劉 超

（河北省霸州市畜牧獸醫(yī)局，河北霸州 065700）

提高雞馬立克氏病疫苗效價(jià)的技術(shù)措施

劉 超

（河北省霸州市畜牧獸醫(yī)局，河北霸州 065700）

雞馬立克氏病活疫苗生產(chǎn)的環(huán)節(jié)較多，細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力、接毒量、培養(yǎng)溫度、血清質(zhì)量以及營養(yǎng)液的質(zhì)量等都是影響該疫苗產(chǎn)量的因素，而營養(yǎng)液質(zhì)量更是重中之重。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量，我們對營養(yǎng)液主要成分進(jìn)行了優(yōu)化，通過添加細(xì)胞增殖劑，達(dá)到了提高疫苗效價(jià)的目的。

通過對3個(gè)不同廠家的血清從細(xì)胞貼壁和成品蝕斑計(jì)數(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行選擇，從而選擇出了既有利于

細(xì)胞貼壁又能提高產(chǎn)品效價(jià)的血清；對水解乳蛋白選用高壓蒸汽滅菌和除菌過濾兩種方式進(jìn)行對比，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，使水解乳蛋白營養(yǎng)成分得以保留，更有利于細(xì)胞的生產(chǎn)，增加蝕斑數(shù)量，提高疫苗效價(jià)。

1 材料

1.1 細(xì)胞和種毒

雞胚成纖維細(xì)胞為10日齡SPF雞胚，按常規(guī)方法制備；雞馬立克氏病火雞皰疹病毒FC-126株。

1.2 培養(yǎng)液

乳漢液、漢克氏液、胰酶消化液、SPGA液、M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、水解乳蛋白、增殖劑。

1.3 器材和設(shè)備

各種無菌的鑷子、平皿、燒杯、漏斗、玻璃瓶、轉(zhuǎn)瓶、紗布漏斗、三角瓶等；轉(zhuǎn)瓶機(jī)、倒置顯微鏡、水浴鍋、4℃冰柜、離心機(jī)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 血清的選擇

由于雞馬立克氏病活疫苗生產(chǎn)過程中一直使用牛血清，我們就隨機(jī)選取了三家企業(yè)（國內(nèi)1，國外1、國外2）生產(chǎn)的血清通過細(xì)胞貼壁、產(chǎn)毒量方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并通過對企業(yè)生產(chǎn)方式以及銷售價(jià)格方面進(jìn)行比較，從中選出一種既能生產(chǎn)出高質(zhì)量馬立克氏病疫苗又可降低生產(chǎn)成本的血清。

2.1.1 不同廠家血清對細(xì)胞貼壁情況的影響

按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》制作雞胚成纖維細(xì)胞懸液，分成三組分別加入等比例的國內(nèi)1、國外1、國外2三家企業(yè)生產(chǎn)的牛血清，裝入細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶，在溫室內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。在培養(yǎng)到16h、20h、24h時(shí)分別觀察細(xì)胞貼壁情況。共進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，對三家企業(yè)提供的牛血清進(jìn)行比較。

2.1.2 不同廠家血清對產(chǎn)毒量的影響

在實(shí)驗(yàn)過程中分成三組，在制作雞胚成纖維細(xì)胞和整個(gè)培養(yǎng)過程中分別加入等比例的國內(nèi)1、國外1、國外2三家企業(yè)生產(chǎn)的牛血清，在貼壁后24h時(shí)直接接種雞馬立克氏病火雞皰疹病毒，繼續(xù)培養(yǎng)72h收獲細(xì)胞，分裝、凍干后，對產(chǎn)品進(jìn)行蝕斑計(jì)數(shù)（效力檢驗(yàn)）測定，進(jìn)行三次平行對比試驗(yàn)。

2.2 水解乳蛋白滅菌方式對比試驗(yàn)

按生產(chǎn)工藝要求制作水解乳蛋白水溶液，分成兩組，分別采用高壓蒸汽滅菌（116℃ 25min）和過濾除菌兩種方法除菌后，分別測定無菌情況。并用除菌后的水解乳蛋白水溶液分別進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和接毒，對生產(chǎn)出的產(chǎn)品進(jìn)行蝕斑計(jì)數(shù)（效力檢驗(yàn)）測定。

2.3 病毒增殖劑的使用對比試驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)添加劑提供了病毒復(fù)制時(shí)所需的營養(yǎng)成分，促進(jìn)了病毒的復(fù)制，同時(shí)又具有營養(yǎng)細(xì)胞的功能。其主要效果：第一，促進(jìn)細(xì)胞貼壁、延緩細(xì)胞老化、提高細(xì)胞的活力；第二，促進(jìn)病毒復(fù)制，使完整病毒粒子數(shù)增加，缺陷病毒粒子數(shù)減少，提高疫苗的效價(jià)；第三，提高疫苗的病毒含量，增強(qiáng)免疫原性。

