王浩，楊紅梅，郭啟雷

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素同屬酰胺醇類抗生素，具有廣譜抗菌能力，其中后兩者是前者的衍生物，常作為氯霉素的替代品使用。氯霉素最先用在養(yǎng)殖業(yè)，但隨后發(fā)現(xiàn)它能抑制人體骨髓造血功能，引起人類再生障礙性貧血等副作用，美國(guó)、日本等很多國(guó)家和歐盟都禁止在動(dòng)物源性食品中檢出。中國(guó)在2002年也把它列為違禁藥物，禁止在動(dòng)物食品中檢出。甲砜霉素對(duì)血液系統(tǒng)的毒性比氯霉素小，但可以抑制人體免疫系統(tǒng)、紅細(xì)胞和血小板的生成，除中國(guó)和日本外，歐共體和美國(guó)均禁用于食品動(dòng)物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在牛、豬和魚等可食用組織中最高殘留限量為50 μg/kg。氟苯尼考雖不會(huì)引起再生障礙性貧血癥，但對(duì)動(dòng)物胚胎有影響。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在可食性動(dòng)物組織中最高殘留限量為1 000 μg/kg。氯霉素類藥物由于有良好的抗菌和藥理特性，特別是甲砜霉素和氟苯尼考不易產(chǎn)生耐藥性，與同類藥物之間不存在交叉耐藥性，很多對(duì)氯霉素產(chǎn)生耐藥性的菌株對(duì)這兩種藥物仍然敏感，現(xiàn)已成為奶牛養(yǎng)殖病害防治的常用藥物。

目前，測(cè)定氯霉素類抗生素殘留的文獻(xiàn)比較多，方法主要是酶聯(lián)免疫法[1]、高效液相色譜法[2-3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[5-6]。酶聯(lián)免疫法不能定性，存在假陽性等情況；液相色譜法雖然對(duì)儀器要求不高，但檢出限不高，而且不能滿足確證要求；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖然可以確證，但是前處理繁瑣，不適合大量樣品的快速篩查；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近年來新興的檢測(cè)技術(shù)，由于其準(zhǔn)確、高效和高靈敏度，符合目前食品安全檢測(cè)所追求的快速高效的要求。本文采用堿性乙腈提取目標(biāo)物，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，適合于牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的同時(shí)快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇和乙腈，色譜純，德國(guó)Fisher 公司；氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素：w≥99%，美國(guó)Sigma 公司；實(shí)驗(yàn)所選用樣品為作者單位檢驗(yàn)樣品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Agilent 6410 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配Agilent1200 型液相色譜儀：美國(guó)Agilent 公司；RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海市亞榮生化儀器廠；KQ-5200 型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器：美國(guó)Milli-Q 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該溶液在-18 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0 μg/mL。

空白樣品提取液：選擇陰性樣品，按1.5 操作。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)儀器的靈敏度和線性范圍，吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白樣品提取液配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：資生堂MGⅢ-C18 柱，5 μm，2.1 mm ×150 mm。

條件：流速0.25 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相：甲醇（A）+20 mmoL/L 乙酸銨緩沖溶液（B）；梯度洗脫：0～5 min，B 由75%線性遞減至15%，5 min～15 min，B 保持15%。

1.4 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)；干燥氣：N2；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：8 L/min；汽化溫度：340 ℃。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的質(zhì)譜參數(shù)Table1 Parameters of Mass spectra of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol

1.5 樣品處理

稱取10.0 g 樣品，精確至0.01 g，置于25 mL 比色管中，用含1%氨水的乙腈溶液定容，渦旋2 min，再超聲波提取10 min，吸取15 mL 上清液至100 mL 蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，于45 ℃水浴中減壓蒸餾至1 mL 左右，加水充分溶解后定容至5 mL，濾紙過濾后待測(cè)（如渾濁嚴(yán)重，以8 000 r/min 高速離心10min，取上清液過濾膜）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件選擇

為了充分提取樣品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留，本實(shí)驗(yàn)分別選擇乙腈、甲醇、乙酸乙酯和1 %氨水的乙腈作為樣品提取溶液，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：甲醇和乙酸乙酯清除蛋白效果不好，提取液混濁；乙腈不適用于酸牛奶的提?。让顾仡惪股貫樨?fù)離子掃描，酸性溶液會(huì)抑制目標(biāo)化合物的離子化效率）；含1%氨水的乙腈既能有效地提取樣品中目標(biāo)化合物（加標(biāo)回收率>80%），又能除去樣品中的蛋白質(zhì)，因此，選擇此溶液作為樣品提取液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：為了有利于色譜峰的分離及鋒形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱和ZORBAX SB-Aq 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）進(jìn)行分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)資生堂MGⅢ-C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）效果較好。

流動(dòng)相的選擇：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用水作水相流動(dòng)相時(shí)，氯霉素色譜峰易展寬，因此本方法采用10 mmoL/L 乙酸銨溶液-甲醇為流動(dòng)相，利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測(cè)效果效果，測(cè)試開始時(shí)，流動(dòng)相中10 mmoL/L 乙酸銨溶液-甲醇的比例為75∶25，然后在0～5 min 改變二者的比例為15∶85，這一部分主要是洗脫測(cè)定液中極性較強(qiáng)的雜質(zhì)，5 min～15 min 保持此比例，這一部分主要是洗脫測(cè)定液中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素。通過上述兩步梯度，在15 min 內(nèi)，可以較好的分離測(cè)定液中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素（結(jié)果見圖1）。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式將濃度為100 ng/mL 的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素注入離子源中，在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002/657/EC 指令規(guī)定對(duì)于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4 個(gè)確證點(diǎn)的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2 個(gè)以上的子離子。因此，以上述3種目標(biāo)化合物的分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對(duì)得到的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳，得到氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的最佳質(zhì)譜參數(shù)（結(jié)果見表1）。

圖1 的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素加標(biāo)MRM 色譜圖Fig.1 MRM Chromatogram of a blank sample spiled with chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol

2.4 線性關(guān)系及檢出限

空白樣品提取溶逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y 為峰面積，Counts；x為濃度，μg/kg），同時(shí)用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，在信噪比均大于3 的條件下能檢出，將此添加量定為檢出限。結(jié)果見表2。

表2 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的線性方程、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table2 The linear equation，correlation coefficient and limits of detection for chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol

2.5 方法的回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱取空白樣品6 份，每份10.00 g，共3組，分別添加成濃度為0.3、3.0、10.0 μg/kg 的待測(cè)樣品，按供試品制備方法制備后，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

從表3中可看出，不同濃度平均加標(biāo)回收率80.7%～93.6%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.85%～9.35%（n=6）。圖1為加標(biāo)樣品中MRM 色譜圖。

3 結(jié)論

建立了牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該法樣品加標(biāo)回收率80.7%～93.6%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.85%～9.35%（n=6），方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

表3 加標(biāo)樣品回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table3 Recovery and relative standard deviation（RSD）of in spiled sample（n=6）

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