張雯靜 綜述 王滿俠 審校 (蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，蘭州 730000)

髓鞘是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的施萬細(xì)胞(SC)產(chǎn)生的包裹在神經(jīng)軸突外面的脂肪組織。髓鞘的形成對于軸突的絕緣和動作電位的傳導(dǎo)是非常重要的。相關(guān)研究表明，一系列內(nèi)在及外在的調(diào)節(jié)機(jī)制在特定方式上正性或者負(fù)性的調(diào)控著髓鞘形成細(xì)胞的分化［1-3］。MicroRNAs(MiRNAs)的發(fā)現(xiàn)揭示了新型的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，它可以控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的微型調(diào)控［4］。在髓鞘形成細(xì)胞中，平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制可以有效地控制髓鞘功能的正常發(fā)揮。MiRNAs 通過OLs 及SCs所介導(dǎo)的髓鞘異常形成或相關(guān)損傷均會導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降，加速神經(jīng)軸突退化，導(dǎo)致獲得性或者遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，包括:多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)、成年發(fā)作型染色體顯性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥(ADLD)等［3，4］。

1 miRNAs 的生源論

1993 年，Lee 等［5］在果蠅中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA-lin-4。MiRNAs 基因多位于與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的染色體組區(qū)域，表明miRNA 分子可能與關(guān)鍵的細(xì)胞變化相關(guān)［6］。RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄出最早的miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為pri-miRNA［7］。而miRNA 的成熟與Drosha 和Dicer 這兩種RNase Ⅲ相關(guān)。Drosha 和DGCR8 結(jié) 合 使 核pri-miRNA 形 成Pre-miRNAs［8］。Pre-miRNAs 通過Exportin-5 由細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì)［9］。Dicer 和TRBP 將Pre-miRNAs 剪切成長度為21～25 個核苷酸的雙鏈miRNA。雙鏈中的一股被招募、吸引加載至RNA 誘導(dǎo)沉默合體(RISC)［10］，其中一條成熟的單鏈以不對稱的方式結(jié)合到RISC上，該復(fù)合物會結(jié)合到有互補(bǔ)序列的mRNAs 上，通過調(diào)整轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和靶mRNAs 的翻譯而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。RISC 會黏附在其目標(biāo)mRNA 的3'UTR端導(dǎo)致其退化和翻譯抑制［11］。

2 miRNAs 與少突膠質(zhì)細(xì)胞

2.1 miRNAs 保持少突膠質(zhì)細(xì)胞的特定身份 對于來源于人胚胎干細(xì)胞的OLs 不同階段的分析揭示了在OLs 譜系進(jìn)展過程中有一些起暫時調(diào)節(jié)作用的miRNAs［12］。如:miR-9 被發(fā)現(xiàn)在小鼠的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPC)中含量非常豐富，其目標(biāo)為編碼周圍神經(jīng)軸突髓鞘蛋白(Pmp22)的mRNA3'UTR端。即使其轉(zhuǎn)錄過程是在OLs 中進(jìn)行的，但是在OLs 中并沒有發(fā)現(xiàn)Pmp22 蛋白。同時，miR-9 對于星型細(xì)胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)有抑制作用［13］。以上結(jié)果表明，像miR-9 這樣的一些miRNAs 會抑制非少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系蛋白的相關(guān)表達(dá)，其作用就像是監(jiān)督人一樣保持著OL 的身份識別。另外一些miRNAs 的功能可能是維持髓鞘的相關(guān)結(jié)構(gòu)。如:MiR-23 是 lamin B1 的一個負(fù)性調(diào)節(jié)因子［14］。

2.2 少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化需要Dicer-1 介導(dǎo)的miRNAs 在胚胎發(fā)育的早期，OLs 譜系的發(fā)育起始時，由Olig1、Olig2 及CNP 等促使因子定向Cre 重組酶使Dicer-1 失活，會引起嚴(yán)重的脫髓鞘和運(yùn)動障礙，包括震顫和抽搐［15，16］。Dicer-1 的缺失會導(dǎo)致OPC 增殖的明顯加速，但是在髓鞘形成時卻明顯降低。這表明，對于正常OPCs 的循環(huán)和分化，miRNAs是必不可少的。同時，Olig1-Cre 和Olig2-Cre 所介導(dǎo)的Dicer-1 缺乏的小鼠，也表現(xiàn)出脫髓鞘。前突變體的CNS 丟失了大量的髓鞘，且在產(chǎn)后三周左右會出現(xiàn)死亡，而后突變體則會表現(xiàn)出發(fā)育延遲，但到最后其髓鞘會最終修復(fù)，一種可能的解釋就是，Olig2-Cre沒有完全移除一部分未發(fā)育成熟的OLs 中的Dicer-1 的等位基因，這些OPCs 中的等位基因可以逃避Cre 酶的剪切，最終可以形成基本接近于成年人的髓鞘水平。在缺失Dicer-1 基因的PLP-creERT 轉(zhuǎn)基因成年鼠中，其會導(dǎo)致脫髓鞘和進(jìn)行性軸突變性，而致使動物壽命縮短［17］。研究表明OL 的分化、髓鞘的保持及動態(tài)平衡都需要miRNAs 的參與。在該實(shí)驗(yàn)中觀察到的軸突變性，表明髓鞘是具有神經(jīng)營養(yǎng)功能的。

