謝星光, 戴傳超, 蘇春淪, 周佳宇, 王宏偉, 王興祥

1 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210023 2 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所), 南京 210008 3 中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站, 江西省紅壤生態(tài)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鷹潭 335211

內(nèi)生真菌對(duì)花生殘茬腐解及土壤酚酸含量的影響

謝星光1, 戴傳超1, 蘇春淪1, 周佳宇1, 王宏偉1, 王興祥2,3,*

1 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210023 2 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所), 南京 210008 3 中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站, 江西省紅壤生態(tài)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鷹潭 335211

土壤中花生殘茬是導(dǎo)致連作障礙的原因之一。為了探討施加內(nèi)生真菌Phomopsisliquidambari(B3)對(duì)加速花生殘茬腐解、改善連作花生土壤環(huán)境、緩解花生連作障礙的作用及其可能機(jī)理，通過(guò)向土壤中添加花生(Archishypogaea)殘?bào)w，利用盆栽試驗(yàn)探討了施加B3對(duì)花生殘茬腐解率、土壤部分酚酸物質(zhì)和酶活性的影響。結(jié)果表明：與CK相比，在萌發(fā)期和苗期，添加B3處理顯著加快殘茬腐解，提高纖維素木質(zhì)素降解率，增加土壤中對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量；在花生整個(gè)生育期，施加B3顯著調(diào)節(jié)了土壤中漆酶、錳過(guò)氧化物酶(Manganese peroxidase, MnP)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性的動(dòng)態(tài)變化，這種變化有利于花生殘茬快速腐解和酚酸類化感物質(zhì)的及時(shí)轉(zhuǎn)化。開(kāi)花期之后施加B3處理土壤酚酸含量顯著降低，花生莢果增產(chǎn)19.9%。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明內(nèi)生真菌B3在土壤中30 d內(nèi)可以被檢測(cè)，并對(duì)復(fù)雜多樣的酚酸類物質(zhì)具有廣譜高效的降解能力。由此說(shuō)明，施加內(nèi)生真菌B3可以顯著加快連作土壤中花生殘茬腐解，進(jìn)而通過(guò)減少土壤酚酸含量來(lái)緩解由殘茬腐解引起的連作障礙。

花生殘茬; 連作障礙; 酚酸; 內(nèi)生真菌; 土壤酶活

花生是我國(guó)重要的油料作物，2011年我國(guó)花生播種面積450多萬(wàn)hm2，約占油料作物總面積的35%[1]。由于長(zhǎng)期連作，花生連作障礙比較普遍[2]。導(dǎo)致花生連作障礙的因素多種多樣[3- 5]，其中前茬花生殘?bào)w及其腐解物往往造成土壤功能和特性下降[6]、微生物區(qū)系失衡[7]、影響種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[8- 9]以及土傳病原菌增加等往往是抑制花生生長(zhǎng)的主要因素[2,10- 11]。土壤酚酸類化感物質(zhì)積累是作物殘茬腐解產(chǎn)生連作障礙的直接原因，主要通過(guò)影響植物細(xì)胞膜通透性[12]、礦質(zhì)元素吸收[13]、光合作用[14]及蛋白質(zhì)和DNA合成[15]等多種途徑直接抑制作物生長(zhǎng)。

內(nèi)生真菌是指生長(zhǎng)于植物組織細(xì)胞間，宿主不表現(xiàn)出感染癥狀的一類真菌[16]。前期發(fā)現(xiàn)，接種內(nèi)生真菌Phomopsisliquidambari(B3)15 d后，秸稈表面出現(xiàn)空洞和縫隙以及入侵到秸稈表面的B3菌體，木質(zhì)素的阻礙被去除從而顯著增強(qiáng)還田秸稈降解[17- 18]。B3在促進(jìn)茅蒼術(shù)(Atractylodeslancea)凋落物快速降解的初期階段還加快了4-羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 4-HBA)、香草酸(Vanillic acid, VA)和香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)的釋放[19]；連作花生土壤中施加內(nèi)生真菌B3可以顯著提高花生產(chǎn)量、增加花生根瘤數(shù)及改善土壤微生態(tài)環(huán)境[20]。但連作土壤施加內(nèi)生真菌B3后花生增產(chǎn)與秸稈腐解之間有無(wú)關(guān)系仍不清楚。因此，本文從施加內(nèi)生真菌B3在加速花生殘茬秸稈腐解、減少土壤酚酸含量的角度，進(jìn)一步探索其緩解花生連作障礙的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

