孫藝丹，趙青，王銳利，梁桂賢，張淑秋

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001）

正交設(shè)計(jì)聯(lián)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化蒿甲醚長循環(huán)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方

孫藝丹，趙青，王銳利，梁桂賢，張淑秋

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001）

蒿甲醚（artemether，ARM）是一種倍半萜內(nèi)酯類的化合物（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），主要用于抗氯喹惡性瘧及重癥瘧疾的治療[1]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLC）是由液態(tài)脂質(zhì)及固體脂質(zhì)組成的新型納米給藥系統(tǒng)[2]。研究表明，普通納米粒注射給藥后，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的單核巨噬細(xì)胞（mononuclear phagocytic system，MPS）吞噬。用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）對(duì)納米粒的表面進(jìn)行修飾可以增加其親水性，并形成空間位阻避免被MPS識(shí)別[3-5]。正交設(shè)計(jì)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法是常常被采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。其中正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所建立的指標(biāo)和因素之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型是一種線性模型，精度不夠、預(yù)測性較差。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法是一種多元非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，但需考察的因素較多時(shí)，則實(shí)驗(yàn)次數(shù)偏高。因此，在進(jìn)行處方優(yōu)化時(shí)，首先用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行多因素的初步篩選，再將所確定的主要影響因素采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，旨在達(dá)到利用較少的試驗(yàn)次數(shù)得到具有較高預(yù)測精度的數(shù)學(xué)模型的目的[6]。本文作者擬將ARM 制備成聚乙二醇-硬脂酸酯（PEGSA）修飾的NLC，采用正交-星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化處方。

1 儀器與材料

Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），TDL-5-A 低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），F(xiàn)A1104電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），85-2恒溫磁力攪拌器（金壇榮華儀器制造有限公司），APV2000高壓勻質(zhì)機(jī)（北京同和友德科技有限公司），Zetasizer ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文公司），JEM-1011透射電鏡（日本電子公司）。

蒿甲醚（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.4%，重慶華方武陵山制藥有限公司，批號(hào)C00320130502），聚氧乙烯氫化蓖麻油（北京偶合科技有限公司），單硬脂酸甘油酯（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），中鏈甘油酸三酯（上海運(yùn)宏化工制劑輔料有限公司），聚乙二醇-硬脂酸酯（PEG-SA，北京百靈威科技有限公司，聚合度為40）。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒿甲醚長循環(huán)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、中鏈脂肪酸脂及聚氧乙烯氫化蓖麻油，于（73±3）℃水浴加熱作為油相；待油相混勻后，加入處方量的ARM，攪拌使其溶解。另稱取處方量的PEG-SA，加入上述油相中，攪拌均勻作為混合油相。將處方量的純化水加熱到相同溫度后，注入混合油相中，攪拌均勻即得初乳。冷卻至室溫，用高壓勻質(zhì)機(jī)（8×107 Pa）勻化5次，迅速冷卻至室溫，得呈藍(lán)色乳光的ARM-NLC。

2.2 包封率的測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（V︰V︰V =85.4︰13.6︰1.0）；流速：

1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL[7]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和精密度試驗(yàn)

精密稱取ARM50 mg，置于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為ARM儲(chǔ)備液。精密量取ARM儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 g·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，樣品的質(zhì)量濃度（ρ）在0.1～0.9 g·L-1內(nèi)與峰面積（A）有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A= 198.3ρ + 0.4000（R2=0.9999）。分別取質(zhì)量濃度為0.1、0.5 和0.9 g·L-1的ARM溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品連續(xù)進(jìn)樣測定3次，RSD 分別為1.95%、0.99%和0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 超濾離心法測定包封率的加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1蒿甲醚儲(chǔ)備液適量，置于10 mL量瓶中，用空白NLC稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.5 和0.8 g·L-1的蒿甲醚混懸液。分別精密吸取上述溶液0.4 mL置于超濾管（截留分子質(zhì)量3 ku，超濾管體積0.4 mL）的上室，3500 r·min-1離心45 min。取離心后的上室及下室溶液適量，用流動(dòng)相稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，按“2.2.1”條色譜條件測定藥物含量，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品平行測量3次，計(jì)算游離藥物的回收率。由表1可知，游離藥物在下室的回收率在98.64%～100.21% 內(nèi)，上室未檢測到藥物，說明游離藥物可自由通過超濾膜。空白納米粒在波長209 nm處有最大吸收，測量離心后下室溶液在波長209 nm處的吸光度為0。綜上所述，游離藥物可自由通過超濾膜，而納米粒不能通過超濾膜，借助離心力的作用可以將游離藥物與納米粒分離。

2.2.4 包封率的測定

精密量取ARM-NLC 0.4 mL置于超濾管（3 ku，0.4 mL）的上室，3500 r·min-1離心45 min。取適量離心后的上室溶液用流動(dòng)相溶解并稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用HPLC法測定包封于NLC中ARM的質(zhì)量。另取ARM-NLC 1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，用HPLC法測定NLC中ARM的總質(zhì)量。包封率（entrapment efficiency，wEE）的計(jì)算公式為wEE=m1/m2×100%。其中，m1為包封于NLC中的ARM的質(zhì)量，m2為NLC中ARM的總質(zhì)量。