2.3 少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育階段特異性的miRNAs 的調(diào)節(jié) 為了明確負(fù)責(zé)OL 發(fā)育各階段的特定miRNAs，有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，成熟OLs 表達(dá)的mi-RNAs 在促進(jìn)OPC 分化的過程中起著正性作用，一些miRNAs，優(yōu)先地在成熟的OLs 中富集或是在缺失Dicer-1 突變體中下調(diào)。如，miR-219 和miR-338 在OLs 形成髓鞘的起始和成熟的OLs 中大量增長。miR-219、miR-338-5p 及miR-338-3p 的穩(wěn)定表達(dá)可以促進(jìn)OPC 分化，也可部分修復(fù)體外Dicer-1 缺失的OPCs的分化缺陷［15，16］。研究表明，miR-219、miR-338 的過量表達(dá)可促進(jìn)OLs 譜系標(biāo)志物的早熟表達(dá)［16］。在人工培養(yǎng)的OPCs 細(xì)胞中敲除這兩種miRNAs 會阻止OPC 的分化［15，16］，這表明miR-219 是OLs 分化的必須和充分條件。在PLP-CreERTDicer-1 基因敲除的小鼠中觀察脂肪酸的堆積作用［17］，表明如miR-219 類似的miRNAs 在髓鞘膜的穩(wěn)定性中也起了重要作用。

盡管miR-219 和miR-338 之間缺乏同源性，據(jù)推斷這兩種miRNAs 的目標(biāo)中有一大部分是關(guān)于OLs 負(fù)性調(diào)節(jié)的相同的基因，比如Hes5 和Sox6。兩者可以隱匿Hes5、Sox6 的3'UTR 端，且通過緩和細(xì)胞分化剎車過程協(xié)同的促進(jìn)OPC 的分化過程［18］。miRNA 介導(dǎo)的一些神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的抑制可能會限制神經(jīng)祖細(xì)胞分化到OLs 譜系。另外，miR-138 在OLs 的有絲分裂后期的早期則表現(xiàn)出瞬時表達(dá)，刺激了前期分化但是抑制了少突膠質(zhì)細(xì)胞的最終分化［16］。

2.4 少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的miRNAs 的控制 miR-17-92 簇編碼miR-19b 和miR-17 被證實(shí)在OLs 譜系中高聚集，包括A2B5+OPCs 和GalC+OLs［19，20］。miR-17-92 基因簇在OLs 中的定向失活可以導(dǎo)致腦部Olig2 陽性細(xì)胞25%的減少。有研究發(fā)現(xiàn)miR-19b 目標(biāo)為腫瘤抑制因子Pten。OPCs 中的miR-19b的表達(dá)導(dǎo)致Akt 信號通路、Pten 下游目標(biāo)基因的激活，且能促進(jìn)OPCs 的增殖。與這種基因簇在促進(jìn)細(xì)胞壽命中的作用一致［21］，miR-17-92 基因簇在OPCs 的存活和擴(kuò)增中起著至關(guān)重要的作用。同樣的，miRNAs 通過控制OL、阻止轉(zhuǎn)錄因子來控制其分化，同時通過特定方式促進(jìn)OPC 細(xì)胞周期循環(huán)和其壽命。

