陶濤秦新月馮金洲

·論 著·

低劑量米諾環(huán)素對(duì)腦缺血再灌注大鼠RGMa表達(dá)的影響☆

陶濤*秦新月*馮金洲*

目的探討靜脈用低劑量米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及排斥性導(dǎo)向分子（repulsive guidance molecule A,RGMa）表達(dá)的影響。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠54只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組和米諾環(huán)素組。采用大腦中動(dòng)脈線栓法制作局灶性腦缺血再灌注模型。再灌注第2周，分別采用免疫組織化學(xué)及Western blot法檢測(cè)缺血腦組織內(nèi)RGMa及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（growth associated pro?tein-43，GAP-43）蛋白的表達(dá)。缺血再灌注第2、7、14和28天，采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neu?rological severity score,mNSS）及樓梯實(shí)驗(yàn)（staircase test）評(píng)估大鼠神經(jīng)功能。結(jié)果同缺血再灌注組相比，低劑量米諾環(huán)素使缺血側(cè)大腦皮層RGMa蛋白表達(dá)降低（0.53±0.08 vs.1.17±0.15,P＜0.05），GAP-43蛋白表達(dá)明顯增高（0.94±0.10 vs.0.57±0.09,P＜0.05），大鼠mNSS評(píng)分顯著下降并改善大鼠的前肢運(yùn)動(dòng)功能（P＜0.05）。結(jié)論靜脈用低劑量米諾環(huán)素（3 mg/kg）能促進(jìn)大鼠缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與下調(diào)RG?Ma蛋白及上調(diào)軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)有關(guān)。

米諾環(huán)素再灌注損傷大鼠

lated to the down-regulation of RGMa expression and up-regulation of GAP-43 expression.【Key words】Minocycline Reperfusion injury Rats

米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類(lèi)抗生素，在臨床上被廣泛用于抗炎及抗感染治療。近期大量研究表明米諾環(huán)素在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型中具有保護(hù)作用[1]。盡管米諾環(huán)素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚不明確，但目前最新的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示米諾環(huán)素對(duì)人體是安全且可能是有益的[2]，并且是目前最有潛力的神經(jīng)保護(hù)劑之一。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型觀察米諾環(huán)素對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)、排斥性導(dǎo)向因子（repulsive guidance molecule A，RGMa）及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth associated protein-43，GAP-43）蛋白表達(dá)的影響，從而探討其潛在的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 動(dòng)物分組及給藥 54只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（I/R組）和米諾環(huán)素干預(yù)組（I/R+MC組），每組18只，分別進(jìn)行免疫印跡、免疫組化及大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。干預(yù)組在再灌注的同時(shí)按1 mL/ l00 g的比例尾靜脈注射米諾環(huán)素（3 mg/kg，Sigma公司），每日2次，持續(xù)14 d。

1.1.2 大鼠腦缺血再灌注模型的制作參照我們課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[3]，用線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注模型。術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.1.3 動(dòng)物取材術(shù)后2周，選取18只大鼠用水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟多聚甲醛灌流固定后，斷頭取腦，取缺血側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦組織（距額葉最前端5 mm到8 mm），石蠟包埋后制作成4 μm厚的冠狀切片，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。另取18只大鼠，深度麻醉后直接斷頭取腦，取缺血腦組織，置于凍存管中放入-80℃長(zhǎng)期保存，用于Western blot檢測(cè)。

