生真菌B3后花生增產(chǎn)與秸稈腐解之間有無關系仍不清楚。因此，本文從施加內生真菌B3在加速花生殘茬秸稈腐解、減少土壤酚酸含量的角度，進一步探索其緩解花生連作障礙的機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

香草酸(Vanillic acid, VA)和香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)均購自Sigma公司，乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。

供試土壤：盆栽土壤取自江西省鷹潭市中國科學院紅壤生態(tài)實驗站，為紅黏土發(fā)育的紅壤(5—20 cm)，多年連作花生。土壤基本理化性質：有機質18.43 g/kg，全氮0.83 g/kg，全磷0.62 g/kg，全鉀9.24 g/kg，堿解氮2.45 mg/kg，速效磷19.46 mg/kg，速效鉀243.52 mg/kg，pH值 5.6(1∶2.5 H2O)。

花生(Archishypogaea)：為江西省鷹潭市常規(guī)品種贛花5號。

花生殘體：2011年9月收獲贛花5號花生秸稈并曬干，將花生秸稈(粗蛋白13.2%，粗脂肪3.3%，粗纖維32.5%)剪成1 cm大小用于盆栽試驗。

內生真菌B3：為擬莖點霉屬(Phomopsisliquidambari)，分離自大戟科重陽木(Bischofiapolycarpa)莖內皮。內生真菌菌種B3從PDA(馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基)斜面轉接至PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)好后一部分用于搖瓶降解試驗，另一部分抽濾獲得菌絲，蒸餾水洗滌3次，取部分菌絲60 ℃烘干48 h測量干重，剩余部分用于DNA提取和施加到試驗土壤中。

1.2 試驗設計

1.2.1 盆栽試驗設計

盆栽試驗地點位于南京師范大學植物園(N 31°14′，E 118°22′)，試驗盆缽直徑28 cm，高23 cm。盆栽試驗土壤自然風干后過2 mm篩 (土壤未作滅菌處理)。2012年5月15日裝土，每盆裝土6 kg，每盆施加尿素1.5 g、Ca3(PO4)23 g、KCl 2.5 g。盆缽埋入土壤，盆口距離地面2 cm。試驗分為兩部分：A組用于探討花生殘茬腐解效果及木質素纖維素降解率，共設3個處理：對照(CK)；土壤中添加內生真菌B3(B3+)；土壤中添加滅活內生真菌B3(B3-)。每盆折合菌絲干重2 g，同時用5 cm × 5 cm網(wǎng)格袋(孔徑1 mm)裝花生秸稈殘體5 g，每盆放3袋，置于表層土0—15 cm之間，網(wǎng)格袋之間不重疊。B組用于檢測土壤酚酸含量(檢測的酚酸為花生連作土壤中含量相對較高的4-羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸[21])、降解酶活性、內生真菌B3含量及花生農(nóng)藝性狀，同樣設3個處理：對照(CK)；土壤中添加內生真菌B3(B3+)；土壤中添加滅活內生真菌B3(B3-)。每盆折合干菌絲2 g，同時添加15 g花生殘體并與深度0—15 cm的表層土壤拌勻。試驗所有處理每個時間取樣點均設3個重復。隨后立即播種花生，每盆兩粒，保證日照和水分。

分別在播種前(第0 天)、花生萌發(fā)期(第10 天)、苗期(第30 天)、開花期(第60 天)、結莢期(第90 天)和成熟期(第110 天)從A組土壤取出網(wǎng)袋，每盆3袋全部取出、混合作為一個重復，用于檢測殘茬的殘留量及木質素纖維素降解率。用內徑2 cm土鉆在相同時期從B組取0—15 cm深的混合土樣，同時在播種第20天時從B組也取土樣用于內生真菌B3含量分析。土壤樣品分為兩部分：用于測定土壤酚酸含量及降解酶活性的樣品4 ℃保藏，用于PCR定量分析的土壤樣品凍干后-20 ℃保藏。

1.2.2 酚酸類物質的搖瓶降解

內生真菌B3對4-羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 4-HBA)的降解先前已經(jīng)研究，證明了內生真菌B3可以對其高效降解[22]。但是，不同酚酸有著復雜的結構多樣性，內生真菌B3是否對土壤多樣的酚酸類物質具有廣譜高效的降解能力，還需要直接的研究證據(jù)，因此本文設計以下試驗(選用酚酸同1.2.1)：