3 miRNAs 介導(dǎo)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)

miRNAs 在SC 的發(fā)生、發(fā)展過程中是動態(tài)變化的。有一部分miRNAs 在SC 細(xì)胞的發(fā)育中明顯增加，有一部分則在Dicer-1 缺失的突變體內(nèi)下降［22，23］。研究發(fā)現(xiàn)，在Dicer-1 突變體中，Dicer-1 等位基因重組后的超過2 周的時間內(nèi)，有幾種miRNAs的含量依然保持很高的水平［23］。這可能是由于miRNAs 超凡的穩(wěn)定性［24］或者是因?yàn)橛幸恍﹎iRNAs 的合成過程中是Dicer-1 依賴途徑的［25］。相關(guān)研究表明，在分化的SC 中，大部分上調(diào)的miRNAs是不重疊的。對于SC 的發(fā)展，miR-138 和miR-338被確定為重要的潛在因子［22］。未分化SC 上可特征性的表達(dá)Ccnd1，其通過Notch1 的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)來影響的SC 增殖，Notch1 是髓鞘形成過程中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［26，27］。miR-138 也 可 以 通 過 阻 止 Ccnd1 和Notch 信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和髓鞘形成過程，同時也可以作為其他髓鞘形成過程中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。除了miR-138 和miR-338，其他的miRNAs 在SC 的分化作用中也有相對重要的作用。miR-145在Dicer-1 突變體的體內(nèi)［23］、體外［28］試驗(yàn)中被證實(shí)有適度的下降，其目標(biāo)基因是Sox-2。miR-204 在SCs 的發(fā)育過程中有所增加，但在Dicer-1 的突變體的神經(jīng)組織中是下降的，其目標(biāo)基因也是Sox-2。因?yàn)镾ox-2 是Egr2 基因和髓鞘形成的有力負(fù)性調(diào)節(jié)因子［29，30］。miR-34a 通過抑制Notch 和MAPK 信號通路能阻止細(xì)胞增殖［31，32］，與SC 的增殖和分化相關(guān)。miR-29a 被提出其抑制Pmp22 基因的早期表達(dá)。在CNS 和PNS 的研究中，miR-138 和miR-338 在發(fā)展過程中是增加的，且在Dicer-1 突變體中是急劇下降的［16，19，22，23］。相反，miR-219，一個對于OL 分化至關(guān)重要的miRNA 在SC 中卻沒有發(fā)現(xiàn)［23］，這就意味著miRNAs 在CNS 和PNS 中對髓鞘形成細(xì)胞的調(diào)節(jié)只有部分重疊。

4 miRNAs 與多發(fā)性硬化(MS)

MS 是以CNS 白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)，遺傳易感個體與環(huán)境因素作用發(fā)生的自身免疫性疾?。?3］。相關(guān)研究表明miRNAs 的正負(fù)調(diào)節(jié)可能是MS 發(fā)病的一個重要機(jī)制。相關(guān)研究已表明，miRNAs 在OL分化和髓鞘形成及維持中的重要作用，但究竟是如何將OL 和MS 聯(lián)系在一起的機(jī)制還不是很清楚。

越來越多的證據(jù)表明miRNAs 的正負(fù)調(diào)節(jié)對于疾病維持過程可能是一個重要的機(jī)制。研究表明，miR-17、miR-20a 在MS 的多種分型中都有很明顯的下調(diào)趨勢。眾所周知，miR-17、miR-20a 可調(diào)節(jié)參與T 細(xì)胞活化的多種基因［34］。在MS 和健康組的對比中，miR-145 的表達(dá)特異性可以達(dá)到89.5%，其靈敏性也高達(dá)90%［35］。miR-17-5p 是與自身免疫性疾病相關(guān)的miRNA，其在MS 的CD4 細(xì)胞中上調(diào)。miR-21、miR-106b 在所有的MS 病例中都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢［36］。在MS 患者的B 淋巴細(xì)胞中miR-17-92 基因簇有下調(diào)趨勢。而且免疫調(diào)節(jié)劑的使用在復(fù)發(fā)緩解型中B 淋巴細(xì)胞的miRNA 的表達(dá)上有獨(dú)特的作用［37］。在MS 的病變區(qū)中，一些miRNAs 有擴(kuò)增趨勢:miR-34a、miR-155、miR-326 在MS 的活躍病變區(qū)(與非活動區(qū))被發(fā)現(xiàn)有上調(diào)趨勢。這些miRNAs 的目標(biāo)是CD47 分子的3'UTR 區(qū)。研究表明在MS 的病變區(qū)內(nèi)異常的miRNA 會減少大腦細(xì)胞中的CD47分子，這會導(dǎo)致抑制區(qū)吞噬細(xì)胞的釋放。有大約10種miRNAs 是在多發(fā)性硬化的活躍病變區(qū)明顯上調(diào)的，其同時在星形細(xì)胞中也被發(fā)現(xiàn)。miR-155 是以不同的方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，但到目前為止都沒有被分配到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有細(xì)胞中去［38］。

5 miRNAs 與成年發(fā)作型染色體顯性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥(ADLD)

