夏慧華，尹國(guó)民，朱年青，陳 濤*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2.煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 264002）

琥珀酸，學(xué)名丁二酸，在化學(xué)工業(yè)中是合成很多重要大宗化學(xué)品如四氫呋喃、1，4-丁二醇、γ-丁內(nèi)酯和己二酸的基本原料[1]。傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)是以不可再生資源石油為原料。近年來(lái)，隨著石油價(jià)格的不斷增長(zhǎng)以及環(huán)境污染的壓力，生物法制備琥珀酸以其利用可再生資源，固定溫室氣體二氧化碳等優(yōu)點(diǎn)成為世界各國(guó)關(guān)注的焦點(diǎn)[2-3]。由于琥珀酸是三羧酸循環(huán)（TCA）的中間物之一，同時(shí)也是微生物代謝途徑中的共同中間物，因此微生物成為琥珀酸生物合成的理想生產(chǎn)菌。

目前研究最集中的有產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）[4]，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillumsucciniciproducens）[5]，產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）[6]，大腸桿菌（Escherichia coli）[7]和谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）[8-9]等。谷氨酸棒桿菌是一種兼性厭氧、生長(zhǎng)快速的革蘭氏陽(yáng)性菌。由于其遺傳背景清晰且基因操作手段成熟，已被廣泛應(yīng)用于氨基酸、核苷酸、生物塑料以及其它專用化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)。在厭氧的條件下谷氨酸棒桿菌能夠高效利用葡萄糖生成各種有機(jī)酸。此外，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體在厭氧條件下處于激活狀態(tài)，能夠提供更多的還原力用于琥珀酸的合成。因此，利用谷氨酸棒桿菌作為宿主生產(chǎn)琥珀酸尤為合適。

高效地將細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸輸出到胞外，對(duì)于琥珀酸的合成具有重要意義。目前大部分細(xì)菌中琥珀酸的輸出蛋白并不清楚，Huhn等[10]利用生物信息學(xué)方法鑒定出谷氨酸棒桿菌中的琥珀酸輸出蛋白，并將其命名為SucE（由基因cg2425編碼）。失活cg2425導(dǎo)致琥珀酸的輸出減少并影響琥珀酸的生產(chǎn)。Fukui等[11]也鑒定了谷氨酸棒桿菌中的琥珀酸輸出蛋白基因sucE。微好氧發(fā)酵時(shí)，過(guò)表達(dá)sucE能夠提高琥珀酸產(chǎn)率，而敲除sucE導(dǎo)致琥珀酸無(wú)法運(yùn)輸?shù)桨?，?dǎo)致糖耗速率、琥珀酸生產(chǎn)速率和琥珀酸得率均下降，厭氧下缺失sucE的菌株不生產(chǎn)琥珀酸。

本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌C.glutamicumXZ為出發(fā)菌株，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pExhsucE，并進(jìn)一步構(gòu)建了菌株 C.glutamicumXZ（pExhsucE）。研究考察了過(guò)量表達(dá)琥珀酸輸出蛋白SucE對(duì)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的影響，并進(jìn)行了通量分析。該研究對(duì)提高琥珀酸的生產(chǎn)速率和產(chǎn)量有重要意義，對(duì)琥珀酸的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用也有一定的參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料和實(shí)驗(yàn)儀器

試劑：硫酸卡那霉素、氯霉素、酵母提取物、胰蛋白胨、基因組提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Fast Pfu高保真快速DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金，限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自加拿大富酶泰斯Fermentas公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：TU1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；BioFlo 110系列1.3 L小型發(fā)酵罐（美國(guó) NewBrunswick Scientific）；SBA40C生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；HP 1100 LC高效液相色譜儀（Agilent Technologies，USA）。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α和谷氨酸棒桿菌 C.glutamicumATCC 13032由本實(shí)驗(yàn)室保藏；C.glutamicumXZ（在 ATCC13032△ldhA△pta△pqo△cat的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合酶）由本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建；質(zhì)粒 pExh（在穿梭質(zhì)粒 pECXK99E的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶和檸檬酸合酶）由本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建