取2 mL菌絲懸浮液(1.1)分別接種到2種不同碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中(2 g/L NaNO3，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KCl，0.5 g/L MgSO4，0.01 g/L FeSO4，pH值 6.0)，碳源分別為50 mg/L香草酸(VA)和50 mg/L香豆酸(p-CA)，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)2 d。一部分菌絲抽濾，60 ℃烘干48 h測干重，另一部分菌絲作為相應酚酸類物質降解的種子液。取2 mL種子液(大約1.1—1.2 mg/L的B3菌絲)，接種到50 mL分別以200 mg/L VA和p-CA作為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min 培養(yǎng)，每24 h收集1次發(fā)酵液檢測酚酸的殘留量，同時過濾獲得B3菌絲，蒸餾水洗滌3次后60 ℃烘干48 h測真菌生物量。以不添加內生真菌B3作為對照，所有的試驗組每個時間取樣點均設3個重復。

1.3 分析方法

1.3.1 花生殘茬的殘留量及木質素纖維素含量檢測

網(wǎng)袋取出后，將網(wǎng)袋中剩余花生殘茬置于60 ℃條件下烘干至恒重，稱量并計算殘茬的殘留量。殘茬中木質素和纖維素含量分別采用濃硫酸法和濃硫酸水解定糖法檢測[23]。

1.3.2 土壤及發(fā)酵液中酚酸含量檢測

土壤中酚酸類物質浸提方法參照Hartley[24]，土壤浸提液和搖瓶試驗收集的發(fā)酵液過0.22 μm纖維素薄膜后使用HPLC測定[22]。

1.3.3 土壤降解酶活性檢測

漆酶(Laccase)、錳過氧化物酶(Manganese peroxidase, MnP)和木質素過氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)活性檢測分別取1 g新鮮土樣置于50 mL離心管，注入9 mL相應緩沖液(漆酶：磷酸鹽緩沖液，pH值 6.0；MnP：乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值4.0；LiP：酒石酸鈉緩沖液，pH值3.0)，搖床震蕩10 min(28 ℃ 180 r/min)，取出后離心5 min(3500 r/min 4 ℃)，上清液即為粗酶液。

酶活測定體積為6 mL。漆酶檢測體系包括緩沖液3.7 mL，10 mmol/L ABTS(2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑璘- 6-磺酸)0.3 mL，粗酶液2 mL。MnP測定體系包括相應緩沖液，0.2 mmol/L MnSO4，0.1 mmol/L H2O2，0.4 mmol/L愈創(chuàng)木酚，2 mL粗酶液。LiP測定體系包括相應緩沖液，20 mmol/L藜蘆醇，54 mmol/L H2O2，2 mL粗酶液。所有反應均在28 ℃水浴鍋中反應3 min，隨后立即轉入冰水中終止反應。紫外分光光度計測定420 nm、465 nm和310 nm處吸光值的變化來分別反應漆酶、MnP和LiP活性。定義1 min氧化1 μmol ABTS所需的酶量為1個漆酶活力，1 min氧化1 μmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為1個MnP活力, 1min氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量為1個LiP活力，單位為U/g干土。每個樣品3個重復，以煮沸滅活粗酶液為對照[25- 26]。

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性檢測取1 g新鮮土樣，置于50 mL三角瓶中，注入10 mL 1%鄰苯三酚溶液，震蕩(30 ℃ 180 r/min)2 h。取出后加4 mL pH值 4.5檸檬酸-磷酸緩沖液，再加入35 mL乙醚，用力搖蕩數(shù)次，萃取30 min。最后，將含溶解的紫色沒食子素的乙醚相進行比色，比色波長為430 nm。PPO活性以2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的毫克數(shù)來表示。每個樣品3個重復，以石英砂作為對照[27]。

1.3.4 DNA提取和實時定量PCR

為了探究內生內生真菌B3在土壤中的存活狀況及花生不同生長時期土壤中含量的變化趨勢，設計如下試驗：

內生真菌B3 DNA提取方法參照Shishido[28]，提取的內生真菌B3基因組DNA稀釋10倍以減少PCR擴增的抑制物。使用UltraCleanTMSoil DNA Isolation Kit(Mo BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)提取土壤總DNA。使用特異性引物Bf1(5′-CTG GCC CCC TCG GGG TCC CTG G- 3′)和Br1(5′-TTT CAG GGC CTG CCC TTT TAC AGG C- 3′)擴增B3菌的一段ITS序列(轉錄間隔區(qū)；B3菌株ITS序列號HQ285146)[22]，擴增片段為長度為320 bp。實時定量PCR擴增使用定量PCR儀(ABI step one, USA)，標準曲線制作及擴增反應體系參照文獻[29]。