香草酸(Vanillic acid, VA)和香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)均購(gòu)自Sigma公司，乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。

供試土壤：盆栽土壤取自江西省鷹潭市中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站，為紅黏土發(fā)育的紅壤(5—20 cm)，多年連作花生。土壤基本理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)18.43 g/kg，全氮0.83 g/kg，全磷0.62 g/kg，全鉀9.24 g/kg，堿解氮2.45 mg/kg，速效磷19.46 mg/kg，速效鉀243.52 mg/kg，pH值 5.6(1∶2.5 H2O)。

花生(Archishypogaea)：為江西省鷹潭市常規(guī)品種贛花5號(hào)。

花生殘?bào)w：2011年9月收獲贛花5號(hào)花生秸稈并曬干，將花生秸稈(粗蛋白13.2%，粗脂肪3.3%，粗纖維32.5%)剪成1 cm大小用于盆栽試驗(yàn)。

內(nèi)生真菌B3：為擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsisliquidambari)，分離自大戟科重陽(yáng)木(Bischofiapolycarpa)莖內(nèi)皮。內(nèi)生真菌菌種B3從PDA(馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基)斜面轉(zhuǎn)接至PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)好后一部分用于搖瓶降解試驗(yàn)，另一部分抽濾獲得菌絲，蒸餾水洗滌3次，取部分菌絲60 ℃烘干48 h測(cè)量干重，剩余部分用于DNA提取和施加到試驗(yàn)土壤中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)地點(diǎn)位于南京師范大學(xué)植物園(N 31°14′，E 118°22′)，試驗(yàn)盆缽直徑28 cm，高23 cm。盆栽試驗(yàn)土壤自然風(fēng)干后過(guò)2 mm篩 (土壤未作滅菌處理)。2012年5月15日裝土，每盆裝土6 kg，每盆施加尿素1.5 g、Ca3(PO4)23 g、KCl 2.5 g。盆缽埋入土壤，盆口距離地面2 cm。試驗(yàn)分為兩部分：A組用于探討花生殘茬腐解效果及木質(zhì)素纖維素降解率，共設(shè)3個(gè)處理：對(duì)照(CK)；土壤中添加內(nèi)生真菌B3(B3+)；土壤中添加滅活內(nèi)生真菌B3(B3-)。每盆折合菌絲干重2 g，同時(shí)用5 cm × 5 cm網(wǎng)格袋(孔徑1 mm)裝花生秸稈殘?bào)w5 g，每盆放3袋，置于表層土0—15 cm之間，網(wǎng)格袋之間不重疊。B組用于檢測(cè)土壤酚酸含量(檢測(cè)的酚酸為花生連作土壤中含量相對(duì)較高的4-羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸[21])、降解酶活性、內(nèi)生真菌B3含量及花生農(nóng)藝性狀，同樣設(shè)3個(gè)處理：對(duì)照(CK)；土壤中添加內(nèi)生真菌B3(B3+)；土壤中添加滅活內(nèi)生真菌B3(B3-)。每盆折合干菌絲2 g，同時(shí)添加15 g花生殘?bào)w并與深度0—15 cm的表層土壤拌勻。試驗(yàn)所有處理每個(gè)時(shí)間取樣點(diǎn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。隨后立即播種花生，每盆兩粒，保證日照和水分。

分別在播種前(第0 天)、花生萌發(fā)期(第10 天)、苗期(第30 天)、開(kāi)花期(第60 天)、結(jié)莢期(第90 天)和成熟期(第110 天)從A組土壤取出網(wǎng)袋，每盆3袋全部取出、混合作為一個(gè)重復(fù)，用于檢測(cè)殘茬的殘留量及木質(zhì)素纖維素降解率。用內(nèi)徑2 cm土鉆在相同時(shí)期從B組取0—15 cm深的混合土樣，同時(shí)在播種第20天時(shí)從B組也取土樣用于內(nèi)生真菌B3含量分析。土壤樣品分為兩部分：用于測(cè)定土壤酚酸含量及降解酶活性的樣品4 ℃保藏，用于PCR定量分析的土壤樣品凍干后-20 ℃保藏。

