李兵，何翠薇，陳青青，梁智

摘要：采用正交試驗(yàn)優(yōu)化廣西木薯（Manihot esculenta Crantz）葉中總黃酮提取的最佳工藝，并在此條件下提取木薯葉總黃酮進(jìn)行抗菌性試驗(yàn)。結(jié)果表明，液料比1∶25（V∶m），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間100 min的條件下木薯葉中總黃酮含量最高，達(dá)到25.23 mg/g;抗菌性試驗(yàn)表明，木薯葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌有較高的抑菌作用。

關(guān)鍵詞：木薯（Manihot esculenta Crantz）葉;總黃酮;提取;抗菌

中圖分類號(hào)：S533 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5816-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.049

木薯（Manihot esculenta Crantz）又叫樹薯、木番薯，地下部結(jié)薯，屬于大戟科木薯屬植物[1]。木薯是中國(guó)主要的熱帶作物之一，已被確認(rèn)為廣西重要的非糧食能源作物，其種植面積迅速擴(kuò)大，成為我國(guó)“十一五”重點(diǎn)發(fā)展的產(chǎn)業(yè)之一。然而，大規(guī)模的種植和加工利用產(chǎn)生大量的莖桿和葉等農(nóng)副產(chǎn)品，它們沒有得到充分利用而成為廢棄物，這些廢棄物往往被丟棄或是直接焚燒，既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了資源。研究表明，食用木薯葉可提高抗病能力，減少患癌癥及糖尿病、高血壓等疾病的幾率[2]?？梢娔臼沓鋲K根部分外，其他沒有充分利用的部分有可能含有有效的藥用成分。研究發(fā)現(xiàn)，木薯葉中含有黃酮類化合物[3，4]，本研究采用正交試驗(yàn)法研究了廣西木薯葉中黃酮類化合物的提取方法，同時(shí)進(jìn)行了抗菌性研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用木薯葉提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

木薯葉采自廣西桂北地區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)郭敏副教授鑒定為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬木薯（Manihot esculenta Crantz）的葉子，洗凈后經(jīng)50 ℃干燥48 h后粉碎備用。

1.2 ?試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC26003，金黃色葡萄球菌耐藥株（Staphylococcus susceptive strain），宋內(nèi)氏痢疾桿菌（Shigella sonnei），綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853，以上菌株均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫學(xué)教研室提供;營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)20100821）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)201008131）、水解酪蛋白（MH）肉湯（批號(hào)201009022）均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-200707）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

95%乙醇、H2SO4（批號(hào)T20090811）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)T20100126）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，BaCl2·2H2O（批號(hào)20071107）購(gòu)自廣州新建精細(xì)化工廠。

1.3 ?儀器與設(shè)備

SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，KQ5200B型超聲波清洗器，98-1-B型電子調(diào)溫電熱套立式壓力蒸汽滅菌器，SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，BP211D型電子分析天平，游標(biāo)卡尺（0～200 mm），Agilent 8453型紫外-可見分光光度計(jì)。

1.4 ?方法

1.4.1 ?木薯葉總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?精確稱取120 ℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.7 mg，用60%乙醇溶液定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度0.57 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL 60%乙醇溶液，加5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min，加4% NaOH溶液4 mL，加60%乙醇溶液定容，搖勻放置15 min，在504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，繪制總黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[5-7]。

1.4.2 ?總黃酮提取的工藝流程 ?木薯葉碎葉→熱浸提→過濾→提取液→濃縮→干燥→木薯葉總黃酮。

1.4.3 ?單因素試驗(yàn) ?分別研究液料比（溶劑體積：原料質(zhì)量，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)木薯葉總黃酮含量的影響。

總黃酮含量（mg/g）=■

式中，C表示質(zhì)量濃度（mg/mL），v表示顯色液的體積（mL），V表示乙醇的體積（mL），m表示所用木薯葉的質(zhì)量（g）。

1.4.4 ?正交試驗(yàn) ?根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）為試驗(yàn)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)L9（34）（表1），優(yōu)化木薯葉總黃酮的提取工藝。

1.4.5 ?驗(yàn)證試驗(yàn) ?精確稱取木薯葉粉末2.00 g，在正交試驗(yàn)所得最佳提取工藝條件下提取木薯葉總黃酮，計(jì)算總黃酮含量。

1.4.6 ?木薯葉總黃酮的抗菌性測(cè)定

1）培養(yǎng)基的制備：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂33 g加入1 000 mL去離子水中，加熱溶解并調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6，于0.15 MPa下高壓滅菌25 min。

2）菌液的制備：金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、宋內(nèi)氏痢疾桿菌和綠膿桿菌使用前用接種環(huán)分別取新鮮菌苔接種于瓊脂培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，將經(jīng)培養(yǎng)基傳代的各菌種于試管壁上研磨并溶于2 mL滅菌注射用水中，配制成1×108 CFU/mL菌液備用。

