王小利，姜闖，劉建華，劉喜朋

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一種基于線性DNA片段同源重組的嗜鹽古菌高效基因敲除系統(tǒng)

王小利，姜闖，劉建華，劉喜朋

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200240

隨著功能基因組學(xué)研究的深入發(fā)展，基因敲除技術(shù)日益成為基因功能研究的重要手段。嗜鹽古菌易于培養(yǎng)，是研究古菌基因功能的良好模式菌株。雖然現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了多種嗜鹽古菌的遺傳操作系統(tǒng)，但基因敲除成功率不十分理想。這些遺傳操作方法基于篩選標(biāo)記，利用攜帶同源片段的環(huán)狀質(zhì)粒與基因組同源片段間的兩次同源重組，敲除目的基因。由于基于環(huán)狀質(zhì)粒和篩選標(biāo)記的經(jīng)典同源重組敲除方法在二次重組時(shí)，普遍存在回復(fù)到野生型菌株的可能，導(dǎo)致二次重組子中敲除目的基因的陽(yáng)性菌株比例較低。為了克服傳統(tǒng)同源重組技術(shù)的上述缺陷，文章建立了基于線性DNA片段的同源重組技術(shù)。該方法通過(guò)一次重組在目標(biāo)基因的下游引入一段上游同源片段和標(biāo)記，從而限定二次重組的發(fā)生部位只能在兩段上游同源片段之間，發(fā)生二次重組的重組子理論上都敲除了目標(biāo)基因。利用該方法，文章成功敲除了嗜鹽古菌的基因，陽(yáng)性克隆率達(dá)65%。這種線性DNA片段重組法為嗜鹽古菌的基因敲除提供了一種高效策略，便于嗜鹽古菌的基因改造。

嗜鹽古菌；基因敲除；同源重組；線性DNA重組

遺傳操作系統(tǒng)是基因敲除等分子遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，為了研究目的基因敲除后的各種表型，首先需要獲得目的基因敲除突變株。目前已在多種生物中建立了敲除目的基因的遺傳操作系統(tǒng)。為了加速認(rèn)識(shí)古菌的基因功能，目前成功建立了針對(duì)多種古菌的遺傳操作系統(tǒng)[1~4]。古菌傳統(tǒng)遺傳操作系統(tǒng)是基于尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型(?)和5-氟乳清酸抗性(5-FOA)的正負(fù)篩選標(biāo)記的pop-in/pop-out 基因敲除策略，環(huán)狀載體的一側(cè)同源臂與染色體上的同源區(qū)發(fā)生一次重組，導(dǎo)致載體整合到染色體中，即pop-in，尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株恢復(fù)為原養(yǎng)型。然后，通過(guò)分子內(nèi)重組，將帶有的載體去除，即pop-out，丟掉基因的菌株可以在含5-FOA的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在5-FOA平板生長(zhǎng)的菌株有兩種基因型：靶基因缺失及靶基因未缺失(即恢復(fù)到野生型)，需要通過(guò)分子雜交或PCR區(qū)分兩種基因型菌株[5,6]。目前具有相對(duì)成熟遺傳操作系統(tǒng)的古菌包括：沃氏嗜鹽富饒菌()[5,6]、地中海富鹽菌()[7]、西班牙鹽桿菌()[7,8]、嗜酸熱硫化葉菌()[9]、冰島硫化葉菌()[10]、激烈火球菌()[11]和棲熱球菌()[12]等。