1.2.2 酚酸類物質(zhì)的搖瓶降解

內(nèi)生真菌B3對(duì)4-羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 4-HBA)的降解先前已經(jīng)研究，證明了內(nèi)生真菌B3可以對(duì)其高效降解[22]。但是，不同酚酸有著復(fù)雜的結(jié)構(gòu)多樣性，內(nèi)生真菌B3是否對(duì)土壤多樣的酚酸類物質(zhì)具有廣譜高效的降解能力，還需要直接的研究證據(jù)，因此本文設(shè)計(jì)以下試驗(yàn)(選用酚酸同1.2.1)：

取2 mL菌絲懸浮液(1.1)分別接種到2種不同碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中(2 g/L NaNO3，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KCl，0.5 g/L MgSO4，0.01 g/L FeSO4，pH值 6.0)，碳源分別為50 mg/L香草酸(VA)和50 mg/L香豆酸(p-CA)，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)2 d。一部分菌絲抽濾，60 ℃烘干48 h測(cè)干重，另一部分菌絲作為相應(yīng)酚酸類物質(zhì)降解的種子液。取2 mL種子液(大約1.1—1.2 mg/L的B3菌絲)，接種到50 mL分別以200 mg/L VA和p-CA作為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min 培養(yǎng)，每24 h收集1次發(fā)酵液檢測(cè)酚酸的殘留量，同時(shí)過(guò)濾獲得B3菌絲，蒸餾水洗滌3次后60 ℃烘干48 h測(cè)真菌生物量。以不添加內(nèi)生真菌B3作為對(duì)照，所有的試驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間取樣點(diǎn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 分析方法

1.3.1 花生殘茬的殘留量及木質(zhì)素纖維素含量檢測(cè)

網(wǎng)袋取出后，將網(wǎng)袋中剩余花生殘茬置于60 ℃條件下烘干至恒重，稱量并計(jì)算殘茬的殘留量。殘茬中木質(zhì)素和纖維素含量分別采用濃硫酸法和濃硫酸水解定糖法檢測(cè)[23]。

1.3.2 土壤及發(fā)酵液中酚酸含量檢測(cè)

土壤中酚酸類物質(zhì)浸提方法參照Hartley[24]，土壤浸提液和搖瓶試驗(yàn)收集的發(fā)酵液過(guò)0.22 μm纖維素薄膜后使用HPLC測(cè)定[22]。

1.3.3 土壤降解酶活性檢測(cè)

漆酶(Laccase)、錳過(guò)氧化物酶(Manganese peroxidase, MnP)和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)活性檢測(cè)分別取1 g新鮮土樣置于50 mL離心管，注入9 mL相應(yīng)緩沖液(漆酶：磷酸鹽緩沖液，pH值 6.0；MnP：乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值4.0；LiP：酒石酸鈉緩沖液，pH值3.0)，搖床震蕩10 min(28 ℃ 180 r/min)，取出后離心5 min(3500 r/min 4 ℃)，上清液即為粗酶液。

酶活測(cè)定體積為6 mL。漆酶檢測(cè)體系包括緩沖液3.7 mL，10 mmol/L ABTS(2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑璘- 6-磺酸)0.3 mL，粗酶液2 mL。MnP測(cè)定體系包括相應(yīng)緩沖液，0.2 mmol/L MnSO4，0.1 mmol/L H2O2，0.4 mmol/L愈創(chuàng)木酚，2 mL粗酶液。LiP測(cè)定體系包括相應(yīng)緩沖液，20 mmol/L藜蘆醇，54 mmol/L H2O2，2 mL粗酶液。所有反應(yīng)均在28 ℃水浴鍋中反應(yīng)3 min，隨后立即轉(zhuǎn)入冰水中終止反應(yīng)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定420 nm、465 nm和310 nm處吸光值的變化來(lái)分別反應(yīng)漆酶、MnP和LiP活性。定義1 min氧化1 μmol ABTS所需的酶量為1個(gè)漆酶活力，1 min氧化1 μmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為1個(gè)MnP活力, 1min氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量為1個(gè)LiP活力，單位為U/g干土。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，以煮沸滅活粗酶液為對(duì)照[25- 26]。

