劉 星, 邱慧珍,*, 王 蒂, 張俊蓮, 沈其榮

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 蘭州 730070 3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 南京 210095

甘肅省中部沿黃灌區(qū)輪作和連作馬鈴薯根際土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)性差異評估

劉 星1, 邱慧珍1,*, 王 蒂2, 張俊蓮2, 沈其榮3

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 蘭州 730070 3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 南京 210095

甘肅省中部沿黃灌區(qū)是西北地區(qū)乃至全國重要的加工型馬鈴薯生產(chǎn)基地, 然而因集約化種植帶來的連作障礙問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到當(dāng)?shù)伛R鈴薯種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。采用大田試驗與PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技術(shù)相結(jié)合的方法, 并通過真菌的18S rDNA序列分析, 評估輪作(未連作)和連作條件下馬鈴薯根際土壤真菌群落在組成結(jié)構(gòu)上的差異, 以期為甘肅省中部沿黃灌區(qū)馬鈴薯連作的土壤障礙機(jī)理研究提供新證據(jù)。結(jié)果表明, 同輪作相比, 連作顯著降低了馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和植株生物量, 并且隨著連作年限的延長, 連作障礙也愈加嚴(yán)重。長期連作(6a)也導(dǎo)致馬鈴薯根冠比顯著增加和植株收獲指數(shù)的顯著下降。在根際土壤真菌的種群數(shù)量和多樣性上, 連作和輪作間無顯著差異, 但在群落組成結(jié)構(gòu)上差異明顯。真菌18S rDNA測序分析進(jìn)一步表明, 馬鈴薯連作較輪作相比增加了Fusariumsp.和Fusariumsolani以及Verticilliumdahliae的種群或個體數(shù)量，而這些真菌是導(dǎo)致馬鈴薯土傳病害的主要致病菌類型。根際土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu)的改變特別是與土傳病害有關(guān)的致病菌滋生可能是導(dǎo)致當(dāng)?shù)伛R鈴薯連作障礙的重要原因。

馬鈴薯; 輪作和連作; 真菌群落結(jié)構(gòu); 微生物多樣性

Evaluation on fungal community structure of rhizosphere soils of potato under

rotation and continuous cropping systems in Yellow River Irrigation Areas of

甘肅省中部沿黃灌區(qū)是西北地區(qū)乃至全國重要的加工型馬鈴薯生產(chǎn)基地, 當(dāng)?shù)伛R鈴薯種植主要呈現(xiàn)規(guī)?；C(jī)械化和集約化的特點, 經(jīng)營銷售模式通常以訂單農(nóng)業(yè)為主。隨著近年來農(nóng)產(chǎn)品價格的不斷走高和馬鈴薯消費逐步向高附加值產(chǎn)品轉(zhuǎn)變, 當(dāng)?shù)剞r(nóng)墾企業(yè)在滿足旺盛的訂單需求的同時也造成種植結(jié)構(gòu)相對單一、倒茬困難和馬鈴薯的多年連作[1]。這導(dǎo)致了植株生長發(fā)育受阻, 塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)下降, 特別是土傳病害猖獗等一系列的問題, 嚴(yán)重影響企業(yè)的種植效益。因而探明馬鈴薯種植的連作障礙機(jī)理, 進(jìn)而尋求緩解和克服馬鈴薯連作障礙的有效途徑對于促進(jìn)該地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意義和實踐價值。良好的土壤環(huán)境是作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ), 有關(guān)于連作土壤障礙因素的研究也已成為全球性熱點[2]。連作系統(tǒng)下土壤的生物相特別是微生物群落結(jié)構(gòu)的變化受到眾多研究者的關(guān)注。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 其在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的多樣性, 因而在能量傳遞, 養(yǎng)分循環(huán), 礦質(zhì)化和腐殖化, 以及污染物的降解等土壤一系列重要的生化過程中起著重要作用[3- 4]。早前的報道已經(jīng)證明[5- 7], 微生物群落結(jié)構(gòu)是表征健康高產(chǎn)土壤的重要因子, 同時也對于土傳病害的抑制具有重要的作用。結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的技術(shù)手段, 在甘蔗[8]、大豆[9]和黃瓜[10]上的研究已證明, 連作顯著影響根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu), 這可能是導(dǎo)致連作障礙產(chǎn)生的重要原因, 但在具體的微生物種類對連作的響應(yīng)特征上存在著不一致的結(jié)果, 可能是受作物品種和供試條件的差異所致。Lang等[11]在棉花上的研究證明連作條件下微生物群落結(jié)構(gòu)變化與土傳病害發(fā)生存在直接關(guān)系, Larkin等[12]在連作馬鈴薯的研究中也得到了相似的結(jié)論。然而, 連作系統(tǒng)下土壤微生物群落行為特征受作物品種、施肥、土壤、氣候條件等影響顯著[13- 17], 目前在國內(nèi)特別是西北主栽區(qū)有關(guān)于馬鈴薯連作的此類研究仍然缺乏, 且微生物群落結(jié)構(gòu)在馬鈴薯連作條件下的演變特征仍不明確。針對當(dāng)?shù)匾蜷L期連作而導(dǎo)致的諸如立枯病、干腐病和黃萎病等真菌類土傳病害嚴(yán)重的現(xiàn)象, 將土壤真菌群落結(jié)構(gòu)作為我們研究的重點。將輪作即未連作作為對照, 利用PCR-DGGE技術(shù)并結(jié)合真菌的18S rDNA基因測序, 比較輪作和連作條件下的馬鈴薯根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異, 旨在探明和揭示馬鈴薯連作障礙的土壤原因, 以期克服和消除連作障礙, 為該地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