嗜鹽古菌分離自死海，屬于古菌域廣古菌門嗜鹽富饒菌屬()，細(xì)胞為不規(guī)則的桿狀、盤狀或杯狀(1.0~3.0 μm×2.0~3.0μm)，具有鞭毛，可以運(yùn)動(dòng)。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境易于培養(yǎng)，最適培養(yǎng)條件為：18%鹽水培養(yǎng)基、溫度45℃。由于該菌是易于培養(yǎng)的好氧古菌，并已完成全基因組測(cè)序[13]，便于基因敲除操作，因此是研究古菌基因功能的良好模式菌株[2]。目前，已建立成熟高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[14]，現(xiàn)有基因敲除系統(tǒng)具有高效標(biāo)記基因[15,16]用于篩選突變株，并開(kāi)發(fā)了多種表達(dá)載體[17,18]。常用的古菌基因敲除技術(shù)基于尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型(?)和5-氟乳清酸抗性(5-FOA)的正負(fù)篩選標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因修飾。但現(xiàn)有的遺傳操作系統(tǒng)仍存在陽(yáng)性克隆率低等問(wèn)題，故本文基于現(xiàn)有系統(tǒng)，通過(guò)改進(jìn)用于同源重組的DNA分子形式，以敲除嗜鹽古菌的2基因?yàn)槔?，建立了一種基于線性DNA片段重組的嗜鹽古菌高效基因敲除系統(tǒng)，該技術(shù)可以促進(jìn)的基因組改造。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜鹽古菌菌株H26 (?)和基于pBluescript II質(zhì)粒骨架的敲除型質(zhì)粒pTA131(2+)由英國(guó)諾丁漢大學(xué)Thorsten Allers教授提供[18]，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 線性DNA片段重組法基因敲除原理

首先構(gòu)建敲除載體，然后PCR制備線性DNA片段。傳統(tǒng)的基因敲除法使用的敲除質(zhì)粒只在篩選標(biāo)記基因的任一側(cè)攜帶上下游各500 bp同源臂(圖1A)。線性DNA片段基因敲除法使用的敲除質(zhì)粒在2篩選標(biāo)記基因下游位置插入了目標(biāo)基因上下游500 bp融合同源臂，同時(shí)在上游位置插入一段目標(biāo)(target)基因3￠端500 bp序列，載體構(gòu)建結(jié)果如圖1B所示。PCR擴(kuò)增包含了目標(biāo)基因3￠端500 bp序列、基因、上下游500 bp同源臂，共計(jì)3段DNA序列的整段線性DNA片段。該線性DNA片段轉(zhuǎn)化菌株后，由于只有在目標(biāo)基因3￠端500 bp序列與下游同源片段間同時(shí)發(fā)生同源重組，標(biāo)記基因和上游片段才能夠同時(shí)被整合到基因組上。其中標(biāo)記基因在發(fā)生同源重組后，能夠在無(wú)尿嘧啶的平板上形成克??；在目標(biāo)基因下游引入的一段上游同源片段是唯一的一段可以發(fā)生二次重組的DNA同源序列，從而限定二次重組的發(fā)生部位只能在兩段上游同源片段間，發(fā)生二次重組的重組子理論上都敲除了目標(biāo)基因，如圖1C所示。

圖1 基于線性DNA同源片段的基因敲除原理

A：傳統(tǒng)基因敲除法的環(huán)狀載體模式圖；B：線性DNA片段基因敲除法的敲除載體模式圖；C：線性DNA片段基因敲除原理圖。

1.2.2基因敲除載體構(gòu)建

用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒(購(gòu)自天根生物科技有限公司)，提取H26基因組DNA，用質(zhì)粒小量提取試劑盒(購(gòu)自捷瑞生物科技有限公司)提取pTA131質(zhì)粒載體，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組和pTA131質(zhì)粒質(zhì)量和濃度。利用無(wú)縫克隆試劑盒(購(gòu)自上海遠(yuǎn)見(jiàn)生物科技有限公司)構(gòu)建敲除載體。采用重疊PCR技術(shù)獲得插入載體的上下游融合片段：即先用特異性引物擴(kuò)增目的基因上、下游各自500 bp同源序列，再用兩側(cè)引物進(jìn)行重疊PCR得到融合同源片段。利用克隆位點(diǎn)兩側(cè)的一對(duì)引物，通過(guò)PCR將pTA131載體線性化。線性化載體和待克隆DNA片段混合后，經(jīng)重組酶處理5~30 min，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL氨芐的LB平板。挑取單克隆于液體LB中培養(yǎng)，取1 μL菌液進(jìn)行菌落PCR，鑒定陽(yáng)性克隆。