1.3.5 花生農(nóng)藝指標檢測

花生收獲時，測定花生株高、主根長、分支數(shù)、莢果產(chǎn)量(干重)、秸稈質量(干重)和根瘤數(shù)，莢果產(chǎn)量為每盆花生莢果的總質量，根瘤數(shù)為每盆花生的總根瘤數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖。采用SPSS13.0軟件進行方差分析(One-Way ANOVA)分別檢驗不同處理和不同時間段之間的差異顯著性，并用Duncan法進行多重比較。

2 結果

2.1 施加內生真菌B3對花生殘茬腐解的影響

表1可知，整個取樣時期CK和B3-處理在殘茬殘留量、纖維素木質素降解率之間無顯著差異。CK、B3-和B3+處理殘茬腐解的變化趨勢相似，殘茬分解主要都集中在萌發(fā)期和苗期，而從開花期至成熟期，殘茬腐解率增加速度都較為緩慢。但是，B3+處理在萌發(fā)期和苗期就表現(xiàn)出顯著加速殘茬分解的作用，比CK分別提高了12.0%和14.7%；成熟期殘茬腐解率達到84.5%，比CK提高了19.8%。同時，B3+處理花生殘茬纖維素和木質素的降解率也顯著大于CK，在萌發(fā)期纖維素和木質素降解率分別為43.1%和30.4%，比CK提高了13.7%和21.2%；在苗期比CK分別提高了17.8%和26.0%；成熟期花生殘茬纖維素和木質素降解率分別為85.2%和71.6%，比CK提高了11.4%和13.8%。上述結果說明施加內生真菌B3可以在較短的時間內加快土壤中花生殘茬腐解。

表1 土壤中施加Phomopsis liquidambari (B3) 對花生殘茬腐解的影響

2.2 施加內生真菌B3對土壤酚酸含量的影響

表2可知，花生整個生育期B3-處理土壤中4-羥基苯甲酸(4-HBA)、香草酸(VA)和香豆酸(p-CA)含量變化與CK間無顯著差異。從萌發(fā)期到結莢期，CK和B3+處理土壤中4-HBA含量在各生育期之間發(fā)生顯著變化，CK中4-HBA的釋放量隨時間延長而增加并在結莢期達到最大值，比播種前增加了44.9%。B3+處理4-HBA含量則在苗期達到最大值(比CK同期增加46.4%)，隨后逐漸下降，結莢期時含量與播種前基本相似。CK和B3+處理不同生育期土壤中VA和p-CA含量也發(fā)生顯著變化，主要區(qū)別為從播種前至結莢期，CK土壤中VA和p-CA含量隨著生育期延長而顯著增加并在結莢期達到最大值，成熟期時VA和p-CA含量與結莢期相比顯著降低，但仍比播種前分別增加了32.0%和34.7%。B3+處理土壤中VA和p-CA含量從萌發(fā)期開始逐漸增加，并都在苗期都達到最大值，隨后都顯著下降，且成熟期與播種前相比VA和p-CA含量分別下降了14.7%和13.5%。總體看來花生不同生育期土壤中酚酸含量隨著花生殘茬腐解程度差異而不同；在相同生育期，土壤酚酸含量則顯著受到接種內生真菌B3的影響，且與CK相比，苗期之前B3+處理顯著加快殘體中酚酸類物質的釋放，開花期及之后，B3+處理土壤酚酸含量顯著降低。

表2 施加Phomopsis liquidambari (B3) 對土壤酚酸含量的影響

2.3 施加內生真菌B3對土壤中降解酶活性的影響

表3可知，3種酶活性變化趨勢在CK和B3-處理之間無顯著性差異。在花生不同生長階段，CK和B3+處理土壤漆酶、錳過氧化物酶(MnP)和木質素過氧化物酶(LiP)活性均發(fā)生顯著改變，表明相同處理下不同生育期土壤酶活性大小不同。從播種前到結莢期，CK中土壤漆酶和LiP活性隨著花生生育期緩慢增加并達到最大值，與CK相比，B3+處理則增加較快并在苗期達到最大值，而CK和B3+處理土壤MnP活性的最大值均在開花期。除此之外，B3+處理土壤漆酶、MnP和LiP的活性均顯著高于同期的CK，說明內生真菌B3的施加可以顯著增加土壤中殘茬降解酶系的活性，尤其是在苗期和開花期，在花生生長后期與CK相比B3+處理仍然保持相對較高的土壤酶活性。