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性檢測(cè)取1 g新鮮土樣，置于50 mL三角瓶中，注入10 mL 1%鄰苯三酚溶液，震蕩(30 ℃ 180 r/min)2 h。取出后加4 mL pH值 4.5檸檬酸-磷酸緩沖液，再加入35 mL乙醚，用力搖蕩數(shù)次，萃取30 min。最后，將含溶解的紫色沒(méi)食子素的乙醚相進(jìn)行比色，比色波長(zhǎng)為430 nm。PPO活性以2 h后1 g土壤中紫色沒(méi)食子素的毫克數(shù)來(lái)表示。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，以石英砂作為對(duì)照[27]。

1.3.4 DNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

為了探究?jī)?nèi)生內(nèi)生真菌B3在土壤中的存活狀況及花生不同生長(zhǎng)時(shí)期土壤中含量的變化趨勢(shì)，設(shè)計(jì)如下試驗(yàn)：

內(nèi)生真菌B3 DNA提取方法參照Shishido[28]，提取的內(nèi)生真菌B3基因組DNA稀釋10倍以減少PCR擴(kuò)增的抑制物。使用UltraCleanTMSoil DNA Isolation Kit(Mo BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)提取土壤總DNA。使用特異性引物Bf1(5′-CTG GCC CCC TCG GGG TCC CTG G- 3′)和Br1(5′-TTT CAG GGC CTG CCC TTT TAC AGG C- 3′)擴(kuò)增B3菌的一段ITS序列(轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；B3菌株ITS序列號(hào)HQ285146)[22]，擴(kuò)增片段為長(zhǎng)度為320 bp。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增使用定量PCR儀(ABI step one, USA)，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及擴(kuò)增反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[29]。

1.3.5 花生農(nóng)藝指標(biāo)檢測(cè)

花生收獲時(shí)，測(cè)定花生株高、主根長(zhǎng)、分支數(shù)、莢果產(chǎn)量(干重)、秸稈質(zhì)量(干重)和根瘤數(shù)，莢果產(chǎn)量為每盆花生莢果的總質(zhì)量，根瘤數(shù)為每盆花生的總根瘤數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析(One-Way ANOVA)分別檢驗(yàn)不同處理和不同時(shí)間段之間的差異顯著性，并用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 施加內(nèi)生真菌B3對(duì)花生殘茬腐解的影響

表1可知，整個(gè)取樣時(shí)期CK和B3-處理在殘茬殘留量、纖維素木質(zhì)素降解率之間無(wú)顯著差異。CK、B3-和B3+處理殘茬腐解的變化趨勢(shì)相似，殘茬分解主要都集中在萌發(fā)期和苗期，而從開(kāi)花期至成熟期，殘茬腐解率增加速度都較為緩慢。但是，B3+處理在萌發(fā)期和苗期就表現(xiàn)出顯著加速殘茬分解的作用，比CK分別提高了12.0%和14.7%；成熟期殘茬腐解率達(dá)到84.5%，比CK提高了19.8%。同時(shí)，B3+處理花生殘茬纖維素和木質(zhì)素的降解率也顯著大于CK，在萌發(fā)期纖維素和木質(zhì)素降解率分別為43.1%和30.4%，比CK提高了13.7%和21.2%；在苗期比CK分別提高了17.8%和26.0%；成熟期花生殘茬纖維素和木質(zhì)素降解率分別為85.2%和71.6%，比CK提高了11.4%和13.8%。上述結(jié)果說(shuō)明施加內(nèi)生真菌B3可以在較短的時(shí)間內(nèi)加快土壤中花生殘茬腐解。

