尹 梅 劉振國(guó) 孟靜茹 侯 征 馬 雪

1.西安市兒童醫(yī)院特需科，陜西西安 710003；2.西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710061；3.第四軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室，陜西西安 710032

肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性感染的重要病原菌[1]，也是引起兒童呼吸道感染的常見(jiàn)致病菌，還可導(dǎo)致兒童中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎、菌血癥及敗血癥等，具有很高的感染率和病死率[2]。根據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示，全球每年約160萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌感染，其中5歲以下兒童達(dá)100萬(wàn)，90%以上死亡病例在發(fā)展中國(guó)家[3]。青霉素是肺炎鏈球菌感染的首選治療藥物，廣泛應(yīng)用于肺炎鏈球菌感染的治療，但近年來(lái)耐藥情況日趨嚴(yán)峻[4]。目前，兒科臨床上常用口服頭孢菌素治療肺炎鏈球菌感染，但部分研究者認(rèn)為在應(yīng)用抗菌藥物治療過(guò)程中會(huì)干擾腸道菌群的定植，抑制機(jī)體益生菌，導(dǎo)致少數(shù)條件致病菌的易位和耐藥性的產(chǎn)生[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型，研究臨床常用口服頭孢菌素（頭孢克洛、頭孢地尼和頭孢克肟）對(duì)感染大鼠腸道菌群的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)某些細(xì)菌的耐藥性，為兒科臨床實(shí)踐中合理應(yīng)用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，50只，體重250～300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）2012-006。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23.0±2.0）℃，濕度（55±5）%，光照 7∶00～19∶00。動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周后使用。

1.2 菌株及藥品

1.2.1 致病菌株 選取西安市兒童醫(yī)院2014年2～4月住院22～26個(gè)月患兒咽拭子標(biāo)本，經(jīng)培養(yǎng)鑒定篩選獲得肺炎鏈球菌（編號(hào)：SP14021a）。將分離獲得的臨床菌株SP14021a在感染動(dòng)物前接種于Muller-Hinton瓊脂（MHA）平板中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接于MH肉湯培養(yǎng)基，37℃孵育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即為實(shí)驗(yàn)所用菌液。將細(xì)菌原液離心（12000 r/min離心2 min）后，用無(wú)菌生理鹽水重懸稀釋后配制成細(xì)菌混懸液，用比濁儀調(diào)節(jié)混懸液的最終濃度為1.5×109備用。

1.2.2 藥品與試劑 頭孢克洛干混懸劑（?？虅冢?.125g/袋，禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)C354375），頭孢地尼分散片（達(dá)力先，0.1 g/片，深圳致君制藥有限公司，批號(hào)A140203），頭孢克肟顆粒（達(dá)力芬，50 mg/包，深圳致君制藥有限公司，批號(hào)A20131016），由西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科提供。

1.3 動(dòng)物分組

50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，隨機(jī)選取一組作為正常對(duì)照組，其余四組復(fù)制肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型，造模成功后再隨機(jī)分為感染后未治療組、頭孢克洛組、頭孢地尼組和頭孢克肟組，各組給藥劑量均根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表?yè)Q算，分別采用灌胃方法給予頭孢克洛（100 mg/kg）、頭孢地尼（30 mg/kg）和頭孢克肟（45 mg/kg），正常對(duì)照組和肺炎鏈球菌肺炎模型組分別給予生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)給藥5 d。

1.4 復(fù)制動(dòng)物模型

采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，參照文獻(xiàn)[7]方法，將大鼠麻醉后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，撐開(kāi)大鼠口腔，充分暴露咽喉部，用連接注射器的鈍圓針頭經(jīng)口緩慢插入氣管，通過(guò)微量注射器緩慢注入菌液40 μL（細(xì)菌濃度 5×108cfu/mL），使菌液直接進(jìn)入大鼠肺內(nèi)。正常對(duì)照組在同一時(shí)間用同樣方法注入等量的無(wú)菌生理鹽水。

1.5 糞便涂片

治療結(jié)束后留取各組大鼠糞便標(biāo)本進(jìn)行快速薄層涂片、固定，采用改良革蘭染色后鏡檢，每張涂片分別計(jì)數(shù)3個(gè)隨機(jī)油鏡視野下的革蘭陽(yáng)性桿菌（G+桿菌）、革蘭陰性桿菌（G-桿菌）、革蘭陽(yáng)性球菌（G+球菌）、革蘭陰性球菌（G-球菌）數(shù)量，計(jì)算百分比。