首先用試劑盒提取C.glutamicumATCC13032基因組DNA并以其為模板，按照引物 sucE1、sucE2（sucE1：5’-CGCG TCTAGA ACCAAGACCGCTG TTGCAGTGA-3’；sucE2：5’-AGAT CCTGCAGGTGCGC TTAAGGGGTCAATGC-3’，帶下劃線的部分為限制性酶切位點(diǎn)）進(jìn)行sucE基因的PCR擴(kuò)增，啟動(dòng)子采用基因自身的啟動(dòng)子序列。純化后的sucE基因片段與載體pExh分別經(jīng) Xba I和 Sbf I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接得到表達(dá)載體pExhsucE，并電轉(zhuǎn)化到XZ感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素和氯霉素的BHIS平板，挑選抗性克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行Xba I和Sbf I雙酶切鑒定。

1.4 代謝通量分析

代謝通量分析網(wǎng)絡(luò)和反應(yīng)式分別如圖3和表1所示，包括葡萄糖吸收途徑、糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑、乙醛酸循環(huán)途徑和副產(chǎn)物生成途徑。v1到v16代表不同的途徑。由于實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下不合成生物量[12-13]，因此生物量方程沒(méi)有包括在代謝通量分析中。由于胞內(nèi)存在很多無(wú)效循環(huán)，因此可忽略ATP總量的平衡[14]。

表1 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中心代謝反應(yīng)式Tab le 1 Reactions of the centralmetabolic model of C.glutamicumATCC13032

與 Schez等[14]的研究方法相同，PEP和 Pyr節(jié)點(diǎn)作為一個(gè)點(diǎn)考慮，并將PEP到OAA的通量和Pyr到OAA的通量合并為v4。通過(guò)質(zhì)量守恒和胞內(nèi)氧化還原平衡可以得到如表2所示的中間代謝物方程。包括16個(gè)反應(yīng)和10個(gè)中間代謝物，方程的自由度為6。有7個(gè)速率是通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，包括葡萄糖的消耗速率 v1，琥珀酸、蘋果酸、延胡索酸、丙酮酸、酮戊二酸和乙酸的生成速率（分別為 v16、v11、v13、v5、v15、v6），其余的速率通過(guò) Matlab 計(jì)算得到。

1.5 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母抽提物，5 g·L-1氯化鈉；BHIS固體培養(yǎng)基：牛腦心浸粉 37 g·L-1，山梨醇 91 g·L-1，按照比列加入 1.5%（質(zhì)量體積比）的瓊脂粉，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

CGIII培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨，10 g·L-1酵母抽提物，21 g·L-1MOPS，用 1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.4，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。CGXII培養(yǎng)基參考谷氨酸棒桿菌手冊(cè)[15]。

表2 谷氨酸棒桿菌厭氧代謝的化學(xué)計(jì)量關(guān)系Tab le 2 Stoichiometric relationships for the anaerobic fermentation with C.glutamicum

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)

1.6.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵采用兩階段操作法：1）取-80℃保藏的種子培養(yǎng)液接入20 mL CGIII培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。以20%接種量接種到50 mL的CGIII培養(yǎng)基中，添加葡萄糖至濃度為20 g·L-1，30℃，220 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，OD600約為 20。2）將上述 50 mL培養(yǎng)液于 4℃，5 000×g離心15 min。用 CGXII培養(yǎng)基洗滌菌體 2次，再用CGXII培養(yǎng)基懸浮菌體，接入到50 mL封閉的血清瓶中。發(fā)酵初始 OD600約為40，添加葡萄糖、NaHCO3和 MgCO3至濃度分別為 20 g/L、200 mmol·L-1和20 g/L。30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.6.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