1.1.4 免疫組化檢測(cè)蛋白的表達(dá)選取4 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，微波加熱修復(fù)表面抗原后參照S-P法試劑盒說(shuō)明書(shū)（北京中杉金橋公司）進(jìn)行免疫染色。DAB顯色陽(yáng)性結(jié)果在光鏡下可見(jiàn)棕黃色顆粒。每只動(dòng)物隨機(jī)選取10張非連續(xù)切片，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，然后用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.1.5 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將預(yù)存腦組織參照膜蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（南京凱基公司）提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h后加入特異性兔抗RGMa多克隆抗體（Cell Signaling公司）及兔抗GAP-43（武漢博士德公司）4℃孵育過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h，凝膠成像儀中顯影拍照，用Quantity One軟件分析各條帶平均光密度值，以待測(cè)蛋白/β-actin光密度的比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.1.6 行為學(xué)評(píng)分參照改良神經(jīng)功能評(píng)分（mNSS）[4]及Montoya設(shè)計(jì)[5]的“樓梯測(cè)試”對(duì)術(shù)后第2、7、14及28天的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能、前肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均（±s）表示，多組間比較運(yùn)用AVO?NA分析，兩兩比較行LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 米諾環(huán)素對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)未出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀。缺血再灌注第2天，米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與模型組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（10.67±1.03 vs.10.50±1.05,P＞0.05），而缺血再灌注第1、2和4周，米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠mNSS評(píng)分明顯低于缺血再灌注組（6.33±1.03 vs.7.50±1.22; 4.67±1.03 vs.6.83±0.75;3.33±0.52 vs.5.83±0.75;P＜0.05）；術(shù)前各組大鼠樓梯測(cè)試左前肢運(yùn)動(dòng)功能無(wú)明顯差異（P＞0.05），術(shù)后第2及4周，米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠左前肢抓取食物粒明顯多于缺血再灌注組（8.83±1.47 vs.6.33±1.75；9.33±1.21 vs.6.67± 1.03，P＜0.05，表1）。

2.2 米諾環(huán)素對(duì)腦缺血大鼠RGMa蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 免疫組化檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示RGMa蛋白均陽(yáng)性

表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜，呈棕色顆粒。假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)可見(jiàn)少量RGMa表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（22.00±6.32）。與正常組相比，缺血再灌注2周后，模型組（74.75±9.64）RGMa表達(dá)明顯增多（P＜0.05），米諾環(huán)素干預(yù)后RGMa表達(dá)量明顯降低（49.75±4.50，P＜0.05）（圖1）。

2.2.2 Western blot檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá) 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組RG?Ma蛋白表達(dá)量相對(duì)值為（0.31±0.29），缺血再灌注組為（1.17±0.15），米諾環(huán)素干預(yù)組為（0.53±0.08），模型組RGMa的表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.05），米諾環(huán)素干預(yù)組RGMa的表達(dá)明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05，圖3）。

2.3 米諾環(huán)素對(duì)腦缺血大鼠GAP-43蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 免疫組化檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43蛋白的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示假手術(shù)組皮質(zhì)可見(jiàn)少量GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞（19.25±3.40），GAP-43蛋白主要位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。缺血再灌注第2周，缺血再灌注組缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43（30.50±4.66）的表達(dá)同假手術(shù)組相比明顯降低（P＜0.05），米諾環(huán)素干預(yù)組GAP-43（59.25±8.22）的表達(dá)顯著增加，同缺血再灌注組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 Western blot檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，缺血再灌注第2周，模型組GAP-43蛋白的表達(dá)（0.57±0.09）高于假手術(shù)組（0.27±0.09），同缺血再灌注組相比，米諾環(huán)素干預(yù)組（0.94±0.10）GAP-43蛋白的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

3 討論

缺血性卒中患者殘留嚴(yán)重而持久的神經(jīng)功能障礙是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)（CNS）可塑性差，受損的軸突再生困難。目前的研究表明CNS軸突再生障礙的關(guān)鍵因素并不是因?yàn)樯窠?jīng)元完全喪失了內(nèi)源性再生的能力，而是因?yàn)樗鼈兲幱谝粋€(gè)不利于生長(zhǎng)的抑制性微環(huán)境[6]。CNS存在多種軸突再生抑制分子包括：硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs），No?go-A，髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG），少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)，Semaphorin，Ephrin及Slits等[7-8]。

圖1 大鼠缺血再灌注2周后缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa免疫組化染色（標(biāo)尺：50 μm）A假手術(shù)組；B缺血再灌注組；C米諾環(huán)素干預(yù)組

圖2 大鼠缺血再灌注2周后缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43免疫組化染色（標(biāo)尺：50 μm）A假手術(shù)組；B缺血再灌注組；C米諾環(huán)素干預(yù)組