1984 年，由Eldridge 第一次描述了該疾病，其特點(diǎn)為漸進(jìn)的和致命的神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘改變［39］。LaminB1 是由LMNB1 編碼的蛋白，過量的LaminB1的表達(dá)會通過抑制髓鞘蛋白產(chǎn)物如MBP、PLP、MOG等引起嚴(yán)重的CNS 髓鞘的丟失。LMNB1 基因的復(fù)制伴隨著mRNA 的增加及蛋白水平的改變引起嚴(yán)重的髓鞘脫失，其過度表達(dá)影響了核膜蛋白LAP2的定位和染色質(zhì)組織，也抑制了少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性分化基因。增加的LaminB1 表達(dá)會導(dǎo)致內(nèi)核膜蛋白、染色質(zhì)組織和核孔轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，這也導(dǎo)致了OL 不成熟的分化逃逸。miR-23 作為一個LaminB1 的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，其可以改善細(xì)胞核內(nèi)不斷增加的LaminB1 的情況，也可以緩解由于LaminB1 升高所造成的錯誤。以上有可能是由于髓鞘基因的轉(zhuǎn)錄減少或是髓鞘蛋白的錯誤定位所致［14］。這樣看來，miR-23 對于髓鞘的形成及作用維持起著正性作用。新增miRNAs 與吉蘭巴雷綜合征的相關(guān)內(nèi)容。

6 結(jié)論與展望

自從發(fā)現(xiàn)miRNAs 后，其研究領(lǐng)域就在逐步擴(kuò)大，我們現(xiàn)在所知的這些分子多以基因的形式表達(dá)，并且可以調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。近期的研究表明microRNAs 可能在髓鞘形成及損傷中扮演關(guān)鍵的角色。miRNAs 的相關(guān)研究又讓人們展開了對于髓鞘及神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的復(fù)雜多變的生理及病理學(xué)變化的探討。對于這些研究，我們所關(guān)注的miRNAs 的相關(guān)功能，也只是一小部分。

［1］Jessen KR，Mirsky R.The origin and development of glial cells in peripheral nerves［J］.Nat Rev Neurosci，2005，6(9):671-682.

［2］Li H，He Y，Richardson WD，et al.Two-tier transcriptional control of oligodendrocyte differentiation［J］.Curr Opin Neurobiol，2009，19(5):479-485.

［3］Peru RL，Mandrycky N，Nait-Oumesmar B，et al.Paving the axonal highway:from stem cells to myelin repair［J］.Stem Cell Rev，2008，4(4):304-318.

［4］Vo NK，Cambronne XA，Goodman RH.MicroRNA pathways in neural development and plasticity［J］.Curr Opin Neurobiol，2010，20(4):457-465.

［5］Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V.TheC.Elegans heterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75:843-854.

［6］Calin GA，Liu CG，Sevignani C，et al.MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B-cell chronic lymphocytic leukemias［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:11755-11760.

［7］Cai X，Hagedorn CH，Cullen BR.Human microRNAs are processed from capped，polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs［J］.RNA，2004，10:1957-1966.

［8］Denli AM，Tops BB，Plasterk RH，Ketting RF，Hannon GJ.Processing of primary microRNAs by the microprocessor complex［J］.Nature，2004，432:231-235.

［9］Lund E，Guttinger S，Calado A，et al.Nuclear export of microRNA precursors［J］.Science，2004，303:95-98.

［10］Filipowicz W，Bhattacharyya SN，Sonenberg N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?［J］.Nat Rev Genet，2008，9:102-114.

［11］Eulalio A，Huntzinger E，Izaurralde E.Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing［J］.Cell，2008，132:9-14.

［12］Letzen BS，Liu C，Thakor NV，et al.MicroRNA expression profiling of oligodendrocyte differentiation from human embryonic stem cells［J］.PLoS One，2010，5(5):e10480.

［13］Krichevsky AM，Sonntag KC，Isacson O，et al.Specific microRNAs modulate embryonic stem cell-derived neurogenesis［J］.Stem Cells，2006，24(4):857-864.

［14］LinST，F(xiàn)u YH.MiR-23 regulation of lamin B1 is crucial for oligodendrocyte development and myelination［J］.Dis Modle Mech，2009，2(3/4):178-188.

［15］Dugas JC，Cuellar TL，Scholze A，et al.Dicer1 and miR-219 are required for normal oligodendrocyte differentiation and myelination［J］.Neuron，2010，65(5):597-611.

［16］Zhao X，He X，Han X，et al.MicroRNA-mediated control of oligodendrocyte differentiation［J］.Neuron，2010，65(5):612，626.

［17］Shin D，Shin JY，McManus MT，et al.Dicer ablation in oligodendrocytes provokes neuronal impairment in mice［J］.Ann Neurol，2009，66(6):843-857.