插入了上下游同源片段的環(huán)狀質(zhì)粒可以直接用于傳統(tǒng)基因敲除的一次重組。而用于線性化DNA片段重組法的敲除質(zhì)粒在插入上下游同源片段后，需要繼續(xù)在標(biāo)記基因的另一側(cè)插入目的基因3′端長(zhǎng)500 bp的DNA片段。將構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒作為模板，利用表1中引物4和9通過(guò)PCR擴(kuò)增線性DNA同源片段，進(jìn)行一次重組。載體構(gòu)建過(guò)程中所用的KOD-plus DNA聚合酶購(gòu)自Toyobo公司，寡核苷酸引物(由Invitrogen公司合成)序列見(jiàn)表1。

1.2.3DNA轉(zhuǎn)化

具體操作方法參照文獻(xiàn)[14]。在Hv-YPC培養(yǎng)基中，45℃培養(yǎng)10 mL的H26至650=0.8，25℃下，6000 r/min離心8 min收集菌體；用2 mL緩沖型原生質(zhì)體化溶液(Buffered spheroplasting solution)輕柔地懸浮菌體，再次離心收集菌體；然后再次用600 μL的緩沖型原生質(zhì)體化溶液輕柔地懸浮菌體，將其分成3管，分別加入0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 20 μL，翻轉(zhuǎn)混勻，在室溫下放置10 min，讓其形成球狀體。同時(shí)準(zhǔn)備30 μL的DNA樣本溶液(10 μL DNA水溶液(線狀或環(huán)狀質(zhì)粒DNA 各1~2 μg，ddH2O作為陰性對(duì)照)、15 μL非緩沖型原生質(zhì)體化溶液(Unbuffered spheroplasting solution)、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)5 μL)和800 μL 60% PEG 600溶液(480 μL PEG600，320 μL非緩沖型原生質(zhì)體化溶液)。將DNA樣本加入到球狀體細(xì)胞溶液，取250 μL PEG600溶液，加入球狀體細(xì)胞，溫柔水平旋轉(zhuǎn)10 min，在室溫下放置30 min。然后加入1.5 mL原生質(zhì)體稀釋液(spheroplast dilution solution)，旋轉(zhuǎn)混勻后在室溫下放置2 min，25℃下，6000 r/min離心8 min棄上清；加入1 mL菌體活化溶液(regeneration solution)，不需要混勻；45℃靜置1.5~2 h后混勻，再在45℃旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)3~4 h。25℃下，6000 r/min離心8 min收集菌體，用轉(zhuǎn)化稀釋液(Transformant dilution solution)輕柔懸浮菌體，清洗2次，去除細(xì)胞中的尿嘧啶，最后用1 mL的轉(zhuǎn)化稀釋液輕柔重懸菌體；取100 μL稀釋10-0、10-1、10-2、10-3倍后涂布Hv-Ca平板，45℃培養(yǎng)5 d。

表1 構(gòu)建H. volcanii xpd2敲除質(zhì)粒的引物序列

注：酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)示，酶切位點(diǎn)依次為HⅠ(GGATCC)、RⅠ(GAATTC)、Ⅰ(CATATG)。

1.2.4基因敲除株鑒定

從一次重組平板上挑取3個(gè)單克隆于5 mL Hv-YPC培養(yǎng)基培養(yǎng)，用菌落PCR進(jìn)一步驗(yàn)證一次重組陽(yáng)性克隆，將一次重組陽(yáng)性克隆在Hv-YPC培養(yǎng)基中以1：500稀釋倍數(shù)傳代2~3次。將傳代后新鮮菌液(100 μL)稀釋10-2、10-3、10-4倍，涂布于含有50 mg/mL 5-氟乳清酸(5-FOA)和10 mg/mL 尿嘧啶(uracil)的Hv-Ca二次篩選平板。挑取20個(gè)二次篩選平板上的單克隆于5 mL Hv-YPC培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落PCR檢驗(yàn)基因是否被成功敲除。取1 μL菌液于99 μL ddH2O中稀釋，取1 μL稀釋液作為PCR模板。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括：1 μL稀釋后菌液，0.3 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs，2 mmol/L MgCl2，1×PCR緩沖液，5% DMSO，2.5 U rDNA 聚合酶(購(gòu)自TaKaRa公司)。PCR擴(kuò)增條件為：95℃10 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃3 min，30個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸5 min。