田間試驗地點位于甘肅省中部沿黃灌區(qū)的白銀市景泰縣條山農(nóng)場, 當(dāng)?shù)赜谐渥愕乃春土己玫霓r(nóng)業(yè)灌溉條件。地理坐標(biāo)處于東經(jīng)103°33′—104°43′, 北緯36°43′—37°38′之間, 境內(nèi)海拔1274—3321 m, 屬溫帶大陸干旱氣候, 年平均氣溫為9.1 ℃, 無霜期在141 d左右。年平均降水量為185.6 mm, 年平均蒸發(fā)量為1722.8 mm。年平均日照時數(shù)2713 h, 全縣光熱資源豐富, 日照百分率62%, 太陽年平均輻射量147.8×4.184 kJ/m2, 年≥0 ℃的活動積溫3614.8 ℃, ≥10 ℃的有效積溫3038 ℃, 是我國除青藏高原外光熱資源最豐富的地區(qū)之一。供試土壤為灰鈣土, 質(zhì)地為砂壤。

1.2 試驗設(shè)計與方法

在條山農(nóng)場馬鈴薯種植區(qū)域內(nèi)選擇連作3a(CP3)和6a(CP6)的馬鈴薯種植地塊進(jìn)行田間試驗, 以玉米-馬鈴薯輪作地塊(即連作0a, 用RP表示)作為對照, 所選地塊均勻平坦整齊, 具有當(dāng)?shù)卮硇? 土壤基礎(chǔ)農(nóng)化性狀見表1。馬鈴薯栽培種植和施肥量均保持一致, 采用寬壟雙行覆膜種植, 播種前一天切種薯, 并用高錳酸鉀浸泡消毒, 壟寬1.35 m, 行距70 cm, 株距17 cm, 種植密度5605株/667m2。氮肥用量為210 kg N/hm2, N∶P2O5∶K2O比例為1.4∶1.0∶2.0, 化肥分別用15- 15- 15的復(fù)合肥、尿素和硫酸鉀。播種和施肥過程均采用機(jī)械化一次進(jìn)行, 而后由人工覆膜。不施用有機(jī)肥, 且所有化肥均在播種時一次性基施, 無追肥, 其余栽培、灌溉和田間管理措施均按農(nóng)場習(xí)慣方法統(tǒng)一進(jìn)行, 各地塊保持一致。4月25日播種, 8月30日收獲。供試材料為當(dāng)?shù)刂髟缘募庸ば婉R鈴薯品種大西洋, 由條山農(nóng)場提供。

表1 供試土壤耕層農(nóng)化性質(zhì)Table 1 Detailed description of 0—20cm topsoil agro-chemical properties before sowing of 2011 potato growing season in this study

1.3 樣品采集與分析

2011年馬鈴薯播種前采集土壤基礎(chǔ)土樣, 測定耕層土壤的基本農(nóng)化性狀。在馬鈴薯收獲時, 采用樣方取樣法, 在每個連作地塊隨機(jī)劃取3個樣方, 分別代表3次重復(fù), 每個采樣方內(nèi)選擇健壯程度和長勢一致的無病害馬鈴薯植株5株, 使用鐵鍬在盡量不破壞根系的前提下將植株整株挖出, 采集根際土壤樣品。采用抖土法取樣[18- 19], 每個樣方的5株馬鈴薯根際土壤樣品混合均勻, 每個處理得到3個混合樣本, 代表3次重復(fù), 密封好后貯存于-80 ℃冰箱中待提取土壤DNA。成熟收獲時, 進(jìn)行實測計產(chǎn), 調(diào)查農(nóng)藝性狀, 而后將植株整株挖出, 分根、莖、葉和塊莖四部分在105 ℃下殺青30 min, 80 ℃烘干, 稱量干物質(zhì)。

