宋小寧，楊文韜，李 楨，趙 軍，李玉鋒

（西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

檸檬總蛋白的提取工藝參數(shù)優(yōu)化

宋小寧，楊文韜，李 楨，趙 軍，李玉鋒*

（西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

以檸檬為原料，通過單因素試驗、正交試驗，研究了不同因素對檸檬總蛋白提取的影響。結(jié)果表明，在磷酸緩沖液中蛋白質(zhì)的溶解性較好，粗提取的最佳工藝為：硫酸銨飽和度80%，溫度20℃，料液比1∶20（g∶mL），浸提時間4 h，在此條件下蛋白提取率是83%。因素對蛋白提取率的影響程度依次為：溫度＞浸提時間＞料液比。

檸檬總蛋白；高效液相色譜；分離

檸檬（Citrus limon）是蕓香科柑桔屬常綠小喬木，是歐美國家主栽果樹品種[1]?，F(xiàn)主要產(chǎn)地為美國、意大利、西班牙和希臘。我國檸檬產(chǎn)量不足世界檸檬產(chǎn)量的1%，但四川檸檬的總產(chǎn)量占到了我國產(chǎn)量的80%以上[2-3]。目前國內(nèi)外檸檬的加工利用主要是商品化鮮果、濃縮汁、檸檬香精油、檸檬果膠、蜜煉檸檬茶等休閑食品[4]。檸檬香精油主要用于食品，化妝品，醫(yī)藥和化工等行業(yè)[5]，研究發(fā)現(xiàn)檸檬香精油可以抑制黑曲霉和金黃色葡萄球菌等微生物，從而抑制食品腐敗[6]。檸檬的食療價值非常大，具有預(yù)防心血管疾病[7]、抗菌消炎、抗癌[8-11]、誘導(dǎo)HL-60腫瘤細(xì)胞凋亡[12]、延緩衰老抑制色素沉淀、降低動脈粥樣硬化[13]等功效，檸檬富含維生素C和維生素P，能增強血管彈性和韌性，可預(yù)防和治療高血壓[14]。GHOLAMALIJ等[15]研究和探索了檸檬的降血糖作用，對糖尿病的治療進(jìn)展起到一定的推動作用。

本試驗以尤力克檸檬為原料，研究了硫酸銨飽和度（硫酸銨的實際濃度：飽和硫酸銨的濃度）、浸提溫度、浸提時間、料液比對檸檬總蛋白提取的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尤力克新鮮檸檬：四川安岳縣；硫酸銨、磷酸二氫鈉、氯化鈉、硫酸、硼酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）均為分析純：成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國迪馬DIKMA試劑公司；脂肪酶（來源于黑曲霉）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AMR800B多功能食品加工機：中山市安蜜爾電器實業(yè)有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；LC-20AB高效液相色譜儀：日本島津公司；PHS-3C酸度計：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；5702R冷凍離心機：德國Eppendorf；BT12-D電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 檸檬總蛋白的提取工藝流程與操作要點

鮮檸檬榨汁→過濾→浸提液提取→硫酸銨鹽析→離心→冷凍干燥→粗蛋白

檸檬汁的制備：取3顆完整檸檬，加入榨汁機中榨汁15 min。將打碎的果肉組織先通過8層紗布過濾再通過16層紗布過濾，得到較澄清的檸檬汁，加入脂肪酶進(jìn)行酶解，消除脂肪的干擾。

蛋白溶液的制備：向檸檬汁中分別加入4種不同的蛋白提取液，在不同溫度下靜置一段時間后，4℃，10 000×g冷凍離心，取上清液，得蛋白質(zhì)溶液。

鹽析：向蛋白溶液中加入飽和硫酸銨將蛋白質(zhì)沉淀。沉淀得到的蛋白質(zhì)經(jīng)離心分離，凍干，得粗蛋白。通過凱氏定氮法檢測粗蛋白中蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 提取工藝參數(shù)優(yōu)化

通過單因素試驗與正交試驗設(shè)計，優(yōu)化檸檬總蛋白提取參數(shù)。

（1）單因素試驗設(shè)計：稱取一定量的鮮檸檬汁，在不同稀釋倍數(shù)的條件下加入適量的提取液，分別加熱到一定的溫度開始浸提。浸提不同時間后收集提取液，加入不同含量的硫酸銨進(jìn)行鹽析，以蛋白純度和蛋白提取率為評價指標(biāo)，考察不同因素對檸檬總蛋白提取的影響。

（2）正交試驗設(shè)計：選取浸提溫度（A）、浸提時間（B）、檸檬汁與磷酸緩沖溶液的比例（料液比）（C）3個因素，采用正交表L9（33）進(jìn)行試驗，正交試驗因素與水平見表1。