1.2.5基因敲除株表型分析

將成功刪除基因的敲除株接種于5 mL的Hv-YPC液體培養(yǎng)基中，45℃過(guò)夜培養(yǎng)至650≈0.4；用18%鹽水培養(yǎng)基將菌液梯度稀釋10–1~10–7倍，取20 μL菌液置于Hv-YPC平板表面，讓其自然晾干(大約20 min左右)；將接種的Hv-YPC平板(打開(kāi)平板蓋)在UV (254 nmol/L，1 J/m2/s)燈下，照射不同時(shí)間(0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、180 s、240 s)；將Hv-YPC平板置于黑色避光塑料袋，于45℃培養(yǎng)5~7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xpd2基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

載體具體構(gòu)建過(guò)程詳見(jiàn)材料方法部分，結(jié)果見(jiàn)圖2。首先將上下游融合DNA片段插入pTA131質(zhì)粒(圖2A)。首先成功擴(kuò)增出了基因兩側(cè)的上、下游同源DNA片段(圖2A(a)，泳道1和2)，長(zhǎng)度都是500 bp。通過(guò)重疊PCR，得到上、下游同源片段的融合DNA片段，長(zhǎng)度1 kb(圖2A(a)，泳道3)。為了進(jìn)行無(wú)縫克隆，在融合片段的兩側(cè)添加了15 bp的同源DNA序列，用于與線性化pTA131載體(圖2A(a)泳道4)雜交配對(duì)，形成重組DNA。上下游融合片段和線性化載體經(jīng)體外DNA重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化DH5α，菌落PCR表明陽(yáng)性克隆率達(dá)70%左右(圖2A(b))。插入上下游融合同源片段的載體命名為pTA131- UDxpd(可用于傳統(tǒng)基因敲除)。同理，在pTA131- UDxpd的基礎(chǔ)上再插入目標(biāo)基因編碼區(qū)3￠端的500 bp序列(圖2B)。目標(biāo)基因3￠端500 bp片段可以成功擴(kuò)增(圖2B(a)泳道1)，并在末端引入了用于無(wú)縫克隆的15 bp同源序列(圖2B(a)泳道2)。目的基因3￠端500 bp片段與PCR線性化的pTA131-UDxpd載體無(wú)縫克隆的陽(yáng)性克隆率為100%(圖2B(b))。最后，將構(gòu)建好的敲除載體作為模板，用下游同源片段與目標(biāo)基因3￠端片段的外側(cè)引物，在6個(gè)復(fù)性溫度梯度下PCR擴(kuò)增用于基因敲除的線性化DNA片段。6個(gè)復(fù)性溫度(53、54.5、57、、60、62、64℃)下3.0 kb的目的條帶均能夠有效擴(kuò)增，但存在一條短的非目標(biāo)帶(圖2C)。由于雜帶長(zhǎng)度只有1 kb左右，重組不會(huì)將基因整合到染色體上，因此，PCR產(chǎn)物純化后直接轉(zhuǎn)化H26感受態(tài)細(xì)胞。線性DNA重組片段含有3段DNA功能區(qū)(圖1B)，與染色體同源重組，使標(biāo)記基因和上游片段同時(shí)被整合到基因組上，菌株獲得基因型。

圖2 H. volcanii xpd2基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建

A：基因上下游融合同源片段的克隆。(a)：基因上下游500 bp同源序列和pTA131載體PCR結(jié)果。擴(kuò)增引物對(duì)依次為1和2(上游同源片段，泳道1)、3和4(下游同源片段，泳道2)、通用引物5和6(上、下游同源片段，泳道3)，7和8(線性化載體片段，泳道4)。(b)：基因上下游融合同源片段的基因克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。B：基因3￠端500 bp片段的克隆。(a)：基因3￠端500 bp片段和pTA131-UDxpd載體的PCR擴(kuò)增結(jié)果。泳道1：基因3′端500 bp片段；泳道2：兩端附加了用于無(wú)縫克隆的15 bp同源臂的基因的3￠端500 bp片段；泳道3：pTA131-UDxpd載體PCR線性化片段。(b)：基因3￠端500 bp片段的克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。C：用于基因敲除的線性化DNA片段制備。通過(guò)PCR(引物對(duì)9/4)制備用于轉(zhuǎn)化的線性化DNA片段，用于一次同源重組。泳道1~6是不同復(fù)性溫度(53℃、54.5℃、57℃、60℃、62℃、64℃)下的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 Xpd2基因敲除重組子的篩選