表3可知，CK和B3-處理土壤PPO的活性大小及變化趨勢基本相似。在CK和B3+處理中，從萌發(fā)期至成熟期，花生不同生育階段土壤PPO活性大小顯著不同，主要趨勢為土壤PPO活性逐漸增加并在結莢期達到最大值(比CK同期提高了47.2%)，隨后開始下降，同時可以看出各生長階段B3+處理PPO活性均顯著大于CK，以及在花生成熟時B3+處理的PPO活性仍然相對較高，由此說明隨著花生生長土壤中內生真菌B3的施加有益于土壤PPO活性的增加。

表3 施加Phomopsis liquidambari (B3) 對土壤中漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和多酚氧化酶活性的影響

2.4 土壤中內生真菌B3含量的檢測

從CK、B3-和B3+ 3個處理土壤中分別提取土壤總DNA進行RT-PCR。在取樣的所有時間點內，CK和B3-處理都沒有檢測到內生真菌B3的存在，而在B3+處理，接種前并沒有檢測到內生真菌B3的基因組DNA，接種后檢測到B3的基因組DNA，并在第10 天時達到最高值5.43 log(pg DNA/g 干土)，隨后土壤內生真菌B3的基因組含量逐漸下降，在第30天時下降到0.21 log(pg DNA/g 干土)，而在第60天的土壤樣品中未能檢測到內生真菌B3的基因組DNA的存在(圖1)。

2.5 純培養(yǎng)條件下內生真菌B3對酚酸類物質的降解

表4顯示分別接種96 h和120 h后內生真菌B3對香草酸(VA)和香豆酸(p-CA)的降解率都達到99%以上，真菌生物量分別從1.2 mg/L和1.1 mg/L增加到556.7 mg/L和450.0 mg/L，同時未添加內生真菌B3的CK中VA和p-CA的濃度沒有顯著性改變。可以看出內生真菌B3對VA和p-CA的大量降解以及自身生物量的增加主要集中在24—72 h，0—24 h可能是內生真菌B3對新環(huán)境的調節(jié)適應階段，而72—96 h則主要集中于對VA和p-CA降解產(chǎn)物的進一步降解。由此說明內生真菌B3對花生連作土壤中多種酚酸類化感物質具有廣譜高效的降解能力。

圖1 B3+處理組土壤中Phomopsis liquidambari (B3) DNA含量

表4 Phomopsis liquidambari (B3) 對VA和p-CA的搖瓶降解

2.6 施加內生真菌B3對花生農(nóng)藝性狀的影響

表5可知，CK和B3-處理花生農(nóng)藝性狀之間的差異并不顯著。與CK相比，B3+處理花生主根長、莢果產(chǎn)量、秸稈干重以及根瘤數(shù)都有顯著的增加，其中莢果產(chǎn)量、秸稈干重和根瘤數(shù)分別增加了19. 9%、16.1%和21.9%。