1.4 PCR-DGGE技術(shù)研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)1.4.1 土壤DNA提取

采用美國Mobio Laboratories公司生產(chǎn)的Mobio核酸純化試劑盒提取土壤DNA, 稱取0.25 g混勻土壤裝入提取柱中, 按照產(chǎn)品說明書上的步驟提取100 μL土壤DNA。同時采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA提取效果的檢測, 提取的土壤DNA總量大約在23 Kb左右。

1.4.2 真菌的PCR反應(yīng)條件

真菌的PCR反應(yīng)采用18S r DNA基因特異性通用引物: GC-Fungi (5′>CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG<3′) 和NS- 1 (5′>GTAGTCATATGCTTGTCTC<3′)[20]。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 其中1 μL模板, 2 μL 2 mmol/L dNTPs, 2.5 μL10× PCR-buffer, 2.5 μL 25 mmol/L Mg2+, 0.3 μL Taq DNA polymerase, 引物各0.5 μL, ddH2O為15.7 μL。 PCR反應(yīng)條件: 預(yù)變性94 ℃ 5 min, 繼而94 ℃ 45 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 32個循環(huán), 最后72 ℃延伸5 min, 10 ℃保溫。所得產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測, 真菌DNA的PCR產(chǎn)物片段長度在370 bp左右。

1.4.3 土壤真菌群落結(jié)果的DGGE分析

真菌PCR產(chǎn)物通過濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠, 變性梯度為25%—40%, 在D-Code DGGETM系統(tǒng)(Bio-Rad)中進(jìn)行電泳, 條件為80 V, 恒溫60 ℃, 在1× TAE中電泳16 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染, 膠片用加拿大產(chǎn)的Win RHIZOTM掃描系統(tǒng)成像, 所得圖像分辨率為14159×23279。譜帶分析采用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件Quantity One (4. 6. 2版)。

1.4.4 真菌多樣性指數(shù)計算

多樣性指數(shù)H的計算方法如下[11]:

式中,Pi=ni/N,ni為DGGE泳道第i條泳帶亮度峰值高度,N為泳道中所有泳帶亮度峰值高度的總和。

1.4.5 真菌DGGE圖譜的條帶測序及分析

將DGGE膠上的DNA條帶用無菌解剖刀切下后, 加入50 μL無菌水, 4 ℃靜置過夜。然后用不含GC夾子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系同1.4.2的描述, 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用AxyprepTMDNA Gel Extraction Kit(中國浙江)純化試劑盒進(jìn)行純化。采用PMDTM19-T Vector(TaKaRa Biotechnology Dalian Co., Ltd.)連接純化后的PCR產(chǎn)物。而后制備EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。取200 μL感受態(tài)細(xì)胞與10 μL連接好的DNA混勻, 冰浴放置30 min, 不時輕柔搖動。42 ℃靜止水浴90 s, 迅速放回冰中繼續(xù)冰浴2 min, 加入800 μL的LB液體培養(yǎng)基, 于37 ℃搖床上100 r/min培養(yǎng)1 h, 在含有終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素和40 μg/mL X-GAL的LB培養(yǎng)基平板上, 吸取100 μL培養(yǎng)液涂布, 共涂布3個平板, 37 ℃培養(yǎng)12—16 h, 觀察藍(lán)白斑, 白色菌落為陽性。挑取白色陽性克隆, 在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體試管中37 ℃培養(yǎng)過夜, 采用PMD19RV-M (5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG- 3′)和PMD19M13- 47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGT CACGAC- 3′)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為: 10× Buffer 2.5 μL, dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL, 引物(2.5 mmol/L)各 0.5 μL, MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL, 模板(菌液) 2 μL, Taq DNA聚合酶0.5 U, 加ddH2O補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 min, 進(jìn)入熱循環(huán), 95 ℃變性1 min, 54 ℃退火1.5 min, 72 ℃延伸2 min, 共35個循環(huán), 72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序, 將測序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在線查詢分析, 利用Blast軟件在GenBank中與其它的18S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析, 不同處理之間數(shù)據(jù)的多重比較采用Duncan新復(fù)極差方法完成; 圖表繪制在Excel 2007軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和植株田間農(nóng)藝性狀