用同一發(fā)酵罐兩階段生產(chǎn)琥珀酸：采用CGIII豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)，將菌株接種到1.3 L發(fā)酵罐中，保持通氣量為1 L·min-1。通過(guò)溶氧和轉(zhuǎn)速的偶聯(lián)控制使得好氧階段（階段I）的溶氧水平保持在30%左右。當(dāng)菌株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，降低轉(zhuǎn)速到300 r/min，降低通氣量到 0.5 L·min-1，20 min后通入 CO2，添加200 mmol/L的 NaHCO3和 2%MgCO3；采用 6 mol/L的KOH和3 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基中均添加終濃度為25 mg·L-1的硫酸卡那霉素和6 mg·L-1的氯霉素。

1.7 代謝產(chǎn)物分析

細(xì)胞生長(zhǎng)是用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值，生物量（CDW）是由公式CDW=0.25×OD600g·L-1換算得到。培養(yǎng)基中的葡萄糖用生物傳感儀檢測(cè)，有機(jī)酸用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)，包括紫外吸光度檢測(cè)器（UV，Agilent Technologies）和示差檢測(cè)器（RI）。 HPLC以陽(yáng)離子交換柱（HPX-87H，BioRad，USA）來(lái)分離樣品，流動(dòng)相為5 mmol/L的 H2SO4，流速為0.5 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 sucE基因的克隆

圖1a）為以C.glutamicumATCC 13032基因組為模板PCR擴(kuò)增得到的sucE片段，大小2.2 kb，與理論值相同。將sucE片段和載體pExh分別酶切、連接后得到表達(dá)載體 pExhsucE。重組質(zhì)粒 pExhsucE經(jīng)Xho I單酶切鑒定，分別得到1.6 kb、3.7 kb和8.7 kb的3個(gè)片段，見(jiàn)圖1b），與預(yù)期結(jié)果一致。對(duì)pExhsucE質(zhì)粒中的sucE基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)與NCBI公布的堿基序列完全一致。

圖1 sucE基因的克隆Fig.1 Cloning of gene sucE

2.2 搖瓶厭氧發(fā)酵

將表達(dá)質(zhì)粒pExhsucE電轉(zhuǎn)化到菌株C.glutamicumXZ中得到突變菌株 C.glutamicumXZ（pExhsucE）。按照上述的方法對(duì)突變菌株C.glutamicumXZ（pExhsucE）進(jìn)行厭氧血清瓶發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程的糖消耗和有機(jī)酸產(chǎn)量如表3所示。突變菌株C.glutamicumXZ（pExhsucE）12 h內(nèi)耗盡葡萄糖，產(chǎn)生158.4 mmol/L琥珀酸，1 mol glucose得率為1.43 mol，相對(duì)于菌株C.glutamicumXZ提高了7%，而且所有副產(chǎn)物的生成都顯著的降低。此外，如圖2所示，相對(duì)于菌株 C.glutamicumXZ，突變株 C.glutamicumXZ（pExhsucE）的琥珀酸生產(chǎn)率提高了19%（2.17和1.82 mmol·gCDW-1·h-1），葡萄糖的比消耗速率提高了 8%（1.50 和 1.34 mmol·gCDW-1·h-1）。

圖2 突變株C.glutamicumXZ和C.glu tamicumXZ（pExhsucE）的葡萄糖消耗速率和有機(jī)酸生產(chǎn)速率Fig.2 Specific rates of glucose consump tion and organic acids production of strain C.glutamicumXZ and C.glu tamicumXZ（pExhsucE）

表3 谷氨酸棒桿菌突變株的厭氧發(fā)酵Tab le 3 Fermentation by C.glutamicumstrains under anaerobic conditions

2.3 代謝通量分析

為了研究過(guò)表達(dá)sucE基因?qū)ν糠植嫉挠绊?，分別對(duì)突變株 C.glutamicumXZ（pExhsucE）和 C.glutamicumXZ進(jìn)行了通量比較分析。按照上述方法發(fā)酵菌株12 h，測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的比消耗速率以及琥珀酸、乙酸、丙酮酸、酮戊二酸、延胡索酸和蘋果酸的比生成速率。根據(jù)建立的方程，求解出未知步驟的通量。圖3顯示了歸一化處理后的通量分布。

