李斌，黃艷，王宇，邵晨(浙江師范大學生態(tài)研究所，浙江金華321004)

蛙壺菌(Batrachochytrium dendrobatidis)是壺菌門(Chytridiomycota)、壺 菌 綱 (Chytridiomycetes)、壺 菌 目(Chytridiales)的一個新屬(Batrachochytrium)，且蛙壺菌是該屬的唯一物種［1］。蛙壺菌可在4～25℃的溫度下生長，最適溫度17～25℃，它們可以在寄主身上過冬。但蛙壺菌對熱較敏感，在25℃以上的環(huán)境中生長較差，若高于28℃，生長就會停止，且在37℃加熱4 h或47℃加熱30 min或60℃加熱5 min致死率將達到100%［2］。蛙壺菌具有快速的傳染性和廣泛的暴發(fā)性，但同時其傳染性和暴發(fā)性具有明顯的季節(jié)性和地域性。壺菌病在冬季暴發(fā)率較高，且多發(fā)生在高海拔地區(qū)和某些熱帶雨林山區(qū)［3］。蛙壺菌主要寄生于無尾兩棲類成體皮膚和蝌蚪口器中，通過寄主生活的水體進行傳播，患病的蛙和蝌蚪攜帶的蛙壺菌游動孢子會隨表皮角質層脫落而被釋放到水中，健康蛙和蝌蚪則會因接觸含蛙壺菌游動孢子的水而感染壺菌?。?］。蛙壺菌主要通過影響蛙體皮膚的功能來影響其機體的生理機能，皮膚對兩棲動物保持物質轉運和電解質平衡具有重要作用，個體感染蛙壺菌后，依賴皮膚的電解質轉運被抑制率達50%以上，血漿鈉、鉀濃度分別減少了20%和50%，嚴重影響了心肌功能，從而導致心跳驟停而死亡［5］。

壺菌病廣泛性暴發(fā)是導致全球兩棲類種群數量急劇下降的主要原因之一。研究發(fā)現此病自1978年已經遍布整個澳洲，目前非洲、南美洲、北美洲、歐洲和亞洲均發(fā)現兩棲動物感染蛙壺菌［1，6－16］。自2010年國內首次報道在云南的滇蛙(Rana pleuraden)、牛蛙(Rana catesbeiana)、云南臭蛙(Odorrana andersonii)、昭覺林蛙(Rana chaochiaoensis)中發(fā)現蛙壺菌感染以來，四川、湖北、貴州、湖南、浙江、北京、天津、河北的石家莊以及河南的鄭州在野外均發(fā)現蛙壺菌的分布［15－16］。同時，研究表明在20世紀八九十年代的國內館藏標本中也檢測到蛙壺菌的DNA分子［17－18］。說明我國兩棲類蛙壺菌的感染可能要追溯到20世紀八九十年代，甚至更早。目前，壺菌病檢測主要依賴組織學、免疫組織化學以及PCR等方法，但組織學和免疫組織化學法對壺菌病感染早期不敏感，且對蛙體的正常生存具有一定影響。用常規(guī)PCR或改進的巢式PCR和實時定量PCR技術，靈敏性和特異性相對較高，有助于在飼養(yǎng)和野生的兩棲動物種群中及早發(fā)現蛙壺菌［19－20］。筆者對常規(guī)PCR、巢式PCR和實時定量PCR在蛙壺菌檢測中的應用分別進行概述，并對這3種PCR方法的優(yōu)缺點進行分析與比較，為兩棲類壺菌病檢測方法的選擇提供參考。

1 蛙壺菌的PCR檢測方法

1.1 常規(guī) PCR PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶鏈式反應，它是一種體外快速擴增特定DNA片段的方法。1985年，美國Mullis等［21］學者首創(chuàng)了PCR技術，并由美國PE-Cetus公司開發(fā)研制。PCR反應中，利用堿基互補配對的原理，通過雙鏈DNA的高溫變性(denaturation)、低溫退火(annealing)和適溫延伸(extension)3步實現一個循環(huán)，在不斷循環(huán)中，每一循環(huán)所合成的新DNA鏈，又作為下一循環(huán)中的模板，擴增產物的量以指數級方式增加，一般單一拷貝的DNA片段擴增循環(huán)25～30次，可擴增l00萬～200萬倍［22］。自PCR技術問世以來，已在微生物檢測、臨床診斷、水產養(yǎng)殖等領域得到廣泛應用，如姜莉莉等［23］選擇外毒素A基因(PEA)作為 PCR檢測的目標基因，建立了水貂綠膿桿菌PCR快速檢測方法;張立軍等［24］通過PCR技術鑒定擬南芥T-DNA插入突變體atsuc3等。