2.2.1 線性DNA片段基因敲除法一次重組篩選結(jié)果

5~7 d后，在一次重組Hv-Ca篩選平板長(zhǎng)出克隆，如圖3A。因?yàn)榫€性DNA片段重組法敲除時(shí)，DNA重組反應(yīng)必須同時(shí)發(fā)生在兩個(gè)同源片段之間，標(biāo)記基因才能整合到基因組，Hv-Ca平板才能長(zhǎng)出克隆，所以一次重組平板長(zhǎng)出的克隆數(shù)目不多，與傳統(tǒng)的同源重組法相比，克隆數(shù)目大大減少。隨機(jī)挑取3個(gè)克隆，用引物1和4進(jìn)行一次重組菌落PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3B。一次重組PCR結(jié)果顯示有兩條帶，一大一小。從圖1C線性DNA片段重組的原理圖中可以看出，發(fā)生一次重組時(shí)線性同源片段和基因組同源重組后整合在一起，存在兩段上游同源臂和一段下游同源臂，由于上游引物有兩處配對(duì)區(qū)，所以PCR時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩條帶：小條帶只由上下游同源片段構(gòu)成，長(zhǎng)約1 kb，產(chǎn)量高；大條帶包括待敲除序列、標(biāo)記基因、插入的上游500 bp同源序列，長(zhǎng)度接近3 kb，產(chǎn)量低。

2.2.2 二次重組篩選結(jié)果

由于基于線性DNA片段的一次重組使得目標(biāo)基因下游插入了一段上游同源序列，使得二次重組的發(fā)生部位只能在兩段上游同源片段間進(jìn)行。因此，發(fā)生二次重組的重組子理論上都敲除了目標(biāo)基因和標(biāo)記基因，都是陽(yáng)性克隆。圖4A是基因二次重組平板上的菌落生長(zhǎng)情況；圖4B是線性DNA 片段重組法20個(gè)二次重組克隆的菌落PCR鑒定結(jié)果，陽(yáng)性克隆率約為65%左右。圖C為利用環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行傳統(tǒng)基因敲除的菌落PCR結(jié)果，其中擴(kuò)增成功了7個(gè)克隆的菌落PCR，鑒定到2個(gè)克隆刪除了目標(biāo)基因，為陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆率為29%左右。從這一結(jié)果看出，基于線性DNA片段重組法敲除目的基因的成功率明顯增強(qiáng)。

圖3 xpd2基因敲除一次重組篩選結(jié)果

A：線性DNA片段基因敲除的一次重組形成的重組子平板生長(zhǎng)情況；B：一次重組菌落PCR鑒定結(jié)果。泳道1~3代表3個(gè)獨(dú)立的一次重組子；M：DNA marker。

圖4 xpd2基因敲除二次重組篩選結(jié)果

A：二次重組子的平板生長(zhǎng)情況；B：線性DNA片段同源重組法敲除基因的二次重組PCR鑒定結(jié)果(M：DNA marker；1~20為20個(gè)獨(dú)立的二次重組子的菌落PCR)；C：傳統(tǒng)同源重組法敲除基因的二次重組PCR鑒定結(jié)果(M：DNA marker；1~20為20個(gè)獨(dú)立的二次重組子菌落PCR)。