2.3 粒徑及zeta電位的測定

將待測樣品用純化水稀釋100倍后使用ZS90激光粒度儀測定其粒徑及zeta電位，測定溫度為25℃。

2.4 處方優(yōu)化

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按L18（37）安排試驗(yàn)，初步考察固液脂質(zhì)質(zhì)量比（X1）、脂質(zhì)含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、脂質(zhì)與乳化劑質(zhì)量比（X3）、PEG占脂質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X4）、藥物占脂質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X5）、PEG的聚合度（X6）6種影響因素3水平。以包封率為指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析，確定主要影響因素。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果見表2。

采用正交設(shè)計(jì)助手v3.1軟件，對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，確定3個(gè)主要影響因素為固液脂質(zhì)質(zhì)量比（X1）、PEG占脂質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X4）、藥物占脂質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X5）。綜合考慮各因素，次要因素進(jìn)一步確定為脂質(zhì)含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，脂質(zhì)與乳化劑質(zhì)量比為2.5，PEG的聚合度為40。

依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選結(jié)果，按三種主要影響因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步考察影響處方配比的主要影響因素X1、X4、X5對(duì)包封率（Y1）、粒徑（Y2）、zeta電位（Y3）及總評(píng)“歸一化”值（overall desirability，OD，Y4）的影響。因素及水平結(jié)果見表3，星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及結(jié)果見表4，根據(jù)“2.4.2”條的處理方法求算OD值。

2.4.2 OD值的計(jì)算

根據(jù)試驗(yàn)的目的，確定各指標(biāo)可接受的最大值和最小值，結(jié)果見表 5。各指標(biāo)可接受范圍的選擇依據(jù)：瘧原蟲可誘導(dǎo)宿主紅細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生新滲透性通道（new permeability pathways，NPPs）以滿足自身攝取營養(yǎng)物質(zhì)的需要。有文獻(xiàn)報(bào)道，粒徑小于80 nm的粒子可以通過此通道進(jìn)入瘧原蟲體內(nèi)[8]，并且為了保證NLC的形態(tài)良好，故將ARM-NLC的粒徑范圍限定在25～80 nm內(nèi)。Zeta電位可以用于預(yù)測NLC的穩(wěn)定性，具有較高的zeta電位的NLC由于電荷的相互排斥，粒子不易聚集。一般來說，穩(wěn)定的NLC其zeta電位的絕對(duì)值應(yīng)在30 mV左右[9]，故將zeta電位的絕對(duì)值限定在25～40 mV 內(nèi)?？傇u(píng)“歸一值”（overall desirability，OD）為各指標(biāo)的綜合結(jié)果，故應(yīng)選取較大值的范圍在0.5～1.0內(nèi)。

根據(jù)各指標(biāo)可接受的范圍將各指標(biāo)歸一化為0～1.0間的歸一值（desirability，di），將各指標(biāo)的di根據(jù)公式：OD=1/n求算[10]，得總評(píng)“歸一值”。OD值的計(jì)算過程中，各指標(biāo)的權(quán)重均為1。其中，對(duì)于取值越大越好的指標(biāo)（如包封率）和取值越小越好的指標(biāo)（如：粒徑、zeta電位）分別按公式：dimax= (Yi–Ymin）/(Ymax–Ymin）和dimin=( Ymax–Yi）/( Ymax–Ymin）計(jì)算各指標(biāo)的di[11]。

