李明波，雷彬，董斌科，梅書棋，陳明銀，劉心建

摘要：通過PCR方法對湖北某試驗豬場3份疑似患斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）的仔豬和一份死胎樣本進行檢測，結(jié)果4份組織病料中均擴增到494 bp大小的PCV2-DNA片段，而偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）檢測為陰性。對擴增產(chǎn)物進行測序和Blast同源性分析發(fā)現(xiàn)，所檢測的PCV2病毒為PCV2b亞型，其ORF2基因全長為702 bp，與PCV2-WH株、PCV2-HB WH24毒株的核苷酸序列同源性分別為94%和99%。通過試驗研究，明確了該試驗豬場豬群中保育仔豬的主要感染病原為PCV2，為更好地應(yīng)用疫苗防控該病和研究綜合控制技術(shù)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;ORF2基因;檢測與分析

中圖分類號：S858.28 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5798-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.044

豬圓環(huán)病毒?。≒CV2）是由圓環(huán)病毒2型引起的一系列疾病的總稱，包括斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）、出生豬的先天震顫和生長豬的皮炎腎病綜合征、增生性腸炎、青年母豬的流產(chǎn)及產(chǎn)死胎等。斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）是臨床較常見、造成經(jīng)濟損失較大的豬圓環(huán)病毒病，臨床患PMWS的仔豬表現(xiàn)為皮膚蒼白、呼吸道癥狀、進行性消瘦、腹股溝淋巴結(jié)腫大和生長發(fā)育不整齊，容易繼發(fā)細菌感染等。PCV2對環(huán)境的抵抗力較強，可經(jīng)豬的唾液、鼻腔、糞尿、乳汁、胎盤和公豬精液等途徑傳播。豬圓環(huán)病毒病嚴重影響了仔豬的生長性能，表現(xiàn)為養(yǎng)殖場內(nèi)持續(xù)性感染，是其他豬病多發(fā)和頻發(fā)的主要原因之一。

PCV2為環(huán)狀、單股DNA病毒，由衣殼蛋白（Cap蛋白，由ORF2編碼）和核酸組成（含1 767/1 768個核苷酸）[1]。研究表明世界范圍內(nèi)PCV2病毒的抗原決定簇核苷酸序列的同源性高達93%以上[2]。PCV2主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，單核/巨噬細胞系（如肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞等）是病毒感染豬后的靶細胞，可引起淋巴細胞數(shù)量減少及凋亡，造成免疫抑制，使感染豬的免疫應(yīng)答作用降低。PCV2毒株可分為PCV2a/PCV2b基因亞型，根據(jù)對臨床PCV2毒株的序列分析表明，PCV2b是當前國內(nèi)豬群中的主要優(yōu)勢毒株，且PCV2b比PCV2a的毒力更強，這兩個基因型間的不同僅存在ORF2之間的差異[3]。

臨床上PCV2感染豬引起的病理變化主要是水腫，如間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)水腫、腸系膜水腫、心臟冠狀溝的膠凍樣水腫等，在炎癥過程中體液或組織液的滲出是宿主感染病毒后的重要發(fā)展規(guī)律?；糚MWS豬的臨床癥狀則較為復雜，原因是PCV2常與其他因子協(xié)同致病從而加重病情，這些因子包括病原微生物（豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌等）、免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑藥物（地塞米松）等[4]。本研究通過PCR方法對湖北某試驗豬場3份疑似患斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）的仔豬和一份死胎樣本進行了檢測，明確了該試驗豬場豬群中保育仔豬的主要感染病原，旨在為該病的防控提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?病料來源 ?某試驗原種場內(nèi)臨床疑似患PMWS的保育仔豬3頭（50～60日齡）和死胎1頭。發(fā)病仔豬臨床癥狀：體溫41～42 ℃，呼吸困難進而衰竭，進行性消瘦，皮膚蒼白、被毛粗亂等。病理剖檢變化：心包、胸膜等處有少量纖維素性蛋白滲出，胸腔積液，肺臟出血（部分組織出現(xiàn)肉變），腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)腫大出血、切面呈蒼白色，腎臟及胃黏膜均有出血點等。選取臨床癥狀典型的病豬進行解剖，并采集肺臟組織、淋巴結(jié)等病料。

1.1.2 ?引物 ?參照文獻[5]，根據(jù)GenBank中的PCV2-ORF2保守基因序列（編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白）設(shè)計合成1對特異性引物，上游引物P1：5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，下游引物P2：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′。檢測偽狂犬野毒（PRV-gE基因）和豬繁殖與呼吸綜合征經(jīng)典和變異毒株（PRRSV-Nsp2基因）引物由華中農(nóng)業(yè)大學動物傳染病診斷中心實驗室惠贈。

1.2 ?方法

1.2.1 ?PCR檢測 ?從采集的病豬肺臟和淋巴結(jié)組織提取PCV2-DNA模板，再配置PCR反應(yīng)體系（單重擴增）：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上、下游引物（10 mmol/L）各1 μL、模板4 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL、滅菌水14.35 μL，總反應(yīng)體系25 μL。

將配好的樣品放入PCR管進行擴增，退火溫度為54 ℃。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min;94 ℃30 s，54 ℃40 s，72 ℃45 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，擴增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

檢測偽狂犬野毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物和技術(shù)方法由華中農(nóng)業(yè)大學動物傳染病診斷中心實驗室提供。

1.2.2 ?產(chǎn)物測序和Blast比對 ?將擴增的ORF2-DNA產(chǎn)物回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并對測序的結(jié)果與GenBank上登錄的PCV2病毒（包括疫苗株）相關(guān)序列進行Blast比對。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?PCV2-ORF2基因的擴增和其他病原的檢測結(jié)果