Annis等［19］在利用常規(guī)PCR對蛙壺菌進行檢測時，根據蛙壺菌位于5.8 S rDNA的特異性DNA片段設計引物，通過設計的引物Bd1a(5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3')和Bd2a(5'-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3')進行PCR擴增得到目的片段［19］，回收和純化目的片段，再將得到的目的片段進行轉化、克隆、測序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進行序列分析。

1.2 巢式PCR 巢式PCR(Nested PCR)是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展起來的DNA擴增技術，具有較高的特異性和靈敏度，巢式PCR甚至可以在污染或已經降解的樣本中進行DNA擴增［25］。其高特異性和靈敏度使得它在醫(yī)學和生物學研究方面都有廣泛應用［26－28］。巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片斷。第一輪擴增中，外引物用以擴增得到特異性的DNA片段，作為第二輪擴增的模板，第二對引物特異性的擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片斷，得到擴增的目的片段［29］。兩輪PCR反應增加了目的基因的數量，從而提高了檢測靈敏度［30］。

2005年Garner等［9］采用巢式PCR對歐洲壺菌病進行研究，結果表明蛙壺菌在歐洲具有廣泛而不規(guī)則的分布。2009年Gaertner等［31］利用巢式PCR對美國德州5種地方性蠑螈的壺菌病調查中發(fā)現5種蠑螈都存在一定程度的蛙壺菌感染，同年，Goka等［32］同樣使用巢式PCR對日本壺菌病進行調查，發(fā)現在部分兩棲動物中也存在壺菌病，另外，2012年Bai等［16］使用巢式PCR對我國壺菌病的調查中發(fā)現云南、貴州、浙江等10省中均有蛙壺菌分布。在使用巢式PCR檢測蛙壺菌中，蛙壺菌的一段特異性DNA片段是位于ITS4和ITS5(ITS:轉錄間隔區(qū))之間的一段DNA序列(圖1)，試驗中可以使用真菌通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')進行PCR擴增，得到一段特異性的DNA片段［33］。以得到的DNA片段作為模板，使用蛙壺菌特異性引物Bd1a(5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3')和Bd2a(5'-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3')進行PCR擴增［19］，后續(xù)步驟與常規(guī)PCR類似，將得到的目的片段依次進行回收、純化、轉化、克隆和測序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進行序列分析。

1.3 實時定量PCR 實時定量PCR(real-time TaqMan PCR)是由美國Applied Biosystems公司于1996年研發(fā)的一種新型實時定量檢測特定核酸技術，該技術將核酸探針技術、PCR技術、熒光共振能量傳遞技術和光譜技術有機結合起來，在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針來實現其實時定量功能［34－35］。

2006年Garner等［36］對北美洲的加拿大、美國等8個國家的牛蛙(Rana catesbeiana)壺菌病研究中發(fā)現7個國家的牛蛙中都檢測到蛙壺菌感染。同年，Kriger等［37］對野外101只巨型斑蟾(Mixophyes iteratus)使用實時定量PCR和組織學方法對蛙壺菌進行檢測，結果表明實時定量PCR的靈敏度明顯高于組織學檢測方法。2010年Bai等［15］在我國云南5種兩棲動物中的4個物種中檢測到壺菌病。Bataille等［13］對韓國壺菌病分布情況研究中發(fā)現壺菌病已在韓國廣泛傳播。以上幾項調查研究中均使用實時定量PCR技術，在使用實時定量PCR檢測蛙壺菌時，引物和探針一般采用通用壺菌檢測引物和探針:

引物:ITS1-3 Chytr:5'-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3';5.8SChytr:5'-AGCCAAGAGATCCGTTGTCAAA-3';探針:ChytrMGB:5'-6FAM CGAGTCGAACAAAAT MGBNFQ-3'。

在反應條件上實時定量PCR與常規(guī)PCR和巢式PCR有所不同:50℃ 2 min，95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，50個循環(huán)［20］。將得到的目的片段依次進行回收、純化、轉化、克隆和測序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進行序列分析。