表5 高花生殘茬土壤中施加Phomopsis liquidambari (B3) 對花生農(nóng)藝性狀的影響

3 討論

3.1 高花生殘茬土壤中施加內生真菌B3改善花生農(nóng)藝性狀的機理

Berg和McClaugherty把凋落物分解劃為早期階段、后期階段和限值階段[30]。自然環(huán)境中，作物殘茬腐解速率的快慢受多種因素制約，包括殘體自身的物理化學性質、氣候條件以及土壤微生物群落結構等[31]，其中殘茬本身木質素的含量是影響其分解速率和降解過程的重要因素，因為土壤中含有大量降解纖維素菌群，而降解木質素的微生物群體卻相對較少[18,32]。實驗表明在苗期之前B3+處理土壤中內生真菌B3含量較高并顯著促進花生殘茬腐解，殘茬腐解直接為土壤提供可溶性碳氮和其它營養(yǎng)元素，促進花生生長的同時也為土壤微生物的繁殖提供了豐富的營養(yǎng)。因此，內生真菌B3的施加可能優(yōu)化了土壤微生物區(qū)系，殘茬腐解過程中具有降解酶分泌能力的微生物群體大量增加，所以，即使苗期之后土壤內生真菌B3含量下降，但這種優(yōu)化作用基本已經(jīng)完成并有助于土壤中對花生殘茬腐解起關鍵作用的漆酶、MnP和LiP活性的提高。作物生長后期土壤中內生真菌B3已經(jīng)死亡以及先前添加的作物殘茬基本降解完全，土壤養(yǎng)分降低，使得具有降解酶分泌能力的微生物數(shù)量下降，酶活性降低，但是在花生成熟期土壤中降解酶活性與播種前相比仍然較高，主要原因可能是植株生長后期地上部分已開始衰老、枯死，植株本身的凋落物以及微生物菌群進入土壤，這些凋落物是后期多種微生物生長的能量來源，所以植株生長后期其土壤中降解酶的活性仍然相對較高。在苗期處理組，花生殘茬腐解產(chǎn)生的酚酸量達到最大值，顯著高于同期的CK，主要歸因于內生真菌B3自身對花生殘茬的降解能力及其對土壤微生物區(qū)系的調節(jié)功能。通常情況下，酚酸類物質作為化感物質當其含量超過閾值范圍時會顯著影響土壤微生態(tài)活性[33- 34]，進而對作物的生長產(chǎn)生較強的抑制作用[34]，然而本研究發(fā)現(xiàn)內生真菌B3的施加促進了花生殘茬的快速腐解，相應的土壤中對酚酸具有降解作用的酶類以及轉化酚類物質的PPO活性都顯著的增加，這些酶活性的增加對土壤中酚酸類自毒物質的降解及轉化具有重要的作用[35- 36]，同時在花生收獲時發(fā)現(xiàn)B3+處理花生莢果產(chǎn)量及根瘤數(shù)均比CK有顯著增加。已有報道土壤酚酸類物質的濃度在一定范圍內對植物生長具有調節(jié)作用[37]，土壤中短暫高濃度的酚酸類物質對幼苗的生長影響較小[19]，但是，從開花期至成熟期，CK土壤酚酸的含量逐漸增多，此時持續(xù)高濃度的酚酸類物質可能表現(xiàn)出較強的化感抑制作用因而被認為是花生產(chǎn)生連作障礙的主要原因之一[38]。然而在B3+處理，開花期和結莢期土壤酚酸含量與CK相比顯著降低，從而減少了化感物質的負面作用?；ㄉ_花期至結莢期根系開始被根瘤菌侵染逐漸形成根瘤，這一時期酚酸類化感物質的減少具有重要的意義[39]。因此，高花生殘茬土壤中施加內生真菌B3可以有效緩解殘茬腐解對花生生長的負面影響，主要通過減少酚酸的濃度、促進營養(yǎng)循環(huán)、調節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境從而改善花生的農(nóng)藝指標，達到減輕花生連作障礙的目的。

3.2 內生真菌B3短暫的腐生生活和潛在的生態(tài)調節(jié)功能

Osono和Promputtha指出不可能所有的內生真菌都能發(fā)展成為腐生生物，但是內生真菌在特殊的條件下可以轉換它們的生態(tài)角色并適應腐生生活，其在真菌分解者中比例大約為0—92%[40- 41]。自然條件下內生真菌B3離開宿主后可以進行營腐生生存，并且在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中具有較強的環(huán)境修復能力，主要包括改善土壤微生物群落結構、提高土壤酶活性、增加微生物量CN、減少病原菌數(shù)量及增加作物抗性和產(chǎn)量等[20,42- 44]。本研究表明高花生殘茬土壤中施加內生真菌B3可以顯著加快殘茬腐解并促進酚酸類物質釋放，調節(jié)殘茬降解及酚酸轉化相關酶系，同時搖瓶降解表明內生真菌B3對連作土壤多種酚酸類物質具有較強的降解效率。即使在復雜的土壤環(huán)境中，內生真菌B3一方面自身可以降解酚酸類化感物質，另一方面也可以改善土壤微生物區(qū)系進一步有利于多種微生物聯(lián)合對自毒物質的降解，緩解作物連作障礙的發(fā)生。由于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的高度復雜性，現(xiàn)階段關于內生真菌B3如何緩解作物連作障礙的機制還不完全清楚。推測可能原因如下：(1)內生真菌B3減輕了化感物質對植物生長的影響；(2)內生真菌B3的添加有利于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性的恢復，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提供適合作物生長的土壤微生態(tài)體系；(3)內生真菌B3在體外分泌一些營養(yǎng)物質促進作物生長[45]。