圓環(huán)病毒（PCV2）檢測方法及判斷標準：試驗以圓環(huán)病毒的PCV2衣殼（Cap）蛋白為目的基因進行PCR擴增，能夠從陽性模板中擴增出494 bp的片段。如果樣品中有PCV2存在，則能夠擴增出494 bp大小的條帶。由圖1可見，4份組織樣品中均能擴增出494 bp大小的條帶，表明4份組織樣品中均能檢測出PCV2。

由表1可見，4份組織（肺臟和淋巴結(jié)）樣品中均可檢測出PCV2，未檢測出偽狂犬野毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（經(jīng)典和變異毒株）。

2.2 ?PCV2-ORF2基因的測序和Blast比對

將擴增的PCV2-ORF2基因克隆到pMD18-T質(zhì)粒載體送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，其大小為702 bp，具體見圖2。

將臨床PCV2-ORF2基因序列與GenBnak中登錄毒株P(guān)CV2-WH（PCV2b亞型，登錄號FJ598044）和PCV2-HB WH24（PCV2b亞型，登錄號FJ870971）用Blast軟件比較其同源性，結(jié)果其同源性分別為94%和99%（圖3）。

3 ?小結(jié)與討論

豬圓環(huán)病毒（PCV2）的致病性與病毒感染劑量、母源抗體水平以及感染時的日齡有關(guān)。由于健康豬體內(nèi)可攜帶病毒而不出現(xiàn)臨床癥狀，運用熒光定量PCR技術(shù)對PMWS病豬和臨床健康豬腸系膜淋巴結(jié)、血清樣品中病毒DNA含量檢測表明，每毫升血清或500 ng組織樣品中PMWS病毒含量大于107，而健康豬小于106 [6]。因此，在發(fā)病豬的組織中，通常檢出107拷貝的病毒DNA，這就要求實驗室在病料定性檢測為PCV2陽性時，仍需定量測定病毒含量。

本試驗通過對臨床患PMW品的病豬及死胎組織樣品進行PCV2、PRV、PRRSV相關(guān)基因的PCR定性檢測，結(jié)果表明：

1）該豬場臨床PCV2毒株與疫苗毒株（PCV2-WH株）和湖北某地區(qū)另一分離毒株（PCV2-HB WH24株）有較高的同源性，而這兩個毒株均為PCV2b基因亞型，病毒的DNA大小均為1 767 bp，從而推斷PCV2b基因亞型為檢測豬群的主要優(yōu)勢毒株。

2）3份已免疫PCV2滅活疫苗的保育豬組織樣本中PCV2病毒PCR定性檢測呈較強陽性，而死胎組織呈弱陽性，表明仔豬在某一階段或出生前感染了病毒。雖然ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV2良好的免疫蛋白，這也提示病毒ORF2基因內(nèi)較小的差異可能造成疫苗毒對臨床毒株不能起到良好保護效果。此外，PCV2滅活疫苗的臨床免疫效果還與商品疫苗的抗原滴度大小、疫苗佐劑、免疫方式、豬只是否攜帶其他病原等因素密切相關(guān)。

3）該豬場引起保育豬發(fā)病的病原主要是PCV2，由于PCV2可引起機體免疫抑制，容易造成細菌繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌病、豬肺炎支原體、鏈球菌病等，在前期的試驗研究中鑒定了該豬場引起副豬嗜血桿菌病的菌株血清型為2、4、13型，提示在防控PMWS和制定免疫程序時應(yīng)該加強副豬嗜血桿菌?。℉PS）疫苗和豬肺炎支原體疫苗的有效免疫，同時在斷奶-保育仔豬階段進行飼料給藥預防控制是非常必要的（如大環(huán)內(nèi)酯類藥物、免疫增強劑、抗應(yīng)激藥物等）。

近年來，國內(nèi)外研究者在PCV2的病原學、分子和臨床致病機理、疫苗開發(fā)、免疫效果評價等方面開展并取得了較好的研究成果，使該病的臨床發(fā)病率有效降低，提高了仔豬存活率和生產(chǎn)成績。但仍有關(guān)于PCV2的未知毒力基因和其他病毒復制相關(guān)非結(jié)構(gòu)蛋白的功能還不甚了解;同時，病毒與其他病原協(xié)同感染機制、免疫與感染的鑒別診斷技術(shù)、疫苗開發(fā)等方面需要進一步的探索和研究。

參考文獻：

[1] 斯特勞，趙德明，張仲秋，等.豬病學[M].第九版. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2008.313-318.

[2] LAROCHELLE R，MAGAR R，DALLAIRE S. Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2（PCV2）strains from cases presenting various clinical conditions[J]. Virus Res，2002，90：101-102.

[3] 劉 ?健，張維誼，鞠厚斌，等.豬圓環(huán)病毒2a/2b亞型病毒株毒力分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（2）：23-27.

[4] 韋 ?平，秦愛建.重要動物病毒分子生物學[M].北京：科學出版社，2008.478-496.

[5] 李文潔，李文濤，嚴偉東，等.中國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的基因型分析[J].畜牧獸醫(yī)學報，2009，40（9）：1358-1362.

[6] BRUNBORG I M，MOLDAL T，JONASSEN C M.Quantitation of porcine circovirus type 2 isolated from serum/plasma and tissue samples of healthy pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome using a TaqMan-based real-time PCR[J]. J Virol Methods， 2004，122（2）：171-178.