馬鈴薯收獲時, 對塊莖產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因素以及植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查, 結(jié)果如表2所示?？梢钥闯? 同RP相比, 連作顯著降低了馬鈴薯塊莖產(chǎn)量, CP3和CP6分別降低47.83%和83.62%, 而CP6較CP3也顯著下降了68.60%。單株結(jié)薯數(shù)、單株結(jié)薯重量和平均單薯重是表征馬鈴薯塊莖產(chǎn)量的重要指標(biāo)。從表2可以看出, RP和CP3之間單株結(jié)薯數(shù)無顯著差異, 而CP6的單株結(jié)薯數(shù)較RP顯著下降了39.56%; 在單株結(jié)薯重量上, CP3和CP6較RP均有顯著的下降, 降幅分別為31.30%和70.23%; 而在平均單薯重量上, CP3和CP6較RP也分別顯著下降了35.00%和55.00%。統(tǒng)計分析表明, 本試驗中馬鈴薯塊莖產(chǎn)量的大幅度下降是3個產(chǎn)量構(gòu)成要素共同下降造成的。3個處理的塊莖產(chǎn)量與單株結(jié)薯數(shù)(R2=0.3524,P=0.0419)、單株結(jié)薯重量(R2=0.9226,P<0.0001)和平均單薯重量(R2=0.7454,P=0.0011)均有著顯著或極顯著的線性相關(guān)關(guān)系。馬鈴薯植株田間生長也受連作影響, 但其影響程度因連作歷史不同而異。在植株的株高和主莖數(shù)上, CP3較RP均無顯著差異, 而CP6在這兩項指標(biāo)上較RP分別顯著下降了27.67%和30.07%。而在植株莖圍上, 3個處理間無顯著差異。

表2 輪作和連作條件下馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和植株農(nóng)藝性狀的比較

Table 2 Comparison on tuber yield and field agronomic characteristics of potato plants under rotation and continuous monocropping system

同列不同字母表示差異5%顯著水平

2.2 馬鈴薯植株生物量

表3為3個處理馬鈴薯植株整株和不同器官的生物量以及根冠比和收獲指數(shù)的比較?？梢钥闯? 同輪作相比, 連作馬鈴薯顯著降低了植株生產(chǎn)力。同RP相比, CP3和CP6的整株生物量均有顯著的下降, 降幅分別高達(dá)39.52%和74.57%; 而就不同器官而言, 其生物量較RP也均有不同程度的下降, 特別是塊莖的生物量, CP3和CP6較RP分別顯著下降了41.37%和77.79%, 表明馬鈴薯植株的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力受連作影響嚴(yán)重。同時從表3中可看出, 植株的根冠比和收獲指數(shù)也受連作影響, 但其影響程度同樣也因連作歷史不同而異。CP3的植株根冠比和收獲指數(shù)同RP相比無顯著差異; 而CP6的根冠比較RP和CP3則分別顯著增加74.29%和43.53%, 收獲指數(shù)較RP和CP3也分別顯著下降13.25%和9.69%, 表明同輪作相比, 長期的馬鈴薯連作導(dǎo)致了植株干物質(zhì)分配上的差異。另外, 3個處理的塊莖產(chǎn)量與根冠比(R2=0.6704,P=0.0011)和收獲指數(shù)(R2=0.7108,P=0.0006)均有著極顯著的線性相關(guān)關(guān)系。

表3 輪作和連作條件下馬鈴薯植株生物量的比較Table 3 Comparison on biomass of potato plants under rotation and continuous monocropping system

表中生物量數(shù)據(jù)均為干重，根冠比為根系生物量與地上莖和葉片的生物量之和的比值，收獲指數(shù)為塊莖生物量與植株整株生物量的比值

2.3 馬鈴薯根際土壤真菌DGGE圖譜分析

微生物是反映土壤質(zhì)量的重要指標(biāo), 土壤功能的發(fā)揮與微生物群落組成和結(jié)構(gòu)聯(lián)系密切[21- 22]。本研究應(yīng)用DGGE技術(shù)分離真菌18S rDNA片段的PCR產(chǎn)物, 不同DNA片段遷移為若干條帶, 其DGGE圖譜如圖1所示。采用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件Quantity One對真菌DGGE圖譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), CP3和CP6根際土壤樣本的真菌條帶數(shù)量和多樣性指數(shù)較RP均無顯著性差異(表4)。盡管3個處理在塊莖產(chǎn)量和植株生物量上存在顯著差異, 但根際土壤真菌的種群數(shù)量和多樣性特征并未因連作而產(chǎn)生顯著的改變。聚類分析的結(jié)果如圖2所示, 表明RP根際土壤的真菌群落與CP6有著更高的相似性。