表1 土壤中施加Phomopsis liquidambari (B3) 對(duì)花生殘茬腐解的影響

2.2 施加內(nèi)生真菌B3對(duì)土壤酚酸含量的影響

表2可知，花生整個(gè)生育期B3-處理土壤中4-羥基苯甲酸(4-HBA)、香草酸(VA)和香豆酸(p-CA)含量變化與CK間無(wú)顯著差異。從萌發(fā)期到結(jié)莢期，CK和B3+處理土壤中4-HBA含量在各生育期之間發(fā)生顯著變化，CK中4-HBA的釋放量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加并在結(jié)莢期達(dá)到最大值，比播種前增加了44.9%。B3+處理4-HBA含量則在苗期達(dá)到最大值(比CK同期增加46.4%)，隨后逐漸下降，結(jié)莢期時(shí)含量與播種前基本相似。CK和B3+處理不同生育期土壤中VA和p-CA含量也發(fā)生顯著變化，主要區(qū)別為從播種前至結(jié)莢期，CK土壤中VA和p-CA含量隨著生育期延長(zhǎng)而顯著增加并在結(jié)莢期達(dá)到最大值，成熟期時(shí)VA和p-CA含量與結(jié)莢期相比顯著降低，但仍比播種前分別增加了32.0%和34.7%。B3+處理土壤中VA和p-CA含量從萌發(fā)期開(kāi)始逐漸增加，并都在苗期都達(dá)到最大值，隨后都顯著下降，且成熟期與播種前相比VA和p-CA含量分別下降了14.7%和13.5%?？傮w看來(lái)花生不同生育期土壤中酚酸含量隨著花生殘茬腐解程度差異而不同；在相同生育期，土壤酚酸含量則顯著受到接種內(nèi)生真菌B3的影響，且與CK相比，苗期之前B3+處理顯著加快殘?bào)w中酚酸類物質(zhì)的釋放，開(kāi)花期及之后，B3+處理土壤酚酸含量顯著降低。

表2 施加Phomopsis liquidambari (B3) 對(duì)土壤酚酸含量的影響

2.3 施加內(nèi)生真菌B3對(duì)土壤中降解酶活性的影響

表3可知，3種酶活性變化趨勢(shì)在CK和B3-處理之間無(wú)顯著性差異。在花生不同生長(zhǎng)階段，CK和B3+處理土壤漆酶、錳過(guò)氧化物酶(MnP)和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)活性均發(fā)生顯著改變，表明相同處理下不同生育期土壤酶活性大小不同。從播種前到結(jié)莢期，CK中土壤漆酶和LiP活性隨著花生生育期緩慢增加并達(dá)到最大值，與CK相比，B3+處理則增加較快并在苗期達(dá)到最大值，而CK和B3+處理土壤MnP活性的最大值均在開(kāi)花期。除此之外，B3+處理土壤漆酶、MnP和LiP的活性均顯著高于同期的CK，說(shuō)明內(nèi)生真菌B3的施加可以顯著增加土壤中殘茬降解酶系的活性，尤其是在苗期和開(kāi)花期，在花生生長(zhǎng)后期與CK相比B3+處理仍然保持相對(duì)較高的土壤酶活性。

表3可知，CK和B3-處理土壤PPO的活性大小及變化趨勢(shì)基本相似。在CK和B3+處理中，從萌發(fā)期至成熟期，花生不同生育階段土壤PPO活性大小顯著不同，主要趨勢(shì)為土壤PPO活性逐漸增加并在結(jié)莢期達(dá)到最大值(比CK同期提高了47.2%)，隨后開(kāi)始下降，同時(shí)可以看出各生長(zhǎng)階段B3+處理PPO活性均顯著大于CK，以及在花生成熟時(shí)B3+處理的PPO活性仍然相對(duì)較高，由此說(shuō)明隨著花生生長(zhǎng)土壤中內(nèi)生真菌B3的施加有益于土壤PPO活性的增加。

表3 施加Phomopsis liquidambari (B3) 對(duì)土壤中漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶活性的影響

2.4 土壤中內(nèi)生真菌B3含量的檢測(cè)

從CK、B3-和B3+ 3個(gè)處理土壤中分別提取土壤總DNA進(jìn)行RT-PCR。在取樣的所有時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，CK和B3-處理都沒(méi)有檢測(cè)到內(nèi)生真菌B3的存在，而在B3+處理，接種前并沒(méi)有檢測(cè)到內(nèi)生真菌B3的基因組DNA，接種后檢測(cè)到B3的基因組DNA，并在第10 天時(shí)達(dá)到最高值5.43 log(pg DNA/g 干土)，隨后土壤內(nèi)生真菌B3的基因組含量逐漸下降，在第30天時(shí)下降到0.21 log(pg DNA/g 干土)，而在第60天的土壤樣品中未能檢測(cè)到內(nèi)生真菌B3的基因組DNA的存在(圖1)。

