李 賀，林日輝，劉作嬌，賀俊斌，李訓(xùn)碧，龍 寒(.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006;.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006)

木薯淀粉是低廉、豐富、易得的可再生資源，它是由多個(gè)葡萄糖單元組成的天然多糖親水性高分子化合物，由于淀粉親水性質(zhì)的局限性，限制了淀粉在工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用，為了擴(kuò)拓寬淀粉的應(yīng)用領(lǐng)域，通常需要對(duì)淀粉進(jìn)行改性，進(jìn)而對(duì)淀粉衍生物進(jìn)行深入研究。連喜軍等［1］采用DPPH法研究了不同品種甘薯淀粉的抗氧化性;林艷平等［2］研究了玉米淀粉硫酸酯的抗氧化性;張曉變等［3］研究了雙醛馬鈴薯淀粉的抗氧化性能;而有關(guān)以松香和木薯淀粉為原料在脂肪酶的催化作用下制備松香酸淀粉酯并對(duì)其抗氧化性能的研究尚未見報(bào)道。

松香，從針葉樹分泌物而得到的一種天然產(chǎn)物，是以脫氫樅酸、左旋海松酸和海松酸為主的混合物，其分子式為C19H29COOH。松香酸結(jié)構(gòu)中不僅有“－COOH”和“C=C”2個(gè)活性中心，而且還存在三環(huán)非骨架的特殊結(jié)構(gòu)，三環(huán)非骨架結(jié)構(gòu)類似于石油基脂環(huán)族和芳族化合物。松香作為還原劑在焊接方面進(jìn)行應(yīng)用［4］，在高溫下，銅易被氧化，造成虛焊和焊接不牢等，采用松香為還原劑，可以阻止銅被氧化，從而保證焊接質(zhì)量。同時(shí)，通過利用三環(huán)非骨架的親電取代反應(yīng)引入鹵素原子、硝基、羥基、羰基等，對(duì)芳香苯環(huán)修飾來提高化合物生 物 活 性［5］。Esteves 等［6－7］和 Zaharescu 等［8］、Littmann等［9］研究表明，通過利用脫氫樅酸異丙基的位阻，通過酯化、硝化、還原、N－芳基化反應(yīng)制備一系列12、14位二芳胺，研究了這些位阻胺作為抗氧化劑的作用，有望在醫(yī)藥、高分子材料、食品等工業(yè)得到廣泛應(yīng)用。Gigante等［10］通過以脫氫樅酸為原料，制備了脫氫樅酸茶多酚衍生物，并對(duì)其抗菌、抗癌、抗誘變、抗病毒、抗類風(fēng)濕性和抗硝基氧化性能進(jìn)行了測定。

目前，方華祥等［11］和唐世華等［12］利用松香作為羧基供體采用化學(xué)法合成松香淀粉酯。然而，酶法與化學(xué)法相比具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)成本低和副產(chǎn)物較少等優(yōu)點(diǎn)。筆者選取木薯淀粉、預(yù)處理淀粉、松香酸淀粉酯作為研究對(duì)象，采用DPPH法研究了松香酸淀粉酯的抗氧化性，結(jié)果表明，合成產(chǎn)物松香酸木薯淀粉酯的抗氧化性較原淀粉和預(yù)處理淀粉得到改善，以期為進(jìn)一步拓展酶催化合成的松香酸淀粉酯在食品，化妝品、生物材料等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 木薯淀粉(食品級(jí)):廣西岑溪市三角淀粉有限責(zé)任公司;松香木薯淀粉淀粉酯:廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制;1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH):上?？笊锛夹g(shù)有限公司;無水乙醇(AR):成都市科龍化工試劑廠;氫氧化鈉(AR):天津市博迪化工有限公司。

AL104電子天平:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;HJ－6A多頭磁力攪拌器:金壇市鴻科儀器廠;Magna 550型傅立葉變換紅外光譜儀:美國賽默飛世爾科技公司;SUPRA 55型場發(fā)射掃描電子顯微鏡:ZEISS。

1.2 合成工藝流程

1.2.1 木薯淀粉的預(yù)處理。將氫氧化鈉與尿素以一定的質(zhì)量比加入到100 ml蒸餾水中，配制成一定濃度的氫氧化鈉/尿素水溶液，并置于冰箱中冷卻，在快速機(jī)械攪拌下慢慢加入一定質(zhì)量的木薯淀粉干基，攪拌直至得到透明、均相的淀粉糊。滴加稀鹽調(diào)節(jié)溶液pH至中性，緩慢滴加95%的乙醇水溶液洗滌數(shù)次直至無氯離子，再用無水乙醇洗滌以脫去水分，70℃下真空干燥12 h得到預(yù)處理淀粉。

1.2.2 松香淀粉酯的合成。在150 ml三角瓶中，分別加入一定質(zhì)量的原木薯淀粉和預(yù)處理木薯淀粉，然后加入一定量的松香和二甲亞砜溶液，搖勻，溶解后，加入一定量的Novozym 435固定化脂肪酶，恒溫反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻到室溫，離心取上清液，在劇烈攪拌下加入150 ml甲醇，有大量沉淀析出，離心，甲醇洗滌3次，每次20 ml，再用30 ml丙酮洗滌4 h后離心，產(chǎn)物于烘箱中70℃恒溫干燥，粉碎制得成品。其合成路線見圖1。