圖1 馬鈴薯根際土壤真菌18S rDNA片段的PCR產(chǎn)物DGGE圖譜

2.4 馬鈴薯根際土壤真菌條帶的基因測序分析

相同遷移位置的DGGE條帶在明暗程度上的差異能夠直接地反映土壤中特定種或?qū)俚奈⑸锏纳L趨勢變化[23]。受相同土壤質(zhì)地和氣候類型及環(huán)境因子的影響, 不同土壤樣本之間具有的許多共同的DGGE條帶, 這是因為供試土壤存在一些共有的微生物類型, 然而這些公共條帶的亮度也不相同; 另外, 一些非公共條帶也在特定泳道中出現(xiàn), 表明較同輪作相比, 連作馬鈴薯對根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的改變在DNA水平上已有所體現(xiàn), 并且真菌種群間的協(xié)同演替機(jī)制也受連作影響。為了進(jìn)一步地判斷不同種屬的真菌在輪作和連作條件下的行為特征, 我們對DGGE圖譜上的條帶進(jìn)行了割膠回收并測序, 詳細(xì)結(jié)果如表5所示。條帶F1、F4、F5、F7、F10、F12、F14和F20被鑒定為不可培養(yǎng)未知真菌。F9和F29被鑒定為不可培養(yǎng)的燒瓶狀屬未知真菌。F13和F17被鑒定為不可培養(yǎng)的未知真核生物。條帶F2被鑒定與內(nèi)生根毛霉具有較高的同源性(99%)。F6被鑒定為艾美蟲科的原生生物(同源性98%)。F8被鑒定為栗色單格孢(同源性99%)。條帶F11代表的微生物與白鼻癥真菌具有100%的同源性。條帶F15代表的真菌種類在數(shù)據(jù)庫比對中與羅耳阿太菌具有最相近的親源關(guān)系, 但是同源性相對較差, 只有90%。條帶F16代表的微生物與Cladosporiumbruhnei(Accession no. GU999983)具有100%的同源性, 其為枝孢霉屬真菌的一種。F27被鑒定為棕色枝頂孢(同源性98%)。條帶F18和F30均被鑒定為大麗輪枝菌(Accession no. DQ016556, 同源性均為99%), 為土蟲兆屬節(jié)肢動物的一種。另外, 與馬鈴薯病害有關(guān)的一些真菌致病菌也在基因測序鑒定中被發(fā)現(xiàn)。條帶F21和F22被鑒定為鐮刀屬的某些真菌(Accession no. FJ613599, 同源性分別為100%和99%), 鐮刀菌是引起馬鈴薯干腐病、枯萎病的主要土傳病害病原菌。F23被鑒定為茄病鐮刀菌(Accession no. JN166424, 同源性為99%)。條帶F24-F26均被鑒定為大麗輪枝菌(Accession no. AF104926, 同源性為97%—99%)。馬鈴薯黃萎病俗稱“早死病”, 即是主要由輪枝菌屬的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的一種嚴(yán)重的土傳及種傳病害, 寄主范圍達(dá)160種植物[24- 25]。

表4 輪作和連作條件下馬鈴薯根際土壤真菌DGGE圖譜條帶數(shù)量和多樣性指數(shù)的比較

Table 4 Comparison on band number and diversity index within fungal DGGE profiles of rhizosphere soils under rotation and continuous monocropping system

處理Treatment條帶數(shù)量Bandnumber多樣性指數(shù)DiversityindexRP23±1.53ab3.19±0.06abCP326±0.78a3.26±0.02aCP623±1.15b3.10±0.05b

圖2 馬鈴薯根際土壤樣本的18S rDNA 條帶圖譜的聚類分析

表5 真菌18S rDNA片段測序結(jié)果Table 5 The sequences of 18S rDNA fragments for selected bands within DGGE profile