2.5 純培養(yǎng)條件下內(nèi)生真菌B3對(duì)酚酸類物質(zhì)的降解

表4顯示分別接種96 h和120 h后內(nèi)生真菌B3對(duì)香草酸(VA)和香豆酸(p-CA)的降解率都達(dá)到99%以上，真菌生物量分別從1.2 mg/L和1.1 mg/L增加到556.7 mg/L和450.0 mg/L，同時(shí)未添加內(nèi)生真菌B3的CK中VA和p-CA的濃度沒(méi)有顯著性改變?？梢钥闯鰞?nèi)生真菌B3對(duì)VA和p-CA的大量降解以及自身生物量的增加主要集中在24—72 h，0—24 h可能是內(nèi)生真菌B3對(duì)新環(huán)境的調(diào)節(jié)適應(yīng)階段，而72—96 h則主要集中于對(duì)VA和p-CA降解產(chǎn)物的進(jìn)一步降解。由此說(shuō)明內(nèi)生真菌B3對(duì)花生連作土壤中多種酚酸類化感物質(zhì)具有廣譜高效的降解能力。

圖1 B3+處理組土壤中Phomopsis liquidambari (B3) DNA含量

表4 Phomopsis liquidambari (B3) 對(duì)VA和p-CA的搖瓶降解

2.6 施加內(nèi)生真菌B3對(duì)花生農(nóng)藝性狀的影響

表5可知，CK和B3-處理花生農(nóng)藝性狀之間的差異并不顯著。與CK相比，B3+處理花生主根長(zhǎng)、莢果產(chǎn)量、秸稈干重以及根瘤數(shù)都有顯著的增加，其中莢果產(chǎn)量、秸稈干重和根瘤數(shù)分別增加了19. 9%、16.1%和21.9%。

表5 高花生殘茬土壤中施加Phomopsis liquidambari (B3) 對(duì)花生農(nóng)藝性狀的影響

3 討論

3.1 高花生殘茬土壤中施加內(nèi)生真菌B3改善花生農(nóng)藝性狀的機(jī)理

Berg和McClaugherty把凋落物分解劃為早期階段、后期階段和限值階段[30]。自然環(huán)境中，作物殘茬腐解速率的快慢受多種因素制約，包括殘?bào)w自身的物理化學(xué)性質(zhì)、氣候條件以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等[31]，其中殘茬本身木質(zhì)素的含量是影響其分解速率和降解過(guò)程的重要因素，因?yàn)橥寥乐泻写罅拷到饫w維素菌群，而降解木質(zhì)素的微生物群體卻相對(duì)較少[18,32]。實(shí)驗(yàn)表明在苗期之前B3+處理土壤中內(nèi)生真菌B3含量較高并顯著促進(jìn)花生殘茬腐解，殘茬腐解直接為土壤提供可溶性碳氮和其它營(yíng)養(yǎng)元素，促進(jìn)花生生長(zhǎng)的同時(shí)也為土壤微生物的繁殖提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)。因此，內(nèi)生真菌B3的施加可能優(yōu)化了土壤微生物區(qū)系，殘茬腐解過(guò)程中具有降解酶分泌能力的微生物群體大量增加，所以，即使苗期之后土壤內(nèi)生真菌B3含量下降，但這種優(yōu)化作用基本已經(jīng)完成并有助于土壤中對(duì)花生殘茬腐解起關(guān)鍵作用的漆酶、MnP和LiP活性的提高。作物生長(zhǎng)后期土壤中內(nèi)生真菌B3已經(jīng)死亡以及先前添加的作物殘茬基本降解完全，土壤養(yǎng)分降低，使得具有降解酶分泌能力的微生物數(shù)量下降，酶活性降低，但是在花生成熟期土壤中降解酶活性與播種前相比仍然較高，主要原因可能是植株生長(zhǎng)后期地上部分已開(kāi)始衰老、枯死，植株本身的凋落物以及微生物菌群進(jìn)入土壤，這些凋落物是后期多種微生物生長(zhǎng)的能量來(lái)源，所以植株生長(zhǎng)后期其土壤中降解酶的活性仍然相對(duì)較高。在苗期處理組，花生殘茬腐解產(chǎn)生的酚酸量達(dá)到最大值，顯著高于同期的CK，主要?dú)w因于內(nèi)生真菌B3自身對(duì)花生殘茬的降解能力及其對(duì)土壤微生物區(qū)系的調(diào)節(jié)功能。通常情況下，酚酸類物質(zhì)作為化感物質(zhì)當(dāng)其含量超過(guò)閾值范圍時(shí)會(huì)顯著影響土壤微生態(tài)活性[33- 34]，進(jìn)而對(duì)作物的生長(zhǎng)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用[34]，然而本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌B3的施加促進(jìn)了花生殘茬的快速腐解，相應(yīng)的土壤中對(duì)酚酸具有降解作用的酶類以及轉(zhuǎn)化酚類物質(zhì)的PPO活性都顯著的增加，這些酶活性的增加對(duì)土壤中酚酸類自毒物質(zhì)的降解及轉(zhuǎn)化具有重要的作用[35- 36]，同時(shí)在花生收獲時(shí)發(fā)現(xiàn)B3+處理花生莢果產(chǎn)量及根瘤數(shù)均比CK有顯著增加。已有報(bào)道土壤酚酸類物質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)對(duì)植物生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用[37]，土壤中短暫高濃度的酚酸類物質(zhì)對(duì)幼苗的生長(zhǎng)影響較小[19]，但是，從開(kāi)花期至成熟期，CK土壤酚酸的含量逐漸增多，此時(shí)持續(xù)高濃度的酚酸類物質(zhì)可能表現(xiàn)出較強(qiáng)的化感抑制作用因而被認(rèn)為是花生產(chǎn)生連作障礙的主要原因之一[38]。然而在B3+處理，開(kāi)花期和結(jié)莢期土壤酚酸含量與CK相比顯著降低，從而減少了化感物質(zhì)的負(fù)面作用?；ㄉ_(kāi)花期至結(jié)莢期根系開(kāi)始被根瘤菌侵染逐漸形成根瘤，這一時(shí)期酚酸類化感物質(zhì)的減少具有重要的意義[39]。因此，高花生殘茬土壤中施加內(nèi)生真菌B3可以有效緩解殘茬腐解對(duì)花生生長(zhǎng)的負(fù)面影響，主要通過(guò)減少酚酸的濃度、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)循環(huán)、調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境從而改善花生的農(nóng)藝指標(biāo)，達(dá)到減輕花生連作障礙的目的。