［18］Nave KA.Oligodendrocytes and the "micro brake" of progenitor cell proliferation［J］.Neuron，2010，65(5):577-579.

［19］Lau P，Verrier JD，Nielsen JA，et al.Identification of dynamically regulated microRNA and mRNA networks in developing oligodendrocytes［J］.Neurosci，2008，28(45):11720-11730.

［20］Budde H，Schmitt S，F(xiàn)itzner D，et al.Control of oligodendroglial cell number by the miR-17-92 cluster［J］.Development，2010，137(13):2127-2132.

［21］Ventura A，Young AG，Winslow MM，et al.Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 through 92 family of miRNA clusters［J］.Cell，2008，132(5):875-886.

［22］Bremer J，O'Connor T，Tiberi C，et al.Ablation of Dicer from murine Schwann cells increases their proliferation while blocking myelination［J］.PLoS One，2010，5(8):e12450.

［23］Yun B，Anderegg A，Menichella D，et al.MicroRNA-deficient Schwann cells display congenital hypomyelination［J］.Neurosci，2010，30(22):7722-7728.

［24］Jung M，Schaefer A，Steiner I，et al.Robust microRNA stability in degraded RNA preparations from human tissue and cell samples［J］.Clin Chem，2010，56(6):998-1006.

［25］Chong MM，Zhang G，Cheloufi S，et al.Canonical and alternate functions of the microRNA biogenesis machinery［J］.Genes Dev，2010，24(17):1951-1960.

［26］Bienvenu F，Jirawatnotai S，Elias JE，et al.Transcriptional role of cyclin D1 in development revealed by a genetic-proteomic screen［J］.Nature，2010，463(7279):374-378.

［27］Woodhoo A，Alonso MB，Droggiti A，et al.Notch controls embryonic Schwann cell differentiation，postnatal myelination and adult plasticity［J］.Nat Neurosci，2009，12(7):839-847.

［28］Verrier JD，Semple-Rowland S，Madorsky I，et al.Reduction of Dicer impairs Schwann cell differentiation and myelination［J］.Neurosci Res，2010，88(12):2558-2568.

［29］Kao SC，Wu H，Xie J，et al.Calcineurin/NFAT signaling is required for neuregulin-regulated Schwann cell differentiation［J］.Science，2009，323(5914):651-654.

［30］Le N，Nagarajan R，Wang JY，et al.Analysis of congenital hypomyelinating Egr2Lo/Lo nerves identifies Sox2 as an inhibitor of Schwann cell differentiation and myelination［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(7):2596-2601.

［31］Ichimura A，Ruike Y，Terasawa K，et al.MicroRNA-34a inhibits cell proliferation by repressing mitogen-activated protein kinase kinase 1 during megakaryocytic differentiation of K562 cells［J］.Mol Pharmacol，2010，77(6):1016-1024.

［32］Pang RT，Leung CO，Ye TM，et al.MicroRNA-34a suppresses invasion through downregulation of Notch1 and Jagged1 in cervical carcinoma and choriocarcinoma cells［J］.Carcinogenesis，2010，31(6):1037-1044.

［33］Compston A，Coles A.Multiple sclerosis［J］.Lancet，2008，372:1502-1517.

［34］Cox MB，Cairns MJ，Gandhi KS，et al.MicroRNAs miR-17 and miR-20a inhibit T-cell activation genes and are under-expressed in MS whole blood［J］.PLoS One，2010，5:e12132.

［35］Keller A，Leidinger P，Lange J，et al.Multiple sclerosis:microRNA expression profiles accurately differentiate patients with relapsing-remitting disease from healthy controls［J］.PLoS One，2009，4:e7440.

［36］Lindberg RLP，Hoffmann F，Kuhle J，et al.Circulating microRNAs as indicators for disease course of multiple sclerosis［J］.Mult Scler，2010，16:S41-S196.

［37］Sievers C，Hoffmann F，F(xiàn)ontoura P，et al.Effect of natalizumab on microRNA expression in B-lymphocytes of relapsing-remitting multiple sclerosis patients［J］.Mult Scler，2010，16:S197-S352.

［38］Junker A，Krumbholz M，Eisele S，et al.MicroRNA profiling of multiple sclerosis lesions identifies modulators of the regulatory protein CD47［J］.Brain，2009，132:3342-3352.

［39］Eldridge R，Anayiotos CP，Schlesinger S，et al.Hereditary adultonset leukodystrophy simulating chronic progressive multiple sclerosis［J］.N Engl J Med，1984，311:948-953.