1.2.3 松香淀粉酯取代度(DS)的測定。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的樣品置于150 ml三角瓶中，加入25 ml DMSO溶液，10 ml 0.2 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，50℃水浴振蕩2 h，冷卻至室溫，滴加幾滴酚酞溶液呈紅色，然后用0.1 mol/L的 HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至無色，記錄消耗的鹽酸體積，平行測定3次，同時(shí)作空白試驗(yàn)求出空白和樣品所消耗的鹽酸體積V1和V2。根據(jù)公式(1)、(2)計(jì)算松香淀粉酯的DS。

式中，DS—淀粉分子中每個(gè)葡萄糖單元上的羥基平均被取代的數(shù)目;V1—滴定空白消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml;V2—滴定樣品消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml;C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;m—樣品的質(zhì)量，mg;285—松香基團(tuán)的平均相對(duì)分子質(zhì)量;162—淀粉葡萄糖單元的相對(duì)分子質(zhì)量;w—松香基團(tuán)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DPPH法測定松香酸淀粉酯抗氧化性。DPPH是一種穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可見光區(qū)最大吸收峰為517 nm。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，溶液顏色變淺，517 nm處吸收光度變小。吸收度變小程度與自由基被清除程度呈線形關(guān)系，可用于檢測自由基清除程度，從而評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)抗氧化能力。其能力以抑制率表示，抑制率越大，表明抗氧化能力越強(qiáng)。

式中，Ai為樣品液與DPPH溶液混合液吸收度;Aj為樣品液與乙醇混合液吸收度;Ac為DPPH溶液與乙醇混合液吸收度。

1.3.2 不同濃度對(duì)淀粉抗氧化性的影響。分別配制不同濃度原淀粉、預(yù)處理淀粉及松香酸淀粉酯樣品液:10.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mg/ml，精確吸取樣品溶液 3.5 ml，加入DPPH溶液0.5 ml，搖勻，在避光處放置30 min，以70%乙醇為空白，分別測定517 nm處吸光度Ai。同時(shí)，測定樣品溶液在517 nm處吸光度Aj;再測定DPPH溶液在517 nm處吸收度Ac;進(jìn)一步試驗(yàn)采用最大抑制率時(shí)濃度。

1.3.3 不同pH對(duì)淀粉抗氧化性的影響。分別“1.3.2”所獲得最大抑制率的原淀粉、預(yù)處理淀粉及松香酸淀粉酯溶液的pH 調(diào)節(jié)為4、5、6、7 和 8，并精確吸取樣品溶液 3.5 ml，加入DPPH溶液0.5 ml，搖勻，避光放置30 min，以70%乙醇為空白，分別測定其在517 nm處吸光度Ai。同時(shí)，測定樣品溶液在517 nm處吸光度Aj;再測定DPPH溶液在517 nm處吸收度Ac。

1.3.4 不同處理溫度對(duì)淀粉抗氧化性的影響。將以上最大抑制率相應(yīng)濃度和pH溶液溫度調(diào)節(jié)到60、70、80、90和95℃，精確吸取樣品溶液3.5 ml，加入 DPPH 溶液0.5 ml，搖勻，避光放置30 min，以70%乙醇為空白，分別測定其在517 nm處吸光度Ai。同時(shí)，測定樣品溶液在517 nm處吸光度Aj;再測定DPPH溶液在517 nm處吸收度Ac。

1.4 紅外光譜結(jié)構(gòu)表征 用溴化鉀壓片法壓片，將樣品充分研磨進(jìn)行FT-IR掃描，波數(shù)范圍500～4 000 cm－1。

1.5 掃描電鏡分析 將少量樣品均勻分散到導(dǎo)電膠上，在其表面噴金進(jìn)行測試，采用SUPRA 55型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field-emission scanning electron microscopy，F(xiàn)E －SEM)觀測分析樣品的形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析 通過紅外光譜分析對(duì)比圖2 a、b、c、d可以發(fā)現(xiàn)，在3 348 cm－1附近有一寬峰為氫鍵締合的－OH的伸縮振動(dòng)，2 932 cm－1附近為C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 152、1 080和1 015 cm－1附近為C-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，均屬于淀粉分子的特征吸收峰;而圖2c松香酸淀粉酯在1 732 cm－1處出現(xiàn)酯羰基C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰;紅外分析結(jié)果表明松香和淀粉在固定化脂肪酶的催化作用下發(fā)生了酯化反應(yīng)，產(chǎn)物為松香淀粉酯［13］。