圖3 Western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá) ①假手術(shù)組；②缺血再灌注組；③米諾環(huán)素干預(yù)組

表1 各組大鼠樓梯試驗(yàn)結(jié)果

RGMa是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的軸突再生抑制因子。人局灶性腦缺血和外傷性腦損傷后，病灶中

心及其周?chē)鶵GMa蛋白的表達(dá)升高[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血后RGMa基因和蛋白在缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬持續(xù)增高，給予RGMa特異性RNA干擾后可顯著促進(jìn)軸突再生，改善大鼠神經(jīng)功能[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血后第2周，缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa表達(dá)明顯增高，而GAP-43表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，表明RGMa可能參與腦缺血后軸突再生調(diào)節(jié)。米諾環(huán)素作為一種潛在在神經(jīng)保護(hù)劑，因其具有廣譜抗炎癥、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激及血管保護(hù)活性而得到廣泛關(guān)注[11]。以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示腹腔注射大劑量米諾環(huán)素可以促進(jìn)鼠腦缺血后神經(jīng)功能的改善[12-13]，Xu[14]等首次報(bào)道低劑量米諾環(huán)素也可以降低腦梗死體積。本研究前期研究也發(fā)現(xiàn)，尾靜脈給予低劑量米諾環(huán)素（3 mg/ kg）對(duì)大鼠缺血性腦損傷具有保護(hù)作用，可以減少腦梗死體積，降低血腦屏障的通透性，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及促炎因子HMGB1的釋放[15]。Kitaya?ma等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷后，米諾環(huán)素可以抑制病灶周?chē)∧z質(zhì)細(xì)胞的活化，使RGMa表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)軸突的再生。本研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射3 mg/kg的米諾環(huán)素，能改善大鼠局灶性腦缺血后mNSS及大鼠的前肢運(yùn)動(dòng)功能，同Xu[12]等報(bào)道一致。并進(jìn)一步采用免疫組化及免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，低劑量米諾環(huán)素可以抑制缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa的表達(dá)并促進(jìn)軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)。

綜上所述，尾靜脈給予低劑量（3 mg/kg）米諾環(huán)素可以促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與抑制缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá)，促進(jìn)軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步證明低劑量米諾環(huán)素對(duì)缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

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Effects of low dose minocycline on the expression of RGMa in a rat model of middle cerebral artery occlu?sion and reperfusion

.TAO Tao,QIN Xinyue,FENG Jinzhou.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China.Tel:023-89012478.

ObjectiveTo explore the effects of low dose intravenous minocycline on neurological function and the expression of RGMa in rats after focal cerebral ischemia reperfusion.MethodsFifty-five adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group,cerebral ischemia/reperfusion(I/R)group and minocycline-treat?ed group.The cerebral ischemia/reperfusion model was established by 2 h of middle cerebral artery occlusion.At 2 weeks after ischemia reperfusion,the expression levels of RGMa and growth associated protein 43(GAP-43)were ana?lyzed by using immunohistochemistry and Western blot,respectively.Neurological functional recovery was evaluated us?ing both the modified neurological severity score(mNSS)and staircase test at 2,7,14 and 28 d after ischemia reperfusion.ResultsMinocycline at a dose of 3 mg/kg via the caudal vein significantly reduced the expression of RGMa protein(0.53± 0.08 vs.1.17±0.15,P＜0.05)and enhanced the expression of GAP-43 protein(0.94±0.10 vs.0.57±0.09,P＜0.05)in isch?emic cortex 2 weeks after ischemia reperfusion.Moreover,minocycline could reduce mNSS and improve forelimb motor function when compared to the I/R group(P＜0.05).ConclusionsLow dose intravenous minocycline(3 mg/kg)can im?prove neurological functional recovery in a rat model of focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism may be re?

R743.31

A

2014-04-14）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.003

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：30770762）；四川省衛(wèi)生計(jì)生委資助項(xiàng)目（編號(hào)：140032）;四川省教育廳資助項(xiàng)目（編號(hào)：15ZA0168）；瀘州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2014S4506）

* 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（重慶 400016）

△ 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科