1.6 腸道菌群分析

各組動(dòng)物處理后24 h麻醉取材。大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部脫毛后常規(guī)消毒皮膚，無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，切開(kāi)大腸腸壁，取內(nèi)容物約0.5 g，加生理鹽水10倍稀釋作為原液，取原液進(jìn)行1∶10、1∶100、1∶1000 倍比稀釋， 分別取 100 μL 稀釋液用玻璃涂布棒均勻涂布于不同菌群的培養(yǎng)平板中，包括血瓊脂平板、麥康凱平板、腸球菌平板和念珠菌顯色平板。血瓊脂平板主要用于培養(yǎng)腸道彎曲菌、幽門螺桿菌等，麥康凱平板主要用于培養(yǎng)革蘭陰性腸道桿菌，腸球菌平板主要用于培養(yǎng)腸球菌，念珠菌顯色平板主要用于真菌培養(yǎng)。各標(biāo)本每個(gè)濃度的稀釋液分別做3個(gè)平板，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中血瓊脂平板、麥康凱平板、腸球菌平板培養(yǎng)24 h，選擇性培養(yǎng)腸桿菌及腸球菌；乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基MRS平板、念珠菌顯色平板培養(yǎng)48 h，選擇性培養(yǎng)乳酸桿菌及念珠菌。統(tǒng)計(jì)各平板菌落數(shù)并計(jì)算各梯度的菌落平均數(shù)。根據(jù)下列公式進(jìn)行細(xì)菌定量分析：組織細(xì)菌含量[cfu/g（mL）]=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/組織重量。各類細(xì)菌根據(jù)革蘭染色和菌落形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，再由細(xì)菌自動(dòng)分析儀進(jìn)行菌落鑒定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頭孢菌素對(duì)肺炎鏈球菌感染大鼠腸道菌群比例的影響

與正常對(duì)照組相比，感染后未治療組中G+桿菌和G-球菌占腸道細(xì)菌總數(shù)比例明顯降低（P<0.01或P<0.05），G-桿菌及G+球菌占細(xì)菌總數(shù)比例明顯升高（P<0.01或P<0.05）。與正常對(duì)照組相比，應(yīng)用三種頭孢菌素類藥物治療后G+桿菌比例均明顯降低 （P<0.01 或 P<0.05），G-桿菌比例明顯升高（P<0.05），G-球菌比例無(wú)顯著性變化。與正常對(duì)照組相比，應(yīng)用頭孢克洛可導(dǎo)致G+球菌比例明顯升高（P<0.05），但應(yīng)用頭孢地尼和頭孢克肟后G+球菌比例未見(jiàn)顯著性變化（P>0.05）。與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克洛治療5 d后腸道內(nèi)G-桿菌比例雖下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），G-球菌占細(xì)菌總數(shù)比例明顯升高（P<0.05），其余腸道細(xì)菌比例無(wú)顯著性變化。與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢地尼治療5 d后腸道內(nèi)G+球菌比例下降，G-球菌比例升高（P<0.05）。與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克肟治療5 d后腸道內(nèi)G+桿菌占細(xì)菌總數(shù)比例升高 （P<0.05），G-桿菌和G+球菌比例降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 頭孢菌素對(duì)腸道各菌群數(shù)占總菌群數(shù)比例的影響（%， ±s）

表1 頭孢菌素對(duì)腸道各菌群數(shù)占總菌群數(shù)比例的影響（%， ±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與未治療組比較，#P<0.05

58.72±4.22 33.38±3.73**35.28±4.06**41.55±2.18**45.63±3.54*#35.14±1.85 58.07±4.27**55.66±4.14*50.23±3.95*48.14±4.32*#5.08±1.06 8.02±2.73*7.95±2.15*6.40±1.08#5.38±1.24#1.06±0.23 0.53±0.11*1.11±0.33#1.82±0.52#0.85±0.46 G+桿菌 G-桿菌 G+球菌 G-球菌正常對(duì)照組未治療組頭孢克洛頭孢地尼頭孢克肟10 10 10 10 10組別 只數(shù)

2.2 頭孢菌素對(duì)肺炎鏈球菌感染大鼠腸道菌群數(shù)量的影響

將計(jì)數(shù)所得細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后統(tǒng)計(jì)比較，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，在肺炎鏈球菌感染后未治療組中腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量均明顯升高（P<0.05），念珠菌數(shù)量雖輕微升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與正常對(duì)照組相比，應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼治療5 d后，腸球菌數(shù)量均顯著升高（P<0.01）。與正常對(duì)照組相比，應(yīng)用頭孢克肟治療后腸球菌數(shù)量雖輕微升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克肟治療后腸球菌數(shù)量明顯減少（P<0.05）。與肺炎鏈球菌感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量均顯著減少（P<0.05）。與正常對(duì)照組和肺炎鏈球菌感染后未治療組相比，三種頭孢菌素均導(dǎo)致腸道內(nèi)念珠菌數(shù)量顯著增多 （P<0.05）。 見(jiàn)表 2。