從DGGE圖譜中可以看出, 在總共的9個泳道中, F21—F26所對應(yīng)的相同遷移位置的條帶在亮度上均有所變化, 表明這些微生物的生長受輪作和連作影響明顯, 為了進(jìn)一步了解其在數(shù)量上變化, 使用Quantity One軟件將不同條帶的亮度峰值高度提取出來并作為該種微生物數(shù)量的相對表征量, 進(jìn)而統(tǒng)計分析, 結(jié)果如表6所示。RP的3個根際土壤樣本的DGGE泳道中對應(yīng)Fusariumsp.和Fusariumsolani的3個DNA遷移位置均未檢測到條帶; 在CP3的泳道中只在一個DNA遷移位置檢測到條帶出現(xiàn); 而在CP6的泳道中3個DNA遷移位置均檢測到條帶且具有不同的亮度峰值高度, 這表明同輪作相比, 長時間的連作增加了馬鈴薯根際土壤中鐮刀屬真菌的種群數(shù)量及其個體數(shù)量。統(tǒng)計分析顯示, F24和F25所對應(yīng)的DGGE條帶的亮度峰值高度均表現(xiàn)為連作顯著高于輪作, 表明馬鈴薯連作較輪作相比能夠顯著增加兩種不同Verticilliumdahliae的數(shù)量; 而F26對應(yīng)的DGGE條帶的亮度峰值高度在3組供試的馬鈴薯根際土壤樣本間無顯著變化, 該結(jié)果表明馬鈴薯的連作在微生物個體水平上對Verticilliumdahliae產(chǎn)生影響, 而這種影響具有種間選擇性, 推測這可能與供試土壤在理化性狀上的局部空間異質(zhì)性和Verticilliumdahliae的種間生理差異有關(guān)。

表6 供試土壤的真菌DGGE圖譜F1—F26條帶的亮度峰值高度的比較Table 6 Comparison on OD value of F1—F26 bands within fungal DGGE profile of rhizosphere soils

3 討論

田間試驗的結(jié)果表明, 同輪作相比, 連作顯著降低了馬鈴薯的塊莖產(chǎn)量和植株生物量, 并且隨著連作年限的延長, 連作障礙的表現(xiàn)也愈加突出。同RP相比, CP3的塊莖產(chǎn)量和植株整株生物量分別下降48.73%和39.52%; 而CP6的塊莖產(chǎn)量和植株整株生物量較CP3進(jìn)一步下降68.60%和58.27%。另外, 長期的連作也造成馬鈴薯植株在根冠比和收獲指數(shù)上的顯著變化, CP6植株的根冠比較RP顯著增加74.29%, 而其收獲指數(shù)較RP則顯著下降13.25%, 表明馬鈴薯植株的干物質(zhì)分配受連作影響, 這同王晶英等[26]在連作大豆和吳正鋒等[27]在連作花生上的研究結(jié)果一致。根冠比的調(diào)整被認(rèn)為是作物應(yīng)對生物或非生物逆境的最基本的適應(yīng)策略之一, 而因長期連作而引起的土壤在理化或生物學(xué)性質(zhì)上的改變應(yīng)是導(dǎo)致根冠比出現(xiàn)受迫性變化的直接原因。作物連作障礙的原因傳統(tǒng)上被認(rèn)為是土壤的頹敗所導(dǎo)致, 這常常被描述為作物的忌地現(xiàn)象。在早前的報道中, 大量的學(xué)者從土壤理化性質(zhì)入手開展研究, 目前已取得一些共性的結(jié)論, 證明連作后會造成土壤酸化加劇, 土壤結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重, 表現(xiàn)為容重增大, 土壤通氣孔隙比例相對降低, 土壤含鹽量逐漸增加, 有次生鹽漬化的傾向, N、P、K的比例失調(diào)甚至根際虧缺, 同時土壤酶活性也顯著下降[28- 32], 這些結(jié)果從本試驗的供試土壤基礎(chǔ)農(nóng)化性質(zhì)中也有所體現(xiàn)。

隨著認(rèn)識的加深和學(xué)科間的交叉融合, 學(xué)者們將根際微生態(tài)的概念應(yīng)用到連作障礙的研究中來, 而微生物作為根際微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分因此受到格外地關(guān)注。本試驗采用PCR-DGGE的手段研究連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)特征, 將分子生物學(xué)技術(shù)引入到馬鈴薯連作障礙的研究中, 目前在西北地區(qū)尚屬首次。結(jié)果表明, 同輪作相比, 連作并未造成馬鈴薯根際土壤真菌種群數(shù)量和多樣性的顯著變化, 這與Li等[9]使用同樣的方法在東北地區(qū)連作大豆的研究結(jié)果一致。但Yao等[10]連作大棚黃瓜的研究表明連作種植較輪作相比顯著降低了微生物的豐富度和多樣性, 并認(rèn)為這種多樣性的降低可能是土壤有機(jī)質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量及分配上的差異所造成的。尤孟陽等[33]關(guān)于大豆、玉米和小麥的研究已證實, 連作導(dǎo)致土壤有機(jī)碳組分在空間上的重新分配, 改變了土壤碳的賦存特征, 特別是連作與自然恢復(fù)相比顯著降低了土壤游離態(tài)輕組有機(jī)碳的含量。Eskelinen等[34]的研究進(jìn)一步證明土壤有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量顯著影響微生物的群落組成和結(jié)構(gòu), 二者之間具有良好的線性相關(guān)關(guān)系。然而就本試驗而言, 微生物群落結(jié)構(gòu)對馬鈴薯連作的響應(yīng)行為是否直接與土壤有機(jī)質(zhì)的變化有關(guān), 特別是與對種植管理方式較敏感且轉(zhuǎn)化速度相對較快的的土壤輕組有機(jī)質(zhì)有關(guān)尚需進(jìn)一步地研究。而之所以會出現(xiàn)以上不一致的研究結(jié)果, 一方面可能受供試土壤類型和試驗區(qū)生態(tài)環(huán)境條件影響, 因為二者直接決定了作物根際的土著微生物的種類, 不同種屬或功能型的微生物對連作的敏感性和耐受性也截然不同; 另一方面應(yīng)與供試作物品種有關(guān), 這直接體現(xiàn)在根系分泌物種類和數(shù)量上, 根系分泌物能夠顯著影響根際微生物的活性和組成結(jié)構(gòu), 其任何細(xì)微的改變均能對根際微生物產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[35- 36], 盡管目前研究者對根系分泌物和微生物之間的互饋機(jī)理仍然缺乏足夠的認(rèn)識。