1.3.3 蛋白提取率和蛋白純度的測定方法

蛋白含量的測定采用凱氏定氮法，蛋白純度計算公式如下：

1.3.4 檸檬蛋白及多肽的分離

以類胰島素為參考標(biāo)準(zhǔn)品，以實驗所得的檸檬總蛋白粗品為供試品，分別取1 mg加5%的乙腈水溶液配成蛋白溶液，低溫離心10 min，取上清液，進(jìn)行色譜分離。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件：Sapphire C18（4.6 mm×150 mm，5μm）為色譜柱；流動相：A液為乙腈∶水=5∶95，0.05%三氟乙酸；B液為乙腈∶水=80∶20，0.05%三氟乙酸；梯度洗脫條件：0～1 min（85%A，15%B），1～50 min（50%A，50%B）。柱溫30℃，檢測波長220 nm，進(jìn)樣量10μL，流速0.8 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 浸提液和pH對檸檬總蛋白提取的影響

分別以水、氯化鈉溶液、Tris-鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液為提取液，在不同pH值條件下提取檸檬總蛋白，以蛋白提取率為指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，4種浸提液的提取效果為：磷酸緩沖液＞Tris-鹽酸緩沖液＞氯化鈉溶液＞水，磷酸緩沖液提取檸檬總蛋白效果最好，因此選用磷酸緩沖液作為浸提液。同時由圖1也可看出，在選取的幾個pH值中，在pH值為7時蛋白提取率最高，提取率在pH值為6時最低，說明檸檬蛋白質(zhì)的等電點在pH 6附近?？紤]蛋白提取率及蛋白質(zhì)在極酸和極堿環(huán)境下容易發(fā)生變質(zhì)，在蛋白質(zhì)溶解過程取pH值為7，在鹽析過程取pH值為6。

2.1.2 浸提溫度對檸檬總蛋白提取的影響研究

稱取鮮檸檬汁10 g，浸提時間1 h，料液比1∶20（g∶mL），pH值為7，硫酸銨飽和度60%的條件下分別測定溫度為4℃、10℃、20℃、30℃、40℃時蛋白純度和蛋白提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在4～20℃溫度范圍內(nèi)升高溫度有助于增強蛋白質(zhì)的溶解性，提高蛋白提取率。20℃后，蛋白提取率隨溫度升高而下降?？赡苁怯捎跍囟雀哂?0℃后，蛋白質(zhì)可能發(fā)生變性，使蛋白質(zhì)沉淀，而浸提液中的蛋白質(zhì)含量降低。推斷可能是因為溫度升高增大了其他物質(zhì)的溶解性，使提取到的蛋白質(zhì)中含有其他雜質(zhì)。因此綜合考慮蛋白提取率和蛋白純度，最適溫度為20℃。

2.1.3 浸提時間對檸檬總蛋白提取的影響研究

稱取鮮檸檬汁10 g，在溫度為10℃，料液比為1∶20（g∶mL），pH值7，硫酸銨飽和度60%的條件下分別測定浸提時間為1 h、2 h、4 h、8 h、16 h時的蛋白純度和蛋白提取率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在1～4 h范圍內(nèi)隨提取時間延長蛋白提取率顯著增加，＞4 h后，隨提取時間延長蛋白提取率無顯著變化，但蛋白純度在浸提時間為2 h時最高，＞2 h后隨浸提時間的增長蛋白純度略有下降后并保持穩(wěn)定。因此在蛋白質(zhì)的溶解過程應(yīng)使蛋白提取率較大，同時考慮時間較長有可能會使部分蛋白質(zhì)變性以及成本問題，選取4 h為最適浸提時間。

2.1.4 料液比對檸檬總蛋白提取的影響研究

稱取鮮檸檬汁10 g，在溫度10℃，提取時間1 h，pH值7，硫酸銨飽和度60%的條件下分別測定料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）時蛋白純度和蛋白提取率，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，在一定范圍內(nèi)蛋白提取率隨料液比的增大提取率而隨之增大，但料液比＞1∶20（g∶mL）后，蛋白提取率不再增加，可能是由于增大料液比，蛋白質(zhì)的溶解度增大，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)接近飽和后繼續(xù)增加料液比蛋白質(zhì)溶解度不再增加，而蛋白純度隨料液比增加先下降然后保持穩(wěn)定。綜合考慮選擇最適料液比為1∶20（g∶mL）。

2.1.5 硫酸銨飽和度對檸檬總蛋白提取的影響

分別測定硫酸銨飽和度為20%、40%、60%、80%、100%時對檸檬總蛋白提取的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，硫酸銨飽和度較大地影響檸檬總蛋白的提取，在鹽析過程中隨硫酸銨飽和度的增大，蛋白提取率隨之增大，當(dāng)硫酸銨飽和度＞80%時蛋白提取率開始下降。硫酸銨飽和度對蛋白純度的影響不明顯，因此鹽析過程選擇硫酸銨的飽和度為80%。

2.2 浸提工藝正交試驗結(jié)果

選取浸提溫度（A）、浸提時間（B）、料液比（C）作為正交試驗因素，以蛋白提取率為評價指標(biāo)進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化檸檬總蛋白提取參數(shù)，正交試驗結(jié)果與分析見表2。

