李迎迎，劉志廣，王麗，袁園園，劉平，王林嵩

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血清miRNAs作為食管鱗癌新的生物標(biāo)志物

李迎迎1，劉志廣2，王麗1，袁園園1，劉平2，王林嵩1

1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007； 2. 河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院腫瘤科，新鄉(xiāng) 453000

食管鱗癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。由于缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)食管鱗癌患者在確診時已到中晚期并預(yù)后不良。MicroRNAs(miRNAs)是一類可通過抑制其特異性靶基因表達(dá)從而調(diào)控食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的非編碼內(nèi)源性小RNA。相比于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物(例如mRNA和蛋白質(zhì))，miRNAs更加穩(wěn)定并易于篩選及精確地定量分析，從而成為理想的新一代癌癥早期診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。近來的研究結(jié)果顯示，食管鱗癌病人血清中的一些miRNAs表達(dá)水平的變化與病情診斷及預(yù)后的結(jié)果顯著相關(guān)。文章綜述了食管鱗癌病人血清中miRNAs的變化規(guī)律，討論了檢測這些miRNAs的表達(dá)水平變化作為一種新的方法應(yīng)用于食管鱗癌的早期診斷和預(yù)后評估的可能性。值得注意的是，不同的血清miRNAs的檢測方法所產(chǎn)生的結(jié)果是不完全一致的，文章還對這些差異產(chǎn)生的原因進(jìn)行了討論。

血清；miRNA；食管鱗癌

在世界范圍內(nèi)，食管癌的死亡率高居癌癥死亡率的第六位[1]，而男性的發(fā)病率是女性的3~4倍[2]。食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)發(fā)生在食管中部或上部1/3，是亞洲食管癌的主要病理亞型，約占食管癌的90%以上[3]。由于我國地處“食管癌帶”[2]，食管鱗癌的發(fā)病率和死亡率均居世界首位。在臨床上，食管鱗癌的早期診治可以顯著地改善病人的預(yù)后并降低死亡率，但目前尚缺乏食管鱗癌特異性的生物標(biāo)志物及有效的微創(chuàng)早期診斷方法[4]。故食管鱗癌患者在確診時已有50%以上為中晚期[5]，其5年生存率在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移時為20%~30%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時僅為13%[6]。盡管傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原、鱗狀細(xì)胞癌抗原已經(jīng)被用來早期診斷和檢測某些腫瘤的動態(tài)變化[7,8]，但這些血清腫瘤標(biāo)志物與食管鱗癌之間缺乏足夠的靈敏度和特異性。因此，尋找敏感、特異的食管鱗癌早期檢測的生物標(biāo)志物既是降低發(fā)病率和死亡率的迫切需求，也成為當(dāng)前研究的一個活躍 領(lǐng)域。

1 血清miRNAs作為食管鱗癌診斷的生物標(biāo)志物

食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[9,10]，到目前為止，雖然有報道發(fā)現(xiàn)基因突變存在于食管鱗癌患者中[11]，但這些基因突變與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展之間的因果關(guān)系并不明了，而且人們還尚未發(fā)現(xiàn)特異地誘發(fā)食管鱗癌病變的基因突變[10]。MicroRNAs(miRNAs)是一類在序列上高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，長約19~25個核苷酸[12,13]。miRNAs在許多基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[12,14]。每一個miRNA可以識別數(shù)百個靶基因的mRNAs，單個miRNA的失調(diào)可以影響整個基因網(wǎng)絡(luò)[14,15]。miRNAs基因總數(shù)遠(yuǎn)少于mRNAs，是易于篩選和驗(yàn)證的生物標(biāo)志物[15]。不同的癌癥類型具有特異miRNAs表達(dá)譜[16]。此外，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療中miRNAs異常變化可以闡明癌癥的演變機(jī)理。因此，越來越多的研究人員正在將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向miRNA和腫瘤之間的關(guān)系上。由于血清miRNA容易獲得，是一個相對無創(chuàng)的采樣方式[6,16]，同時由于血清miRNA非常穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可以抵抗RNase A的消化和苛刻的環(huán)境(如反復(fù)凍融、長時間室溫放置、過酸過堿、極端pH等)[17]，所以自2008年首次報道循環(huán)miRNA可作為潛在的腫瘤診斷工具后[18]，關(guān)于血清miRNAs作為診斷、預(yù)后和早期預(yù)測人類疾病的科學(xué)文獻(xiàn)呈現(xiàn)指數(shù)增長[19]。其中一些研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNAs含量具有腫瘤特異性改變，說明血清miRNAs具有作為癌癥生物標(biāo)志物的潛能[20]。