本研究表明, 盡管輪作和連作條件下馬鈴薯根際土壤真菌在種群數(shù)量和多樣性上無顯著差異, 但DGGE圖譜分析也充分證明二者在真菌群落組成結(jié)構(gòu)上差異明顯, 這可以從各條泳道的條帶亮度差異上體現(xiàn)出來。表明同輪作相比, 連作能夠顯著影響作物根際真菌群落結(jié)構(gòu), 而早前在不同作物上的相關(guān)報道[8- 10]也證實了這個結(jié)論, 并認(rèn)為這可能與作物連作障礙的產(chǎn)生有關(guān)。通過對DGGE條帶進(jìn)行割膠測序分析, 與馬鈴薯土傳病害有關(guān)的致病菌被鑒定出來, 如Fusariumsp.和Fusariumsolani以及Verticilliumdahliae。不同條帶的亮度峰值高度統(tǒng)計結(jié)果表明, 馬鈴薯的連作較輪作相比導(dǎo)致了鐮刀屬真菌在根際土壤中的富集, 而這在種群數(shù)量和個體數(shù)量上均有所體現(xiàn)。由鐮刀菌引起的干腐病是馬鈴薯貯藏期常見的真菌性病害之一, 在病薯中該病害所占比例較高[37]。牛秀群等[38]在與本試驗相同的研究區(qū)域采用微生物平板培養(yǎng)的方法也得出了類似的結(jié)果, 同時也證明隨著連作年限的增加, 馬鈴薯根際土壤不同鐮刀菌種的數(shù)量變化趨勢各異, 尖孢鐮孢、茄病鐮孢呈上升趨勢, 黃色鐮孢、再育鐮孢呈下降趨勢, 木賊鐮孢變化較為平穩(wěn)。尖孢鐮孢和茄病鐮孢一般都具有強(qiáng)寄生能力, 生活適應(yīng)性也較廣, 在澳大利亞、南非、美國等地都有嚴(yán)重發(fā)病的報道, 是致病力強(qiáng)的土傳病害病原[39]。由于DGGE技術(shù)的固有特點和DNA序列比對的精準(zhǔn)度問題, 本研究結(jié)果只能將微生物準(zhǔn)確定義到屬的水平, 因而在下一步的研究當(dāng)中, 將傳統(tǒng)微生物平板培養(yǎng)和定量PCR甚至高通量的土壤基因組測序等精準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合能有助于人們在更細(xì)微的微生物分類學(xué)水平上來理解連作和輪作馬鈴薯根際土壤的真菌群落的結(jié)構(gòu)性差異。