2.3 Xpd2基因敲除后的表型研究

基因位于主染色體的37234~ 39438區(qū)域，編碼一種DNA解螺旋酶，可能參與核苷酸切除修復(fù)和RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程[19~23]。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：刪除后，突變株的生長(zhǎng)表型與野生株沒(méi)有明顯變化。由于嗜鹽菌菌株中有兩個(gè)()基因，分別為(, HVO_1351)和,HVO_0039)，功能上可能存在冗余效應(yīng)。下一步研究將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除基因，獲得基因完全缺失型菌株，進(jìn)而從生長(zhǎng)表型等方面全面深入探究基因的功能。

3 討 論

目前常用的基因敲除方法都是基于環(huán)狀自殺質(zhì)粒的傳統(tǒng)同源重組法，由于在二次重組時(shí)存在回復(fù)到野生型菌株的可能，導(dǎo)致二次重組子中敲除目的基因的陽(yáng)性突變菌株比例很低，有時(shí)需要挑取幾十個(gè)克隆，才能篩選到陽(yáng)性克隆，甚至篩選不到陽(yáng)性克隆。本文建立了基于線性DNA片段的基因敲除技術(shù)，該方法一次重組時(shí)在目標(biāo)基因的下游引入一段上游同源片段和標(biāo)記，從而限定二次重組的發(fā)生部位只能發(fā)生在兩段上游同源片段間，使得發(fā)生二次重組的重組子理論上都敲除了目標(biāo)基因，理論上的陽(yáng)性克隆率達(dá)到100%。采用本文的線性DNA片段基因敲除方法，基因的敲除效率達(dá)到65%以上。目的基因敲除效率沒(méi)有達(dá)到100%的可能原因是基因自發(fā)突變或者污染了缺失型嗜鹽菌，這些突變或缺失的菌株都可以在5-FOA平板上生長(zhǎng)，但它們的2基因并未敲除。當(dāng)然，也有可能是單一基因敲除實(shí)驗(yàn)的誤差所致?？傊?，該方法比基于環(huán)狀質(zhì)粒的經(jīng)典基因敲除方法，敲除效率提高了2.2倍(圖4)。由此可見(jiàn)，線性DNA片段重組法顯著提高了基因敲除突變體的陽(yáng)性克隆率。由于嗜鹽菌H26生長(zhǎng)緩慢，需要5~7 d才能夠形成克隆，有效的基因敲除及鑒定技術(shù)對(duì)快速構(gòu)建突變株至關(guān)重要。本文綜合運(yùn)用線性DNA片段重組法和簡(jiǎn)單的菌落PCR鑒定技術(shù)，為快速獲得嗜鹽菌的基因敲除突變株提供了一種有效方法，對(duì)其他嗜鹽菌遺傳操作系統(tǒng)也具有一定借鑒作用。

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(責(zé)任編委: 何群)

An efficient genetic knockout system based on linear DNA fragment homologous recombination for halophilic archaea

Xiaoli Wang, Chuang Jiang, Jianhua Liu, Xipeng Liu

With the development of functional genomics, gene-knockout is becoming an important tool to elucidate gene functions. As a good model strain for archaeal genetics,has received more attention. Although several genetic manipulation systems have been developed for some halophilic archaea, it is time-consuming because of the low percentage of positive clones during the second-recombination selection. These classical gene knockout methods are based on DNA recombination between the genomic homologous sequence and the circular suicide plasmid, which carries aselection marker and two DNA fragments homologous to the upstream and downstream fragments of the target gene. Many wild-type clones are obtained through a reverse recombination between the plasmid and genome in the classic gene knockout method. Therefore, it is necessary to develop an efficient gene knockout system to increase the positive clone percentage. Here we report an improved gene knockout method using a linear DNA cassette consisting of upstream and downstream homologous fragments, and themarker. Gene deletions were subsequently detected by colony PCR analysis. We determined the efficiency of our knockout method by deleting thegene from thegenome, with the percentage of positive clones higher than 50%. Our method provides an efficient gene knockout strategy for halophilic archaea.

halophilic archaea; gene knockout; homologous recombination; linear DNA recombination

2014-10-24;

2015-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)31371260)資助

王小利，碩士，專業(yè)方向：DNA修復(fù)。E-mail: 650914@sjtu.edu.cn

劉喜朋，博士，副教授，研究方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail: xpliu@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-366

2015-3-11 9:17:12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0917.001.html