3）抗菌性供試液制備：在優(yōu)化工藝條件下提取的木薯葉總黃酮提取液，用乙酸乙酯萃取后濃縮制成稠膏，取木薯葉乙酸乙酯稠膏0.1 g，精確稱量，用已滅菌注射用水溶解，加入適量滅菌二甲基亞砜（DMSO）助溶，配制成0.1 g/mL的木薯葉總黃酮乙酸乙酯萃取藥液。

4）瓊脂平板打孔法測(cè)定抗菌活性：于直徑9 cm的無(wú)菌平皿內(nèi)加入30 mL熔化的滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，使其厚度約為0.5 cm，待其冷卻凝固后作為底層;再取熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL，鋪在底層之上，冷卻凝固后作為上層。用直徑為5 mm滅菌不銹鋼打孔器在瓊脂平板上均勻且垂直打5個(gè)孔。將100 μL供試驗(yàn)菌液均勻地涂布于瓊脂平板的表面。用移液器吸取木薯葉總黃酮乙酸乙酯萃取藥液約50 μL加入到各瓊脂孔內(nèi)，并用30 %二甲基亞砜（DMSO）無(wú)菌溶液作為空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h。觀察孔周圍有無(wú)抑菌圈，并以游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑（扣除孔徑5 mm），取其平均值作為測(cè)定結(jié)果[8，9]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?木薯葉總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在504 nm處，分別測(cè)出6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并對(duì)吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的關(guān)系作圖，如圖1所示，通過線性回歸，得到方程為A=11.774×C+0.063 5，R2=0.987，其中A為吸光度，C為總黃酮的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度為0.028 6～0.109 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 ?液料比對(duì)木薯葉總黃酮含量的影響 ?在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間60 min的條件下，研究液料比對(duì)木薯葉中總黃酮含量的影響。結(jié)果表明（圖2），在1∶40范圍內(nèi)，隨著溶劑量的增加，總黃酮含量明顯升高。在實(shí)際操作中，考慮總黃酮的充分溶出同時(shí)也避免溶劑的浪費(fèi)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中液料比設(shè)置為1∶10、1∶25、1∶40（mL∶g）。

2.2.2 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木薯葉總黃酮含量的影響在液料比1∶20、提取時(shí)間80 min條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木薯葉中總黃酮含量的影響。結(jié)果表明（圖3），當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于40%時(shí)，總黃酮含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)太高提取的色素等雜質(zhì)量也增加，故在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為40%、60%、80%。

2.2.3 ?提取時(shí)間對(duì)木薯葉總黃酮含量的影響 ?在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比1∶20條件下，研究提取時(shí)間30、40、80、100、120 min對(duì)木薯葉中總黃酮含量的影響。結(jié)果表明（圖4），木薯葉黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間大于100 min 后總黃酮含量開始下降。在選擇提取時(shí)間時(shí)既要考慮有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意過長(zhǎng)時(shí)間的高溫提取對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的影響，故正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中提取時(shí)間設(shè)置為40、70、100 min。

2.3 ?正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2、3可以看出，影響木薯葉總黃酮含量的3個(gè)因素大小順序?yàn)橐毫媳取⒁掖俭w積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間，液料比對(duì)木薯葉總黃酮含量的影響較顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)木薯葉總黃酮含量的影響不大。得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間100 min。

2.4 ?驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可靠性，取3份木薯葉碎葉，每份2.00 g，按上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮含量為25.23 mg/g，RSD為3.0%。

2.5 ?木薯葉總黃酮的抗菌性測(cè)定結(jié)果

木薯葉乙酸乙酯萃取部位抗菌試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可見，木薯葉乙酸乙酯萃取藥液對(duì)金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株均有明顯的抑菌作用，對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、綠膿桿菌的生長(zhǎng)亦有一定抑菌作用。4種菌種的抑菌圈直徑分別為16.58、11.02、5.48、4.22 mm;抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>金黃色葡萄球菌耐藥株>宋內(nèi)氏痢疾桿菌>綠膿桿菌，其中對(duì)金黃色葡萄球菌為高敏感。

3 ?結(jié)論

本試驗(yàn)以乙醇為溶劑，以廣西木薯葉總黃酮含量為考察指標(biāo)，通過對(duì)液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)選出廣西木薯葉總黃酮的最佳提取工藝為液料比1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間100 min。該工藝操作簡(jiǎn)便、成本低、收率高，具有良好的穩(wěn)定性，可為廣西木薯葉總黃酮的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，木薯葉乙酸乙酯萃取藥液對(duì)金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、綠膿桿菌4種菌種均有抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最為明顯，表明木薯葉乙酸乙酯萃取藥液具有抑菌活性成分，以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，可為進(jìn)一步研究木薯葉的抑菌活性提供參考。

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