馬亞珂 楊 岳 趙步長(zhǎng) 賈力夫 趙 菁 王 虹 余文文 張露莎

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 現(xiàn)代中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），天津 300193；2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西西安 712000

血管性癡呆（vascular dementia）是由各種腦血管疾病如缺血性卒中、出血性卒中等所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，是一種慢性進(jìn)行性疾病[1]。造成血管性癡呆的原因，主要有缺血性腦損傷、腦血流減少、腦動(dòng)脈硬化及腦神經(jīng)細(xì)胞病變等[2-3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)血管性癡呆的治療尚無(wú)確切的療法和藥物。腦心通膠囊是根據(jù)中醫(yī)理論在經(jīng)典方劑的基礎(chǔ)上加味而成的中藥復(fù)方制劑，由黃芪、丹參、當(dāng)歸、川芎、紅花、乳香、沒(méi)藥、桂枝、地龍及水蛭等16味中藥組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)等功效。臨床大量數(shù)據(jù)證實(shí)腦心通膠囊對(duì)心腦血管性疾病具有較好的治療效果[4]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型是新近出現(xiàn)的一種慢性低灌注缺血致血管性癡呆模型，更符合臨床血管性癡呆的病理特點(diǎn)（圖1）[5-6]，而國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)應(yīng)用該模型的報(bào)道。本研究采用該模型研究了腦心通膠囊對(duì)血管性癡呆的保護(hù)作用。

圖1 小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)C57BL/6小鼠64只，10周齡，雄性，平均體重（20.00±5.00）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)溫度為22～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每周更換墊料2次。

1.2 儀器與試劑

0.18 mm 金屬螺旋環(huán)（Microcoil，SWPA/0.08×0.18×0.5×2.5，無(wú)錫薩密你彈簧有限公司中國(guó)）；大小鼠行為分析系統(tǒng)（Clever.Sys.Inc，美國(guó)）；Y 迷宮（XR-XY1032上海欣軟信息科技有限公司，中國(guó)）；LEICA S8APO體視顯微鏡（型號(hào) DFC295，LEICA，德國(guó)）；LSM710 顯微鏡（CarlZeiss LSM710，ZEISS，德國(guó)）。 腦心通膠囊（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025001）；Tempol（214000-25G，SIGMA-ALDRICH，中國(guó)）；異氟烷（河北一品制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19980141）；GFAP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，BA0056）；其他試劑為市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型及實(shí)驗(yàn)分組 54只C57BL/6小鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄術(shù)：三溴乙醇（0.33 mL/20 g）麻醉后，脫毛備皮并固定，置于體視顯微鏡下?？v向剪開(kāi)頸部皮層，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，將0.18 mm的金屬環(huán)套在頸總動(dòng)脈血管上（圖1），將浸有生理鹽水的紗布覆蓋頸部。0.5 h后將其右側(cè)頸總動(dòng)脈分離，將0.18 mm金屬環(huán)如前操作環(huán)套在右側(cè)頸總動(dòng)脈上。縫合頸部，蘇醒后放回籠中。監(jiān)測(cè)造模過(guò)程中慢性低灌注前后腦部血流變化。排除造模過(guò)程中出血死亡、術(shù)后未蘇醒及慢性低灌注后血流值未下降的小鼠，共納入45只小鼠。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組（n=15）、Tempol組（n=15）、腦心通組（n=15）。另設(shè)假手術(shù)組（n=10），假手術(shù)組除不做0.18 mm金屬環(huán)縮窄頸總動(dòng)脈外，其他操作如上。假手術(shù)組、模型組術(shù)后 1 d 灌胃給予生理鹽水 0.01 mL/（g·d），Tempol組灌胃給予 10 mg/mL Tempol溶液 0.01 mL/（g·d），腦心通組灌胃給予 350 mg/（kg·d）腦心通膠囊，連續(xù)給藥28 d。

1.3.2 Y迷宮 術(shù)后28 d后進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)。由A臂放入，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)480 s，記錄480 s內(nèi)小鼠在A(yíng)、B、C三個(gè)臂的穿梭次數(shù)。按A、B、C三個(gè)臂選擇性穿梭的次數(shù)（即每次經(jīng)過(guò)中心象限后均進(jìn)入不同于上一次進(jìn)入的象限，如ABC或CAB或ACB，而不是BAB或ACA）與總穿梭次數(shù)的比值，比值越大，說(shuō)明小鼠的空間記憶能力越好[7]。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 連續(xù)給藥28 d后，磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛各25 mL心臟灌流。取出腦組織后4%多聚甲醛固定。24 h后放入自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行脫水，石蠟包埋切片，選擇海馬部位的切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，于光鏡下觀(guān)察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞激活 按照膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（GFAP）試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行SABC免疫組化染色（一抗稀釋比為1∶100；二抗是即用型抗體），具體操作如下：①石蠟切片常規(guī)脫蠟經(jīng)乙醇脫水，PBS（pH 7.4）沖洗 5 min×3次；②3%H2O2室溫孵育 10 min，蒸餾水洗3次，PBS浸泡5 min；③置入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 6.0）的容器中，放入數(shù)控抗原熱修復(fù)儀中加熱至溫度達(dá)到120℃，保持15 min，然后排氣降溫，取出切片，自然冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次；④加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉30 min；⑤傾去多余的封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗于切片上，4℃過(guò)夜；⑥PBS沖洗5 min×3次，除去PBS液，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次；⑦滴加即用型 SABC溶液，37℃孵育 20 min，PBS沖洗 5 min×3次；⑧DAB溶液顯色，顯微鏡下觀(guān)察染色強(qiáng)度，以控制反應(yīng)時(shí)間，通常5～10 min，滴加蒸餾水終止反應(yīng)；⑨蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水沖洗10 min，鹽酸酒精分化5 s，蒸餾水沖洗10 min；⑩梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。對(duì)照：用0.01 mol/L PBS代替一抗做陰性對(duì)照。拍照，觀(guān)察星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。定量分析計(jì)數(shù)方法：于海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層，在40×10倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算每平方毫米內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮實(shí)驗(yàn)