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Effects of an endophytic fungus on decay of peanut residues and phenolic acid concentrations in soil

XIE Xingguang1, DAI Chuanchao1, SU Chunlun1, ZHOU Jiayu1, WANG Hongwei1, WANG Xingxiang2,3,*

1JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforIndustrializationofMicrobialResources,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,China2KeyLaboratoryofSoilEnvironmentandPollutionRemediation,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China3JiangxiKeyLaboratoryofEcologicalResearchofRedSoil,EcologicalExperimentalStationofRedSoil,ChineseAcademyofSciences,Yingtan335211,China

Peanut residue in the soil is considered to be an obstacle to peanut replanting. We aimed to understand the effect of applying an endophytic fungus [Phomopsisliquidambari(B3)]on accelerating peanut residue decay, improving the micro-ecological environment in the soil, and alleviating an obstacle to peanut replanting as well as its possible mechanism. We investigated the dynamics of peanut residue decay, phenolic acid concentrations, and enzyme activities during peanut growth in a pot experiment, where peanut residues were added into soil. Results showed that applying endophytic fungus B3 (treatment B3+) significantly accelerated the decay of peanut residue at the peanut germination and seedling stages; the decay rate increased by 12.0%—14.7% and the degradation rate of cellulose and lignin increased by 13.7%—17.8% and 21.2%—26.0%, respectively, compared with controls (CK). From the flowering to maturation stages, the decay rate of peanut residues gradually decreased in treatment B3+, but remained higher than that in CK. In addition, the concentrations ofp-hydroxybenzoic acid (4-HBA), vanillic acid (VA), andp-coumaric acid (p-CA) in treatment B3+ were significantly greater than those in CK at the germination and seedling stages. This indicated that application of endophytic fungus B3 significantly promoted the release of phenolic acids during decay of peanut residues before the seedling stage.The concentrations of the three kinds of phenolic acids in CK were much greater than those in treatment B3+ from flowering to maturation stages, which were critical stages for peanut formation and disease control; a high concentration of phenolic acids was harmful to peanut growth. In treatment B3+, the activities of laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase, and polyphenol oxidase were all significantly greater than those in CK at the corresponding peanut growth period, and peanut pod yield increased by 19.9%, compared with CK. Increases in activities of soil enzymes, which were associated with decay of peanut residues in treatment B3+, should be beneficial to decay of peanut residues and accelerate conversion of harmful phenolic acid allelochemicals. However, there was no significant difference in the decay rate of peanut residues, phenolic acids concentrations, enzyme activities, and peanut pod yield between treatment B3 (applying sterilized endophytic fungus B3) and CK, indicating that the availability of the endophytic fungus B3 in soils is important. To further demonstrate the availability of B3 and its role in degradation of phenolic acids, a real-time quantitative polymerase chain reaction technique was used to monitor dynamics of endophytic fungus B3 during peanut growth. The biodegradability of B3 was also investigated in pure culture. The results showed that endophytic fungus B3 could adapt to a non-host environment and survive for about 30 d in soil containing higher amounts of peanut residues under natural conditions after detaching from its host. With 200 mg/L VA andp-CA as the sole carbon source, the degradation rate of VA for 96 h andp-CA for 120 h reached 99% after inoculation with B3, and the biomass of B3 increased gradually with time after inoculation. The results suggested that promoting the rapid degradation of peanut residues and regulating dynamics of phenolic acids should be important mechanisms for B3 to alleviate obstacles in peanut replanting.

peanut residues; continuous cropping obstacles; phenolic acids; endophytic fungus; soil enzyme activity

國家科技支撐計劃資助項目(2012BAD05B04); 國家自然科學基金資助項目(31370507, 30970523); 江蘇省高校自然科學研究重大項目(13KJA180003); 南京市科委工程中心創(chuàng)新能力提升項目(201105058)

2013- 08- 13;

2014- 06- 12

10.5846/stxb201308132074

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xxwang@issas.ac.cn

謝星光, 戴傳超, 蘇春淪, 周佳宇, 王宏偉, 王興祥.內生真菌對花生殘茬腐解及土壤酚酸含量的影響.生態(tài)學報,2015,35(11):3536- 3845.

Xie X G, Dai C C, Su C L, Zhou J Y, Wang H W, Wang X X.Effects of an endophytic fungus on decay of peanut residues and phenolic acid concentrations in soil.Acta Ecologica Sinica,2015,35(11):3536- 3845.