表2 頭孢菌素對(duì)4種類型腸道菌群數(shù)量的影響（logcfu/g， ±s）

表2 頭孢菌素對(duì)4種類型腸道菌群數(shù)量的影響（logcfu/g， ±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與未治療組比較，#P<0.05

正常對(duì)照組未治療組頭孢克洛頭孢地尼頭孢克肟10 10 10 10 10 6.79±0.75 8.47±0.67*9.26±0.14**9.68±0.41**7.89±0.53#7.38±0.56 9.35±0.63*6.85±0.95#7.70±1.08#7.86±1.14#6.98±0.46 8.92±0.73*6.85±0.95#7.40±1.08#7.26±1.14#5.46±0.38 5.95±0.74 6.76±0.58*#6.42±0.42*#6.85±0.46*#組別 只數(shù) 腸球菌 雙歧桿菌 乳酸桿菌 念珠菌

2.3 頭孢菌素對(duì)肺炎鏈球菌感染大鼠腸道菌群種類的影響

將各類細(xì)菌的檢出情況以被檢樣品總例數(shù)中陽(yáng)性出現(xiàn)的只數(shù)表示。在正常對(duì)照組各樣本中均檢出大腸埃希菌和糞腸球菌，未見(jiàn)肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌和屎腸球菌。在肺炎鏈球菌感染后未治療組中，10只中有2只新檢出肺炎克雷伯桿菌，1只新檢出變形桿菌，但腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌仍是大腸埃希菌和糞腸球菌，在各樣本中均可檢出。與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，大腸埃希菌的檢出例數(shù)分別為8、7、8只，檢出率分別降低至80%、70%、80%，可見(jiàn)三種不同頭孢菌素類藥物對(duì)大腸埃希菌均有抑制作用；糞腸球菌檢出率也表現(xiàn)出不同程度的降低，其中頭孢地尼治療后糞腸球菌檢出率下降最為顯著，由100%降低至50%，僅5只檢出糞腸球菌。與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，肺炎克雷伯桿菌仍在少數(shù)樣本（1～2只）中可檢出，但變形桿菌的檢出率升高，檢出例數(shù)分別為3、4、2只。與感染后未治療組相比，應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，銅綠假單胞菌的檢出只數(shù)分別為4、3、3只，屎腸球菌的檢出只數(shù)分別為2、3、2只，可見(jiàn)三種不同頭孢菌素藥物均可導(dǎo)致銅綠假單胞菌和屎腸球菌檢出率升高。見(jiàn)表3。

表3 頭孢菌素對(duì)腸道菌群各類細(xì)菌檢出情況的影響（只）

3 討論

抗生素的研發(fā)和應(yīng)用使感染相關(guān)性疾病的死亡率明顯降低，但隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，也導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性日益嚴(yán)重，誘導(dǎo)和選擇作用引起的細(xì)菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)峻，己成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題[8-10]。腸道菌群是腸道內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，通過(guò)與宿主之間的相互作用而調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)，具有重要的免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌和代謝等功能。研究表明，腸道菌群失調(diào)會(huì)擾亂宿主正常的生理平衡[11]，從而引起包括慢性感染、炎癥、腫瘤、肥胖、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、過(guò)敏性疾病等在內(nèi)的多種疾病[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，廣譜抗生素的應(yīng)用將導(dǎo)致腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境失調(diào)，在廣譜抗生素壓力下腸道微生態(tài)屏障破壞，不僅使外源性條件致病菌發(fā)生腸道定植，還可能誘導(dǎo)腸道原籍條件致病菌引發(fā)腸源性感染，因此目前認(rèn)為廣譜抗生素的濫用可能是導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)、細(xì)菌易位及產(chǎn)生細(xì)菌耐藥菌的重要原因[4-6]。

肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，也是引起兒童呼吸道感染的常見(jiàn)致病菌，主要累及5歲以下兒童[14]。臨床上常用口服頭孢菌素治療兒童肺炎鏈球菌感染。臨床研究數(shù)據(jù)顯示，頭孢菌素類藥物的使用對(duì)人體腸道菌群的數(shù)量及結(jié)構(gòu)影響明顯[15-16]。此外，嬰幼兒期是腸道菌群發(fā)展的重要時(shí)期，過(guò)早應(yīng)用廣譜抗生素會(huì)干擾嬰幼兒正常腸道菌群的定植，破壞早期建立的菌群平衡，更容易導(dǎo)致少數(shù)條件致病菌的易位和耐藥性的產(chǎn)生，年齡越小影響越明顯[17]。研究也發(fā)現(xiàn)，在嬰兒期使用廣譜抗生素會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏性疾病發(fā)病率的升高，兒童過(guò)敏性疾病的高發(fā)與腸道菌群失衡有關(guān)，其原因是抗生素應(yīng)用引起腸道微生物群發(fā)生改變，過(guò)敏兒童腸道中大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量增多而乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著減少[18-19]。因此，探討兒童常用的頭孢菌素類藥物在兒童常見(jiàn)感染性疾病的治療過(guò)程中對(duì)腸道菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)的影響對(duì)臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

在本研究中仍采用了傳統(tǒng)的分離檢測(cè)方法，通過(guò)采集模型大鼠糞便和腸道內(nèi)容物，進(jìn)行涂片觀察和細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。涂片法測(cè)定糞便中球菌與桿菌的數(shù)量是反映腸道菌群平衡的一個(gè)基礎(chǔ)指標(biāo)。在健康成年人糞便中，桿菌明顯多于球菌，其中G+桿菌占50%～60%，G-桿菌占 40%～50%，G+球菌占 5%～15%，G-球菌占3%～10%。在肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型上，連續(xù)5 d應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼或頭孢克肟，可以對(duì)腸道菌群中球菌和桿菌的比例產(chǎn)生不同程度的影響，表明頭孢菌素類藥物的使用可以影響腸道菌群的數(shù)量及結(jié)構(gòu)。人體內(nèi)正常腸道菌群包括需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌，其中，厭氧菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。腸道內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌等專性厭氧菌定植于腸黏膜上皮表面，是機(jī)體的生理性益生菌，具有多種微生物拮抗功能，對(duì)腸道內(nèi)兼性厭氧菌和需氧菌等條件致病菌起抑制或殺滅作用，對(duì)維持腸道的微生態(tài)平衡起重要作用。在多種疾病狀態(tài)或應(yīng)用抗生素的情況下，腸道益生菌減少，腸道需氧菌、兼性需氧菌大量增殖，成為優(yōu)勢(shì)菌群，導(dǎo)致菌群失調(diào)。因腸道菌群所包含的菌種及數(shù)量復(fù)雜多樣，在本研究中選取了腸道常見(jiàn)兼性需氧桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌及真菌作為觀察對(duì)象。研究表明，在肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型上，連續(xù)5 d應(yīng)用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟均可導(dǎo)致腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著減少，腸球菌和念珠菌數(shù)量增多，繼而可能引起菌群失調(diào)，使腸道微生態(tài)環(huán)境失衡[19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用頭孢曲松可能會(huì)導(dǎo)致耐藥菌和條件致病菌產(chǎn)生，并取代有益菌成為優(yōu)勢(shì)菌群[15，20]。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)腸道兼性需氧桿菌、腸球菌、真菌種類變化的研究結(jié)果表明，正常對(duì)照組大鼠腸道內(nèi)容物兼性需氧桿菌中以大腸埃希菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，腸球菌以糞腸球菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他條件致病菌因數(shù)量低于檢測(cè)靈敏度而常規(guī)平板培養(yǎng)方法不能檢出，但應(yīng)用頭孢菌素類藥物后，可不同程度出現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌及銅綠假單胞菌等條件致病菌，這可能與乳酸桿菌數(shù)量減少導(dǎo)致對(duì)其定植抗力減弱有關(guān)。此現(xiàn)象在一定程度上也說(shuō)明，社區(qū)獲得性感染常見(jiàn)的病原菌銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌等部分可能是腸源性的，腸道菌群對(duì)于社區(qū)獲得性感染的防治具有重要的臨床意義。

綜上所述，口服頭孢菌素類藥物也可能破壞腸道微生態(tài)環(huán)境，引發(fā)其他的病理生理過(guò)程。在兒科臨床應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)針對(duì)不同適應(yīng)證合理應(yīng)用抗生素，同時(shí)必須嚴(yán)格控制抗生素應(yīng)用時(shí)間的長(zhǎng)短，避免導(dǎo)致腸道菌群紊亂而引發(fā)過(guò)敏及免疫功能下降等問(wèn)題。在必須使用抗生素時(shí)，應(yīng)盡可能維持微生態(tài)平衡，可以考慮適當(dāng)補(bǔ)充益生菌，預(yù)防和減少菌群失調(diào)所產(chǎn)生的不良影響。

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