自發(fā)交替百分比越大，表明動(dòng)物空間記憶的能力越強(qiáng)。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠慢性低灌注后空間記憶能力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，Tempol組、腦心通組進(jìn)臂的自發(fā)交替百分比顯著增加（P＜0.05）。各組別之間的Y迷宮總進(jìn)臂次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明各組小鼠常規(guī)的移動(dòng)未受到雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄和口服腦心通的影響。見(jiàn)表1。

表1 腦心通膠囊對(duì)慢性低灌注血管性癡呆小鼠空間記憶能力的影響

2.2 HE染色

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞呈多層排列，且整齊緊密，結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，外形規(guī)則，細(xì)胞層3～5層，細(xì)胞圓形或橢圓形，染色較淡，染色質(zhì)均勻，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯，呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色；模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂、稀疏，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，可見(jiàn)嗜酸性神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象，細(xì)胞核體積變小，深染，呈固縮狀或僅呈現(xiàn)很淡的藍(lán)色甚至藍(lán)色消失，細(xì)胞周?chē)g隙增大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空腔，細(xì)胞間質(zhì)成分顆粒狀分布明顯；與模型組比較，Tempol組、腦心通組神經(jīng)細(xì)胞外形基本規(guī)則，細(xì)胞周?chē)g隙較模型組小，細(xì)胞空腔現(xiàn)象比模型組輕，細(xì)胞間質(zhì)成分呈顯微排列，接近正常。見(jiàn)圖2（封三）。

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞激活

活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP陽(yáng)性染色后呈棕黃色，周?chē)蟹派錉钔黄?，呈分支狀，形態(tài)如蜘蛛樣。陰性對(duì)照切片未見(jiàn)GFAP免疫反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3（封三）。假手術(shù)組C57BL/6小鼠的海馬區(qū)僅見(jiàn)少量GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，染色淺，突起細(xì)、短（圖3箭頭所示）；與假手術(shù)組比較，模型組C57BL/6小鼠的海馬CA1區(qū)GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P＜0.05），細(xì)胞深染，突起變長(zhǎng)、增粗和分支增多；與模型組比較，Tempol組、腦心通組海馬CA1區(qū)GFAP染色數(shù)目減少（均P＜0.05），染色較淺，結(jié)構(gòu)明顯改善，分枝少，胞體形態(tài)趨于正常。

表2 腦心通膠囊對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響（±s）

表2 腦心通膠囊對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05；GFAP：膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白

假手術(shù)組模型組Tempol組腦心通組6886 27.01±6.18 49.93±4.67*38.71±11.67#40.68±8.57#組別 只數(shù) GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mm2）

3 討論

血管性癡呆嚴(yán)重影響著中老年人的健康，是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。慢性腦供血不足是血管性癡呆重要的誘發(fā)因素。從病理學(xué)上來(lái)說(shuō)，腦白質(zhì)損傷后海馬區(qū)發(fā)生反應(yīng)性的神經(jīng)膠質(zhì)增生并發(fā)玻璃樣變或纖維化及腦部血管壁增厚的動(dòng)脈硬化性病變等，此類(lèi)病變可導(dǎo)致腦組織多區(qū)域的功能損傷[8]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于慢性低灌注模型的構(gòu)造多為結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈[9-12]，對(duì)模擬臨床患者的實(shí)際情況有一定局限。本研究采用小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈微螺旋縮窄模型探討腦心通膠囊治療血管性癡呆的藥理作用，該模型對(duì)腦部進(jìn)行慢性低灌注，腦部組織膠質(zhì)細(xì)胞激活和白質(zhì)損傷明顯，更符合臨床實(shí)際。

腦心通膠囊是在補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上增加蟲(chóng)類(lèi)藥和活血化瘀藥而成的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，在臨床上廣泛用于治療心腦血管性疾病[13]。相關(guān)文獻(xiàn)提示腦心通膠囊可以通過(guò)抑制與炎癥細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損，減輕缺血再灌注對(duì)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，降低腦水腫程度，提高小鼠空間記憶能力[14-15]。本研究結(jié)果提示，腦心通可以改善慢性低灌注血管性癡呆模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及組織學(xué)病理形態(tài)。

本研究中采用Tempol作為陽(yáng)性藥，是一種新型自由基清除劑。文獻(xiàn)[16-17]提示Tempol可清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷；Tempol預(yù)處理可以改變腦組織的氧化環(huán)境，對(duì)缺血缺氧損傷的腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)具有保護(hù)作用[16-20]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)為數(shù)最多、功能復(fù)雜的一類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元的存活、腦組織損傷的修復(fù)有重要作用[21-25]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織受損時(shí)明顯增加，早期的腦損傷應(yīng)激性增加的星形膠質(zhì)細(xì)胞可參與腦組織內(nèi)相關(guān)修復(fù)作用，但過(guò)度增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌相關(guān)抑制因子，參與瘢痕形成，影響神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)和突觸的構(gòu)建，也可產(chǎn)生細(xì)胞炎性因子等，引發(fā)炎性反應(yīng)，加快腦組織損傷[26-28]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的重要骨架蛋白，GFAP表達(dá)程度可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍程度。本研究發(fā)現(xiàn)腦心通膠囊可以抑制慢性低灌注損傷模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，這可能是其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。

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