3.2 內(nèi)生真菌B3短暫的腐生生活和潛在的生態(tài)調(diào)節(jié)功能

Osono和Promputtha指出不可能所有的內(nèi)生真菌都能發(fā)展成為腐生生物，但是內(nèi)生真菌在特殊的條件下可以轉(zhuǎn)換它們的生態(tài)角色并適應(yīng)腐生生活，其在真菌分解者中比例大約為0—92%[40- 41]。自然條件下內(nèi)生真菌B3離開(kāi)宿主后可以進(jìn)行營(yíng)腐生生存，并且在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中具有較強(qiáng)的環(huán)境修復(fù)能力，主要包括改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、提高土壤酶活性、增加微生物量CN、減少病原菌數(shù)量及增加作物抗性和產(chǎn)量等[20,42- 44]。本研究表明高花生殘茬土壤中施加內(nèi)生真菌B3可以顯著加快殘茬腐解并促進(jìn)酚酸類物質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)殘茬降解及酚酸轉(zhuǎn)化相關(guān)酶系，同時(shí)搖瓶降解表明內(nèi)生真菌B3對(duì)連作土壤多種酚酸類物質(zhì)具有較強(qiáng)的降解效率。即使在復(fù)雜的土壤環(huán)境中，內(nèi)生真菌B3一方面自身可以降解酚酸類化感物質(zhì)，另一方面也可以改善土壤微生物區(qū)系進(jìn)一步有利于多種微生物聯(lián)合對(duì)自毒物質(zhì)的降解，緩解作物連作障礙的發(fā)生。由于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的高度復(fù)雜性，現(xiàn)階段關(guān)于內(nèi)生真菌B3如何緩解作物連作障礙的機(jī)制還不完全清楚。推測(cè)可能原因如下：(1)內(nèi)生真菌B3減輕了化感物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)的影響；(2)內(nèi)生真菌B3的添加有利于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性的恢復(fù)，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提供適合作物生長(zhǎng)的土壤微生態(tài)體系；(3)內(nèi)生真菌B3在體外分泌一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)作物生長(zhǎng)[45]。