由表2可知，對提取效果影響的主次順序依次為提取溫度＞浸提時間＞料液比，其中浸提時間和料液比均對檸檬總蛋白提取效果影響較小，以蛋白提取率為考察指標(biāo)，最優(yōu)組合為為A2B2C2。即最佳條件是溫度20℃，提取時間4 h，料液比1∶20（g∶mL），在最佳浸提條件下進(jìn)行驗證試驗，檸檬蛋白提取率為83%。由表3可知，根據(jù)各變異來源F比與F臨界值對比，溫度為最顯著因素，時間和料液比為不顯著因素。因素的主次順序為溫度＞時間＞料液比。

2.3 檸檬總蛋白質(zhì)及多肽的HPLC分析

HPLC法測得的類胰島素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和供試品色譜圖見圖6。由圖6A可知，類胰島素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為7 min，從圖6B可看出檸檬蛋白質(zhì)也在相同保留時間出現(xiàn)色譜峰。這樣看來檸檬多肽中含有與類胰島素結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)。

3 結(jié)論

通過試驗確定了檸檬總蛋白提取的最佳提取工藝條件為硫酸銨飽和度80%，提取溫度20℃，料液比1∶20（g∶mL），提取時間4 h。該條件下蛋白質(zhì)提取率為83%，且費用低，可應(yīng)用于檸檬副產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]高俊燕，朱春華，李進(jìn)學(xué)，等.檸檬加工綜合利用的研究進(jìn)展[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2009，5（1）：64-68.

[2]彭長江.我國檸檬產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀[J].柑桔與亞熱帶果樹信息，2005，21（6）：4-6.

[3]四川省社會科學(xué)院課題組.以產(chǎn)銷體系建設(shè)為突破口提高檸檬產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平——基于四川省安岳縣檸檬產(chǎn)銷情況調(diào)查與分析[J].農(nóng)村經(jīng)濟，2011（4）.

[4]王 毅，劉學(xué)文.蜜煉檸檬茶的研制[J].食品工業(yè)，2010（5）：62-63.

[5]孫緒兵，沈王慶.檸檬皮中香精油溶劑浸提工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（16）：3920-3921.

[6]VIUDO-MARTOS M,RUIZ-NAVAJAS Y.Antifugal activity of lemon, mandarin,grapefruitand orange essentialoils[J].Food Control,2007,12 (3):1-9.

[7]于玉涵，焦必寧.檸檬中類黃酮的含量分析和檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（12）：518-523.

[8]BHALLA Y,GUPTA V K,JAITAK V.Anticancer activity of essential oils:a review[J].J Sci Food Agr,2013,93(15):3643-3653.

[9]JIA S S,XIG P,ZHANG M,etal.Induction ofapoptosis by D-limonene is mediated by inactivation of AKt in LS 174T human colon cancer cells [J].Oncology Reports,2013,29(1):349-354.

[10]LU X G,ZHANG L B,FENG B A,et al.Inhibition of growth and metastasis of human gastric cancer implanted in nude mice by d-limonene[J].World J Gastroenterol,2004,10(14):2140-2144.

[11]RABI T,BISHAYEE A.d-Limonene sensitizes docetaxel-in-duced cytotoxicity in human prostate cancer cells:Generation of reactive oxygen species and induction ofapoptosis[J].J Carcinog,2009,8:1-9.

[12]OGATA S,MIYAKE Y,YAMAMOTO K,etal.Apoptpsis induced by the flavonoid from lemon fruit(Citrus limon BURM.F.)and its metabolites in HL-60 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2000,64(5):1075-1078.

[13]MIYAKE Y,SUZZUKIE,OHYA S,etal.Lipid-lowering effectof eriocitrin,the main flavonoid in lemon fruit,in rats on a high-fat and high-cholesteroldiet[J].J Food Sci,2006,71(9):S633-S637.

[14]EL-SHAFAE A,EL-DOMIATY M.Improved LC methods for the determination of diosmin and/or hesperidin in plant extracts and pharmaceuticalformulations[J].J Pharmaceut Biomed,2001,26(4):539-545.

[15]GHOLAMALIJ,MOHSEN M,SHAHRAM S.Effectof fumitory,celery and lemon on blood glucose and histopathology of pancreas of alloxan diabetic rats[J].J Appl Anim Res,2007,31(1):101-104.

Optimization of process parameters for lemon protein extraction

SONGXiaoning,YANGWentao,LIZhen,ZHAOJun,LIYufeng*

(School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

Using lemon as raw material,the effectof differentfactors on lemon protein extraction was evaluated by single factor testand orthogonal test.The results showed thatthe solubility ofthe protein in phosphate buffer was the optimal.The optimalextraction process was ammonium sulfate concentration 80%,temperature 20℃,solid-liquid ratio 1∶20(g∶ml),extraction time 4 h.Under these conditions,the extraction ratio was 83%.The factors influencing the protein extraction rate in orderwas temperature,extraction time,solid-liquid ratio.

lemon protein;high performance liquid chromatography;isolation

TQ936

A

0254-5071（2015）02-0043-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.010

2015-01-10

國家級星火計劃課題（2013GA810002）

宋小寧（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者：李玉鋒（1965-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。