到目前為止，相對于血清miRNAs在其他癌癥類型的廣泛研究，它們在食管鱗癌中的研究匱乏。張春妮課題組以miR-25、miR-100、miR-193-3p、miR-194、miR-223、miR-337-5p、miR-483-5p為一組，在111例ESCC病人和111例正常人中檢測它們的含量變化和以miR-22、miR-100、miR-10a、miR-148b、miR-223、miR-133a、miR-127-3p為另一組，在290例ESCC病人和140例正常人中檢測它們的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些血清miRNAs在ESCC病人中含量均顯著高于正常人，而在其他腫瘤中無此變化，從而提出這兩種組合可作為食管鱗癌的診斷標(biāo)志物[6,21]。此外，許多研究對血清miRNAs受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve, ROC)進(jìn)行分析，并計算ROC曲線下面積(Area under curve, AUC)來評估候選的血清/血漿miRNAs對食管鱗癌的預(yù)測能力。對20種miRNAs ROC曲線分析表明，AUC范圍在0.593~1.000，敏感性在47.1%~88.6%，特異性在70%~100% (詳見表1)。AUC越接近1，準(zhǔn)確性越高[22]，相關(guān)文獻(xiàn)中AUC大多數(shù)都顯示較高的準(zhǔn)確性，而同一實(shí)驗(yàn)室測定相同血清miRNA的AUC，有時差別很大[21]。一種血清miRNA作為腫瘤診斷標(biāo)志物往往特異性較低，若測定多種miRNAs組合和miRNA表達(dá)譜可提高診斷的準(zhǔn)確性，但是后者測定費(fèi)時且費(fèi)用較高，影響其廣泛應(yīng)用。因此，選擇適當(dāng)?shù)膍iRNA測定其比率變化則可以用較少的測定獲得較高的準(zhǔn)確性。Komatsu等[7]研究結(jié)果顯示，用血漿中miR-21和miR-375含量的比率變化作觀測指標(biāo)，可以改善血漿的miRNA用作診斷的生物標(biāo)志物的靈敏度和特異性。相對單個miRNA的AUC，miR-21和miR-375含量比率的AUC值為0.816。在血漿中，miR-21 和miR-375含量的比率可以區(qū)分健康人和食管癌患者，具有88%的敏感性和70%的特異性。

表1 ESCC血清miRNA ROC曲線相關(guān)數(shù)據(jù)分析

注：“–”表示數(shù)據(jù)未詳細(xì)顯示；表達(dá)趨勢：食管癌病人與正常人血清miRNA相比含量增高(↑)或含量下降(↓)。

Wang等[31]用Meta-analysis方法進(jìn)行分析后認(rèn)為：食管鱗癌血清miRNAs可以作為一種新的微創(chuàng)、具有優(yōu)越診斷特性的生物標(biāo)志物。相比于唾液miRNAs，血漿/血清miRNAs具有更好的診斷特性。

2 血清miRNAs作為食管鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物

食管鱗癌是一種預(yù)后不良的疾病。最近的研究表明，血清miRNAs與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)，這表明它們也可作為預(yù)后分類的潛在標(biāo)志物，有助于在食管鱗癌早期篩選出適當(dāng)?shù)闹委煼椒╗5]。如miR-25可作為抑癌基因，抑制結(jié)腸直腸癌和甲狀腺未分化癌的細(xì)胞增殖。然而miR-25也可以抑制和的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[10]。miR-375也是一個腫瘤抑制基因，其表達(dá)水平在各種癌癥中經(jīng)常下調(diào)[10]。此外，miR-223和miR-375的表達(dá)水平不受新輔助放化療的影響[10]。血清miR-25、miR-223和miR-375異常變化也存在于食管癌患者。食管鱗癌的預(yù)后與血清miR-25、miR-223和miR-375的異常變化有關(guān)。在血清中，高水平的miR-223、低水平的miR-375患者預(yù)后差[10]。血清miR-223和miR-375的異常變化與食管癌患者的性別、飲酒史和臨床病理特征之間無顯著關(guān)聯(lián)[10]。而miR-155與年齡無相關(guān)性，與家族史、飲酒、抽煙史和淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能有關(guān)，其在癌組織中含量增高，血清中含量下降[27]。miR-1246含量在血清中增加，在食管鱗癌組織中不增加。

晚期食管癌(T-Ⅲ、Ⅳ期)血清miR-1246含量高于T-Ⅰ、Ⅱ期，在近端淋巴結(jié)含量也增高[29]。miR-31也有病理階段差異，Ⅲ期高于Ⅰ期，77.8%病例癌組織中含量增高，手術(shù)后miR-31含量下降[25]。miR-18a含量在血清、癌組織、癌細(xì)胞株均增高，手術(shù)后顯著下降[23]。血清miR-21含量與腫瘤組織大小呈正相關(guān)，晚期腫瘤時其含量顯著增高。比較手術(shù)前后和化療敏感者化療前后miR-21的含量變化，手術(shù)后和化療后miR-21含量下降的病例預(yù)后較好[32]。血清miRNA既可來自癌組織，也可來自正常組織。在血清中miRNA與蛋白質(zhì)、脂類、外分泌體等形成復(fù)合物，從而保持較高的穩(wěn)定性。有些來自正常組織的血清miRNA可以作用于腫瘤細(xì)胞，補(bǔ)充癌細(xì)胞內(nèi)下降的miRNA。一旦這種作用不能發(fā)揮，腫瘤細(xì)胞將進(jìn)入轉(zhuǎn)移階段。因此，血清miRNA的高低可以反映腫瘤發(fā)展的動力學(xué)變化，對腫瘤的診斷治療和預(yù)后提供生物標(biāo)志物[3]。