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Effects of an endophytic fungus on decay of peanut residues and phenolic acid concentrations in soil

XIE Xingguang1, DAI Chuanchao1, SU Chunlun1, ZHOU Jiayu1, WANG Hongwei1, WANG Xingxiang2,3,*

1JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforIndustrializationofMicrobialResources,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,China2KeyLaboratoryofSoilEnvironmentandPollutionRemediation,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China3JiangxiKeyLaboratoryofEcologicalResearchofRedSoil,EcologicalExperimentalStationofRedSoil,ChineseAcademyofSciences,Yingtan335211,China

Peanut residue in the soil is considered to be an obstacle to peanut replanting. We aimed to understand the effect of applying an endophytic fungus [Phomopsisliquidambari(B3)]on accelerating peanut residue decay, improving the micro-ecological environment in the soil, and alleviating an obstacle to peanut replanting as well as its possible mechanism. We investigated the dynamics of peanut residue decay, phenolic acid concentrations, and enzyme activities during peanut growth in a pot experiment, where peanut residues were added into soil. Results showed that applying endophytic fungus B3 (treatment B3+) significantly accelerated the decay of peanut residue at the peanut germination and seedling stages; the decay rate increased by 12.0%—14.7% and the degradation rate of cellulose and lignin increased by 13.7%—17.8% and 21.2%—26.0%, respectively, compared with controls (CK). From the flowering to maturation stages, the decay rate of peanut residues gradually decreased in treatment B3+, but remained higher than that in CK. In addition, the concentrations ofp-hydroxybenzoic acid (4-HBA), vanillic acid (VA), andp-coumaric acid (p-CA) in treatment B3+ were significantly greater than those in CK at the germination and seedling stages. This indicated that application of endophytic fungus B3 significantly promoted the release of phenolic acids during decay of peanut residues before the seedling stage.The concentrations of the three kinds of phenolic acids in CK were much greater than those in treatment B3+ from flowering to maturation stages, which were critical stages for peanut formation and disease control; a high concentration of phenolic acids was harmful to peanut growth. In treatment B3+, the activities of laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase, and polyphenol oxidase were all significantly greater than those in CK at the corresponding peanut growth period, and peanut pod yield increased by 19.9%, compared with CK. Increases in activities of soil enzymes, which were associated with decay of peanut residues in treatment B3+, should be beneficial to decay of peanut residues and accelerate conversion of harmful phenolic acid allelochemicals. However, there was no significant difference in the decay rate of peanut residues, phenolic acids concentrations, enzyme activities, and peanut pod yield between treatment B3 (applying sterilized endophytic fungus B3) and CK, indicating that the availability of the endophytic fungus B3 in soils is important. To further demonstrate the availability of B3 and its role in degradation of phenolic acids, a real-time quantitative polymerase chain reaction technique was used to monitor dynamics of endophytic fungus B3 during peanut growth. The biodegradability of B3 was also investigated in pure culture. The results showed that endophytic fungus B3 could adapt to a non-host environment and survive for about 30 d in soil containing higher amounts of peanut residues under natural conditions after detaching from its host. With 200 mg/L VA andp-CA as the sole carbon source, the degradation rate of VA for 96 h andp-CA for 120 h reached 99% after inoculation with B3, and the biomass of B3 increased gradually with time after inoculation. The results suggested that promoting the rapid degradation of peanut residues and regulating dynamics of phenolic acids should be important mechanisms for B3 to alleviate obstacles in peanut replanting.

peanut residues; continuous cropping obstacles; phenolic acids; endophytic fungus; soil enzyme activity

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAD05B04); 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370507, 30970523); 江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(13KJA180003); 南京市科委工程中心創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目(201105058)

2013- 08- 13;

2014- 06- 12

10.5846/stxb201308132074

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xxwang@issas.ac.cn

謝星光, 戴傳超, 蘇春淪, 周佳宇, 王宏偉, 王興祥.內(nèi)生真菌對(duì)花生殘茬腐解及土壤酚酸含量的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(11):3536- 3845.

Xie X G, Dai C C, Su C L, Zhou J Y, Wang H W, Wang X X.Effects of an endophytic fungus on decay of peanut residues and phenolic acid concentrations in soil.Acta Ecologica Sinica,2015,35(11):3536- 3845.