2.4.3 回歸方程的擬合

采用Design Expert 8.0.6軟件，分別以Y1、Y2、Y3和Y4為因變量，X1、X4和X5為自變量進(jìn)行擬合，多元線性回歸結(jié)果：Y1= 90.54﹣2.32X1﹣2.38X4﹣3.28X5（R = 0.466 7，P>0.05）；Y2=32.1﹣3.97X1﹣2.80X4+ 0.72X5（R = 0.6465，P<0.05）；Y3=﹣28.39 + 1.12X1+ 1.14X4﹣0.84X5（R = 0.395 3，P>0.05）；Y4= 0.41﹣6.8 ×10﹣2 X1﹣5.1 × 10﹣2 X4+ 8.712 × 10﹣3 X5（R =0.327 8，P>0.05）。多元非線性回歸結(jié)果：Y1=86.68 + 3.14X1﹣3.12X4+ 2.10X5+ 5.5X52+9.62X12X4﹣2.94X13﹣1.76X53（R =0.9657，P<0.0001）；Y2= 28.81﹣3.97X1﹣2.8X4+ 0.72X5+ 1.32X1X4+1.21X1X5+ 0.68X4X5+ 2.20X12+ 1.23X42+ 1.27X52（R = 0.7630，P>0.05）；Y3=﹣28.85 + 1.56X1+0.64X4﹣0.55X5﹣2.01X1X4﹣2.59X1X5﹣2.71X4X5+ 0.89X12﹣0.21X42﹣2.3 × 10﹣2 X52﹣2.74X1X4X5+ 0.88X12X4﹣0.51X12X5﹣0.77X1X42（R =0.9635，P<0.05）；Y4= 0.45﹣0.14 X1﹣6.1 × 10﹣2X4+8.660 ×10﹣3X5+0.11X1X4+0.15X1X5+8.9 ×10﹣2X4X5﹣7.0 × 10﹣2 X12﹣8.81 × 10﹣3 X42+ 2.8 ×10﹣2X52+ 0.19X1X4X5+ 1.7 × 10﹣2 X12X4+ 8.975 ×10﹣5X12X5+0.13X1X22（R = 0.9628，P<0.05）。由擬合方程的回歸系數(shù)R及P值可知，除粒徑外，采用非線性回歸方程能更好地?cái)M合其余3個(gè)指標(biāo)。且方程通過F檢驗(yàn)，可用于ARM-NLC處方的優(yōu)化預(yù)測。對(duì)于粒徑指標(biāo)，仍采用多元線性方程進(jìn)行處方的預(yù)測。

2.4.4 效應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測

根據(jù)OD值的多元非線性回歸方程，采用Design Expert 8.0.6軟件，固定三個(gè)影響因素中的一個(gè)為中值，繪制其余兩個(gè)因素對(duì)OD值的三維效應(yīng)圖，結(jié)果見圖2。

根據(jù)圖2和擬合方程，選取粒徑在30 nm左右，包封率較高，zeta電位較低，綜合指標(biāo)即OD值較高的區(qū)域。采用Design Expert 8.0.6軟件，根據(jù)上述限定條件，軟件自動(dòng)篩選計(jì)算得優(yōu)化處方為X1= 1.8，X4= 21.3%，X5= 24.6%。

2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)化處方制備3批ARM-NLC，其平均粒徑、包封率和zeta電位結(jié)果見表6。從表6可知，實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值偏差的絕對(duì)值小于10%，說明模型可以較為準(zhǔn)確地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系。

2.5 形態(tài)觀察、zeta電位及粒徑分布

取適量ARM-NLC滴在銅網(wǎng)上，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%磷鎢酸染色10 min后，于透射電鏡下觀察形態(tài)。由圖3可見，納米粒大小均勻，形態(tài)圓整。取適量ARM-NLC，用純化水稀釋100倍后，用ZS90激光粒度儀分別測定其粒徑分布及zeta電位，結(jié)果見圖4，粒徑為29.2 nm，PDI為0.163，zeta電位為-37.2 mV。

3 討論

a.PEG是水溶性、無生物活性、無毒的線性高分子，為了使其能穩(wěn)定地與NLC相連，需要引入脂溶性且與NLC有很好匹配性的化合物。目前多采用先合成聚乙二醇的脂類衍生物，然后用聚乙二醇衍生物作為NLC 組分之一，制備PEG修飾的NLC。為保證PEG分子結(jié)構(gòu)的伸展以獲得對(duì)NLC表面的最大屏蔽效果，合成的聚乙二醇衍生物最好只在其一端連有脂溶性片段。本實(shí)驗(yàn)選用PEG 與硬脂酸酯化的衍生物作為修飾劑，其既含有親水性的PEG又含有疏水的硬脂酸。當(dāng)PEG-SA與NLC混合在一起，其疏水端插入NLC脂性核中，PEG端向外，從而形成穩(wěn)定的PEG的保護(hù)層。

b.對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，常需考察多個(gè)指標(biāo)，而根據(jù)每個(gè)指標(biāo)得到的優(yōu)化范圍可能會(huì)不一致。故可采用“歸一化”法對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合來反映因素對(duì)效應(yīng)的影響。本文作者以各指標(biāo)的總評(píng)“歸一值”為指標(biāo)，建立的方程具有良好的預(yù)測能力。

c.包封率測定的方法確證階段，通過加樣回收率考察未包封藥物的透膜能力。加樣回收率試驗(yàn)中用空白NLC制備ARM的混懸液，分別測定離心后的上室與下室溶液中蒿甲醚的含量。結(jié)果顯示，上室未檢測到藥物，下室游離藥物的回收率在 98.64%～100.21% 內(nèi)，說明游離藥物可以自由通過超濾膜。測量離心后下室溶液在空白納米粒最大吸收波長處的吸光度為 0，說明離心力不能使空白納米粒透過超濾膜。綜上所述，借助離心力的作用，可以將未包封藥物與空白納米粒分離。由于離心后未包封藥物大部分位于超濾管的下室，又因本文采用的藥物含量測定方法的檢測限偏高，故測定不到上室極微量的藥物。

摘編自《沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年1期：7～13頁，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。