2.2 掃描電鏡分析 從圖3可以看出，原淀粉呈圓形或橢圓形，表面光滑且結(jié)構(gòu)良好。預(yù)處理淀粉，淀粉經(jīng)氫氧化鈉/尿素混合水溶液處理后，淀粉表面結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞，但還維持一定的形貌。未經(jīng)預(yù)處理的淀粉與松香酸發(fā)生酯化反應(yīng)后，其表面光滑且結(jié)構(gòu)良好，與原淀粉結(jié)構(gòu)相似。預(yù)處理松香酸淀粉酯，其顆粒結(jié)構(gòu)完全被破壞，表面粗糙且規(guī)整度差，與原淀粉、預(yù)處理淀粉和松香酸淀粉酯相比呈現(xiàn)出完全不同的形貌結(jié)構(gòu)。因此，這成為松香與淀粉發(fā)生酯化反應(yīng)的又一有力佐證，且表明酯化過程不僅發(fā)生在淀粉的非定型區(qū)，而且發(fā)生在淀粉的結(jié)晶區(qū)［14］。

2.3 淀粉預(yù)處理對(duì)松香酸淀粉酯取代度的影響 由圖4可知，原淀粉氫氧化鈉/尿素混合水溶液預(yù)處理后，通過酶促酯化反應(yīng)制備的松香酸淀粉酯DS=0.085，而未經(jīng)預(yù)處理的淀粉制備的松香酸淀粉酯DS=0.005 3。結(jié)果表明，松香酸淀粉酯的DS大小與淀粉的活化預(yù)處理有密切關(guān)系。與原淀粉相比，淀粉經(jīng)過預(yù)處理后，導(dǎo)致其致密結(jié)晶區(qū)域遭到破壞，化學(xué)試劑相對(duì)容易向淀粉分子中滲透，提高了淀粉分子的反應(yīng)活性，因此，酯化反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)活性提高，DS提高，其結(jié)果與SEM結(jié)果相佐證［15］。

2.4 不同濃度對(duì)淀粉抗氧化性的影響 原淀粉、預(yù)處理淀粉、松香酸淀粉酯(DS=0.085)在pH 7、處理溫度70℃時(shí)，不同濃度條件下清除羥自由基抑制程度見圖5。由圖5可知，經(jīng)過酯化修飾后的松香酸淀粉酯的抗氧化性最高，且在淀粉液濃度為4 mg/ml時(shí)，其最高抑制率達(dá)到31.66%，原淀粉及預(yù)處理淀粉抗氧化性相對(duì)較低，分別為30.53%和28.65%。

2.5 不同pH對(duì)淀粉抗氧化性的影響 原淀粉、預(yù)處理淀粉、松香酸淀粉酯(DS=0.085)在4 mg/ml、處理溫度70℃時(shí)，不同pH條件下清除羥自由基抑制程度見圖6。由圖6可知，經(jīng)過酯化修飾后的松香酸淀粉酯的抗氧化性較高，在pH=7和pH=8時(shí)最高抑制率達(dá)到31.75%和31.26%，而原淀粉及預(yù)處理淀粉抗氧化性相對(duì)較低?？紤]到松香酸淀粉酯在堿性條件下容易酯水解反應(yīng)，因此，后續(xù)試驗(yàn)選取最佳pH=7。在pH=7時(shí)，原淀粉和預(yù)處理淀粉的抑制率分別為27.35%和 29.65%。

2.6 不同處理溫度對(duì)淀粉抗氧化性的影響 原淀粉、預(yù)處理淀粉、松香酸淀粉酯(DS=0.085)在4 mg/ml、處理溫度70℃時(shí)，不同處理溫度條件下清除羥自由基抑制程度見圖7。由圖7可知，經(jīng)過酯化修飾后的松香酸淀粉酯的抗氧化性較高，在處理溫度為90℃時(shí)松香酸淀粉酯的抑制率高達(dá)32.95%。同時(shí)，原淀粉與預(yù)處理淀粉的抑制率分別為30.58%和29.78%。

3 結(jié)論與討論

(1)考察了不同濃度、溫度和pH條件下，采用DPPH法分析了松香酸淀粉酯的抗氧化性能。結(jié)果表明，與木薯淀粉、預(yù)處理淀粉相比，松香酸松香酸淀粉酯(DS=0.085)的抗氧化性提高。其中，在最佳濃度條件下，松香酸淀粉酯對(duì)DPPH自由基抑制率為31.66%，比木薯淀粉、預(yù)處理淀粉抑制率分別提高了1.14%和3.02%;在最佳pH條件下，松香酸淀粉酯對(duì)DPPH自由基抑制率為31.75%，比木薯淀粉、預(yù)處理淀粉抑制率分別提高了2.367% 和0.807%;在最佳溫度條件下，松香酸淀粉酯對(duì)DPPH自由基抑制率為32.95%，比木薯淀粉、預(yù)處理淀粉抑制率分別提高了4.4% 和2.1%;木薯淀粉、預(yù)處理淀粉、松香酸淀粉酯對(duì)DPPH自由基抑制率分別為30.58%、29.78%和32.95%。該研究為松香酸木薯淀粉的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

(2)雖然該研究松香酸淀粉酯的抗氧化性能較原淀粉和預(yù)處理淀粉提高不顯著，但已有大量關(guān)于松香衍生物抗氧化性能的報(bào)道。因此，下一步將通過對(duì)松香酸淀粉酯的三環(huán)非骨架的特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾研究，以獲得高抗氧化性能的松香酸淀粉酯。

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