3 血清miRNAs在檢測方法上的挑戰(zhàn)

血清miRNAs的主要檢測方法有：芯片技術(shù)、RT-qPCR、Northern雜交、原位雜交、高通量測序等。當(dāng)用低密度、Solexa、美國昂飛、安捷倫、Toray 3D-Gene microRNA高通量檢測食管鱗癌的血清/血漿miRNA表達(dá)譜[6,21,24,29,33,34]時，所檢測到的miRNAs的差異數(shù)量從11~219個不等，而且重復(fù)率極低。不同實(shí)驗(yàn)室用相同的芯片技術(shù)或同一實(shí)驗(yàn)室用不同的芯片技術(shù)檢測時，miRNAs表達(dá)差異數(shù)量不大，但種類差異較大[6,21,33,34]。由此可見，實(shí)驗(yàn)操作是一個關(guān)鍵因素。同樣，同一個實(shí)驗(yàn)室將芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果用RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，也不能得到完全一致的結(jié)果[33,35]，不同實(shí)驗(yàn)方法之間存在明顯不一致性。

血清miRNA檢測結(jié)果缺乏一致性的主要原因在于miRNA提取方法、量化和數(shù)據(jù)分析。血清miRNAs提取的方法影響miRNAs的最終檢測結(jié)果。有71%的報道支持提取血清/血漿總的miRNAs，5%的文獻(xiàn)支持提取富集的miRNAs，而至今為止沒有統(tǒng)一的定論[19]。比較酚、Trizol和試劑盒提取方法，不難發(fā)現(xiàn)，除酚提取方法外，其他方法對血清都進(jìn)行一定比例的稀釋，尤其是試劑盒的稀釋倍數(shù)最大，這樣有利于減低血清蛋白含量[36]。另外，Trizol和試劑盒的蛋白質(zhì)主要變性劑除酚外，還有異硫氰酸胍，能更有效地使蛋白質(zhì)變性。試劑盒中加入層析方法回收miRNAs有利于提高miRNAs的純度。由于血液中存在相當(dāng)大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞碎片和污染組分會覆蓋樣品間的差異，從而影響血清miRNAs的提取效率和富集程度[19]。靜脈血周圍的許多變量也影響血清miRNAs的定量檢測，如抗凝劑類型[19]、溶血[37]、個體空腹?fàn)顟B(tài)[19]等。最后，血液采集方法和處理時間不同時也會影響miRNA的檢測效果。

數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化是準(zhǔn)確定量分析血清miRNAs的關(guān)鍵。雖然血清miRNA檢測采用了不同的規(guī)范化方法，包括使用單位體積血清miRNA濃度、外參基因等，但至今尚未達(dá)到共識[29]。小RNA包括U6、5S、RUN44、RUN48等，經(jīng)常被用作外參基因，但它們在血清中不穩(wěn)定，變化相當(dāng)顯著[6,29,38]。一些內(nèi)源miRNAs，如miR-16也用作外參基因[10,39,25,32]。為了克服量化問題，大多數(shù)學(xué)者建議用單位體積血清中miRNAs含量作為標(biāo)準(zhǔn)[6,7]或通過合成非人類miRNAs(如)作為校正手段[13,19,40]。雖然血清miRNAs的研究歷史相對較短，作為一個腫瘤的診斷與預(yù)后的生物標(biāo)志物，還存在許多問題，但是作為一種微創(chuàng)生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床只是時間問題。

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(責(zé)任編委: 吳晨)

Serum miRNAs as new biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma

Yingying Li1, Zhiguang Liu2, Li Wang1, Yuanyuan Yuan1, Ping Liu2, Linsong Wang1

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is one of the most common types of malignancies in China. Most ESCC patients are diagnosed at middle to late stages with poor prognosis due to the lack of an effective method for early diagnosis. MicroRNAs (miRNAs) are a family of endogenous small non-coding RNAs that can regulate ESCC development and progression by repressing their specific target genes’ expression. Compared to traditional biomarkers (e.g., mRNAs and proteins), miRNAs are more stable and can be readily screened and accurately quantitated and analyzed, making them ideal new-generation of biomarkers for early cancer detection and prognostic evaluation. Recent studies have shown that the changes of the expression levels of some serum miRNAs from ESCC patients significantly correlate with their diagnostic and prognostic outcome. In this review, we summarize the trend of the expression changes of miRNAs in ESCC patients’ serum and discuss the possibility of detecting these miRNAs’ expression changes as a novel method for ESCC early diagnosis and prognostic evaluation. Notably, the results of serum miRNAs from different detection methods are not completely consistent. Thus, we also discuss several possible reasons for such inconsistency.

serum; miRNA; esophageal squamous cell carcinoma

2014-12-15;

2015-01-21

新鄉(xiāng)市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號：ZG13002)資助

李迎迎，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: liyingly47@163.com

王林嵩，博士，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: wls@htu.cn

10.16288/j.yczz.14-441

2015-3-11 9:21:32

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0921.006.html