Verticilliumdahliae是導(dǎo)致植物黃萎病的主要致病菌。本試驗結(jié)果同時表明, 同輪作相比, 馬鈴薯的連作也導(dǎo)致了根際土壤Verticilliumdahliae(Accession no. AF104926, 同源性為98%—99%)數(shù)量的增加。有關(guān)于Verticilliumdahliae拮抗菌的篩選和應(yīng)用研究目前也有較多的報道, 主要以Bacillussubtilis為主, Luo等[20]和Lang等[11]通過將篩選到Bacillussubtilis經(jīng)二次固體發(fā)酵結(jié)合到有機(jī)類肥料中進(jìn)而施用到作物根際達(dá)到了較好的抑制作物土傳病害的目的。類似的研究如Zhang等[40]在黃瓜的枯萎病和Zhao等[41]在甜瓜的枯萎病上均有積極的報道, 這種將外源拮抗微生物引入到作物根際并結(jié)合充足的有機(jī)碳氮源補(bǔ)給實現(xiàn)其在根表的有效定殖的對土傳病害的生防策略也為我們在甘肅省中部沿黃灌區(qū)的馬鈴薯連作障礙土壤機(jī)理研究和連作障礙的防控研究中提供了新的思路。馬鈴薯的長期連作是否也會導(dǎo)致植株根際土著的有益微生物在種群數(shù)量或個體數(shù)量上的減少, 功能多樣性的衰退? 另外, 本研究中通過DGGE技術(shù)和DNA測序觀察到的一些與馬鈴薯土傳病害有關(guān)的致病菌數(shù)量的增加是否對應(yīng)著根際有益微生物數(shù)量的減少, 二者是否存在協(xié)調(diào)一致的關(guān)系? 這些猜測均需進(jìn)一步地研究核實。

4 結(jié)論

馬鈴薯的連作種植較輪作顯著降低了塊莖產(chǎn)量和植株的生物量以及經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力, 也改變了植株干物質(zhì)在地上和地下器官的分配。與輪作相比, 連作馬鈴薯根際真菌的種群數(shù)量和多樣性無顯著差異, 但真菌群落結(jié)構(gòu)上發(fā)生了顯著地變化, 這可能造成試驗區(qū)馬鈴薯連作障礙產(chǎn)生的原因之一。此外, 馬鈴薯連作增加了一些與土傳病害有關(guān)的真菌致病菌的種群或個體數(shù)量, 如Fusariumsp.和Fusariumsolani以及Verticilliumdahliae, 但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步地研究。

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Middle Gansu Province

LIU Xing1, QIU Huizhen1,*, WANG Di2, ZHANG Junlian2, SHEN Qirong3

1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China2CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China3CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The yellow river irrigation areas of middle Gansu Province is one of the main processing potato growing regions in the Northwest China. Potato is often grown continuously by Gansu farmers and planting enterprises eager to maximize consecutive payoffs. This practice results in the severe decline in tuber yield and loss of tuber chemical qualities. Field studies was conducted to evaluate the differences in fungal community structure of rhizosphere soils of potato between rotation and continuous cropping systems in order to find the new evidence for the study on continuous cropping obstacle in Yellow River Irrigation Areas of Middle Gansu Province. In experimental site, three potato planting plots nearby each other were selected for this research, one is the rotation plot, namely, non continuous potato cropping, and two other plots had been continuously planted potato over 3 and 6 years, respectively. Rhizosphere soil samples were collected at 2011 potato harvest time, and then soil DNA was extracted. Subsequently, polymerase chain reaction (PCR)-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was performed to analyse fungal community structure. The results revealed that continuous potato cropping significantly decreased tuber yield and plant biomass compared with potato rotation, and more seriously with the continuous potato cropping duration. In addition, continuous potato cropping over long-term significantly increased the ratio of root to shoot and also caused the decline in economic productivity of potato crop. There were no significant differences in fungal population quantity and diversity indices of rhizosphere soils between rotation and continuous cropping systems, whereas the obvious shift in community structure occurred. Sequence analysis of fungal 18S rDNA gene confirmed that continuous potato cropping increased population quantity or individual number ofFusariumsp. andFusariumsolanias well asVerticilliumdahliae. Our results suggested that the decline of tuber yield and plant biomass in continuous potato cropping system might be associated with the change in fungal community structure of rhizosphere soils of potato, especially the increase in pathogen dynamic.

potato; rotation and continuous cropping; fungal community structure; microbial diversity

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103004); 國家科技支撐計劃(2012BAD06B03); 國家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS- 10-P18); 甘肅省科技重大專項(1102NKDA025)

2013- 08- 21;

2014- 07- 02

10.5846/stxb201308212122

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hzqiu@gsau.edu.cn

劉星, 邱慧珍, 王蒂, 張俊蓮, 沈其榮.甘肅省中部沿黃灌區(qū)輪作和連作馬鈴薯根際土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)性差異評估.生態(tài)學(xué)報,2015,35(12):3938- 3948.

Liu X, Qiu H Z, Wang D, Zhang J L, Shen Q R.Evaluation on fungal community structure of rhizosphere soils of potato under rotation and continuous cropping systems in Yellow River Irrigation Areas of Middle Gansu Province.Acta Ecologica Sinica,2015,35(12):3938- 3948.