從圖3中可以看出，過(guò)表達(dá)基因 sucE后，突變株C.glutamicumXZ（pExhsucE）的乙醛酸循環(huán)相對(duì)通量v5增加了50%，并且TCA還原臂通量v14和乙醛酸循環(huán)通量v10的比值為127/19，這與最佳的琥珀酸合成途徑的通量分布更為接近（1 mol glucose琥珀酸得率為理論最大值1.71 mol時(shí)，TCA還原臂與乙醛酸循環(huán)的通量比值為 143/29）[16]。Fukui等[11]發(fā)現(xiàn)在C.glutamicumR菌株中，提高 sucE基因的表達(dá)量能夠顯著降低胞內(nèi)的琥珀酸濃度，從而減輕其對(duì)乙醛酸循環(huán)功能的抑制。由此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)琥珀酸輸出蛋白能夠激活乙醛酸循環(huán)。

圖3 突變株C.glu tamicumXZ和C.glu tamicumXZ（pExhsucE）的通量分布Fig.3 Flux d istributions of C.glutamicumXZ and C.glutamicumXZ（pExhsucE）

2.4 同一發(fā)酵罐兩階段生產(chǎn)琥珀酸

Inui等[17-18]研究了一種兩階段發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方式。首先好氧培養(yǎng)富集菌體，然后離心轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵，雖然這種方式能夠得到高的琥珀酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率，但放大到工業(yè)生產(chǎn)對(duì)于成本控制將是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。因此我們研究了在單一發(fā)酵罐中：1）好氧培養(yǎng)菌體；2）逐漸過(guò)渡到厭氧階段，利用靜止細(xì)胞生產(chǎn)琥珀酸的兩階段方式。這種發(fā)酵方式的優(yōu)勢(shì)在谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)異丁醇的過(guò)程中也有所體現(xiàn)[12]。

以突變株C.glutamicumXZ（pExhsucE）為發(fā)酵菌株，采用CGIII培養(yǎng)基進(jìn)行兩階段培養(yǎng)。發(fā)酵罐中的初始OD600為 7.2，通氣量為 1 L·min-1。通過(guò)溶氧和轉(zhuǎn)速的偶聯(lián)控制使得好氧階段（階段I）的溶氧水平保持在30%左右。如圖 4所示，4 h時(shí)候OD600達(dá)到 38.3，此時(shí)處于對(duì)數(shù)期，把轉(zhuǎn)速降低到300 r/min，通氣量降低為 0.5 L·min-1， 20 min 后通入 CO2，添加200 mmol/L的 NaHCO3和2%MgCO3；采用6 mol/L KOH和3 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值。琥珀酸產(chǎn)量為518 mmol/L，厭氧階段（階段 II）的比生產(chǎn)率是 0.95 mmol gCDW-1·h-1，1 mol glucose平均得率為1.5 mol。

圖4 厭氧條下分批補(bǔ)料生產(chǎn)琥珀酸Fig.4 Fed-Batch fermentations for succinate p roduction

3 結(jié)論

1）本研究以實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌C.glutamicumXZ為出發(fā)菌株，以質(zhì)粒的形式pExhsucE過(guò)量表達(dá)了琥珀酸輸出蛋白。重組菌株C.glutamicumXZ（pExhsucE）的琥珀酸得率提高7%，生產(chǎn)率提高19%，并且葡萄糖的比消耗速率提高8%。另外，通量分析表明，過(guò)表達(dá)sucE基因后乙醛酸循環(huán)的通量提高了5%。

2）采用兩階段發(fā)酵培養(yǎng)方式，在1.3 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵突變株 C.glutamicumXZ（pExhsucE），琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到518 mmol/L，厭氧階段的比生產(chǎn)率為0.95 mmol gCDW-1·h-1，1 mol glucose平均得率為1.5 mol。

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