2 3種PCR鑒定方法的分析與比較

2.1 巢式PCR與常規(guī)PCR比較 常規(guī)PCR中使用Bd1a和Bd2a作為引物擴增出來的DNA條帶約為300 bp［19］。在巢式PCR中，第一步以ITS4和ITS5為引物擴增出的條帶約600bp，第二步PCR以Bd1a和Bd2a為引物擴增出目的片段［19］。由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續(xù)放大的可能性，保證了反應的特異性;同時，第一步PCR的產物作為第二步PCR的模板，克服常規(guī)PCR“平臺期效應”的限制，使擴增倍數提高，從而極大地提高了PCR的靈敏度;另外，內側引物擴增的模板是外側引物擴增的產物，第二步PCR反應能否順利進行，是對第一階段反應正確性的鑒定，以增加了整個反應的準確性及可行性［29］。但經過2次PCR反應，在增加反應的特異性、靈敏度、準確性和可行性的同時也增加了兩步反應之間試驗污染的概率。

2.2 實時定量PCR與常規(guī)PCR比較 實時定量PCR中通過引物(ITS1-3 Chytr和5.8S Chytr)和探針(ChytrMGB)與模板的特異性雜交來鑒別模板，相對于常規(guī)PCR而言，具有較高的準確性、特異性和較低的假陽性等優(yōu)點［37］;在實時定量PCR中將計算機和探針技術相結合，對試驗中每個循環(huán)都可以實時監(jiān)測，同時實現了PCR從定性到定量檢測的飛躍，提高了試驗的精確性，自動化程度較高，易于進行電腦化數據管理［38］。

2.3 巢式PCR與實時定量PCR比較 巢式PCR和實時定量PCR都有各自的利弊，它們都具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。進一步比較兩者，巢式PCR經歷兩步PCR反應會增加試驗中污染的概率，而實時定量PCR則是在一個封閉的環(huán)境中完成PCR過程，減少試驗中污染的可能性;而且，實時定量PCR還具有快速、自動化程度高、重復性好等特點［38］。另一方面，巢式PCR也有其優(yōu)越性:首先，巢式PCR在蛙壺菌檢測中具有比實時定量PCR更高的靈敏度;其次，若蛙壺菌DNA中具有相對保守性的ITS區(qū)中出現替換或缺失等突變時，實時定量PCR中的探針可能會出現與模板雜交失敗的情況，影響PCR的效果，巢式PCR則可以避免此類問題的出現［32］。Goka等［32］使用3種PCR方法對26種四大類不同基因型的蛙壺菌進行檢測，結果表明靈敏度由高到低依次為巢式PCR、實時定量PCR、常規(guī)PCR，另外，當蛙壺菌在ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)域有替換或缺失時，只有巢式PCR的結果為陽性。

3 展望

兩棲動物種群全球性衰退是21世紀最緊迫的環(huán)境問題之一，全球2/3的兩棲動物種群面臨生存危機［39］。高致死性真菌病原體蛙壺菌是引起兩棲類種群數量急劇下降的主要原因之一，其驚人的傳播速度及廣泛暴發(fā)對世界范圍內的兩棲動物種群數量構成重大威脅。蛙壺菌己在世界各地發(fā)現并流行，我國具有豐富的兩棲動物資源和適合蛙壺菌生存的廣闊的地理環(huán)境，由于蛙類貿易的發(fā)展，壺菌病已在我國傳播蔓延。為了阻止壺菌病在我國進一步擴散蔓延與惡化，必須加強立法，在蛙類貿易進出口建立有效可靠的檢疫防御措施。因此，得到快速、靈敏、簡單、準確的蛙壺菌檢測方法迫在眉睫。

另一方面，生物芯片(Biochip，又稱DNA芯片、基因芯片)技術日新月異，利用生物芯片技術在對核酸、蛋白質、生物組織碎片或完整的活細胞進行檢測時具有大規(guī)模高通量、靈敏準確、快速簡便等優(yōu)點［40－42］。該技術被廣泛應用于基因表達分析［43－45］、DNA 序列測定［46－47］、新基因發(fā)現［48－49］、醫(yī)學診療［50－51］等方面。若能將生物芯片技術運用到蛙壺菌的檢測上，不僅可以快速方便準確地檢測蛙壺菌的存在，而且可以同時檢測到不同種類的蛙壺菌，甚至明確不同蛙壺菌的基因型及菌株系。

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