在原有雞馬立克氏病活疫苗生產(chǎn)用營養(yǎng)液中，按一定比例加入病毒增殖劑，來增強(qiáng)細(xì)胞的活力和加強(qiáng)細(xì)胞毒增殖。通過實(shí)驗(yàn)，分別對常規(guī)組與添加病毒增殖劑組馬立克氏病活疫苗產(chǎn)品進(jìn)行蝕斑計(jì)數(shù)（效力檢驗(yàn)）測定。

3 結(jié)果

3.1 血清選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 不同廠家血清對細(xì)胞貼壁情況的影響

通過實(shí)驗(yàn)得出：國內(nèi)1企業(yè)和國外1企業(yè)血清細(xì)胞貼壁情況趨于一致，但國內(nèi)1企業(yè)血清在實(shí)驗(yàn)過程中觀察死細(xì)胞較多；國外2企業(yè)血清無論在細(xì)胞的貼壁速度還是貼壁率方面，都要優(yōu)于國內(nèi)1和國外1企業(yè)血清。

3.1.2 不同血清對產(chǎn)毒量的影響

通過實(shí)驗(yàn)，國外2企業(yè)血清生產(chǎn)的疫苗效價(jià)明顯高于其他兩個(gè)廠家。

3.2 水解乳蛋白滅菌對比試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)對比數(shù)據(jù)得出：水解乳蛋白通過過濾除菌的方法好于高壓蒸汽滅菌，可以提高成品效價(jià)10%以上。

3.3 病毒增殖劑的使用對比試驗(yàn)結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)得出，使用病毒增殖劑后，可以使產(chǎn)品的效價(jià)大幅提高，甚至成倍的增長。也表明在原有生產(chǎn)量不變的情況下，使疫苗的質(zhì)量得到了很大的提高。

4 討論

通過3個(gè)廠家血清對細(xì)胞貼壁情況及生產(chǎn)出的雞馬立克氏病活疫苗產(chǎn)品蝕斑計(jì)數(shù)結(jié)果的對比，可以看出，使用國外2廠家的血清，細(xì)胞貼壁情況效果最佳，而且生產(chǎn)出來的疫苗效價(jià)高。細(xì)胞貼壁的情況，直接影響蝕斑含量，影響著疫苗的效價(jià)。由于馬立克病毒是細(xì)胞結(jié)合性病毒，在有相對多細(xì)胞的情況下，會(huì)引起足夠多的細(xì)胞感染，所以細(xì)胞的貼壁情況對產(chǎn)品的效價(jià)影響很大。使用國外2廠家血清細(xì)胞貼壁效果好，所以效價(jià)最高。

根據(jù)對血清生產(chǎn)廠家的了解，國內(nèi)廠家生產(chǎn)的血清普遍批量小、批次之間的差距大、質(zhì)量參差不齊；在血清的制作過程中，對犢牛的選擇不夠嚴(yán)格；生產(chǎn)工藝不夠精細(xì)。國外廠家血清批量大，能保證同一批次大量供貨；在血清的制作中添加有利于細(xì)胞生長的因子；生產(chǎn)工藝優(yōu)良，產(chǎn)品質(zhì)量過硬。雖然國外2進(jìn)口血清單價(jià)高于國內(nèi)1，但采用國外2廠家血清生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量高于國內(nèi)1廠家和國外1廠家，同時(shí)由于國外血清廠家能提供足夠量的同批次血清，減少了批間差，能夠保證生產(chǎn)順利進(jìn)行。

通過水解乳蛋白滅菌方式對比試驗(yàn)可以看出，由于水解乳蛋白水溶液在高壓蒸汽滅菌時(shí)會(huì)造成營養(yǎng)成分流失，細(xì)胞的生長活力和病毒的復(fù)制受到影響；而采用除菌過濾方式水解乳蛋白營養(yǎng)成分得以保留，更有利于細(xì)胞的生長，增加蝕斑數(shù)量，提高疫苗效價(jià)。因此，我們在實(shí)際生產(chǎn)中采用過濾除菌的方法，不但促進(jìn)了細(xì)胞的生長，同時(shí)也減少了試劑的浪費(fèi)。

通過10批的病毒增殖劑使用對比試驗(yàn)，表明在改良營養(yǎng)液中細(xì)胞生長的形態(tài)更為典型、活力更好，同時(shí)在原有生產(chǎn)量的情況下產(chǎn)品的效價(jià)得到了大幅的提高。在過去生產(chǎn)中高蝕斑含量的疫苗只有通過增加抗原的用量，減少配苗分裝的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)在通過添加病毒增殖劑，在原有計(jì)劃產(chǎn)量的基礎(chǔ)上蝕斑含量提高了一倍，從而提高了產(chǎn)量及效價(jià)，大大降低了生產(chǎn)成本。

5 結(jié)論

成本。通過營養(yǎng)液的優(yōu)化使我公司的雞馬立克氏病HVT活疫苗的生產(chǎn)逐步走向穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)。

雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗優(yōu)化培養(yǎng)研究有2年多的時(shí)間，應(yīng)用到規(guī)模生產(chǎn)也有2年多的時(shí)間，經(jīng)受住了市場和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的檢驗(yàn)，結(jié)果證明該工藝已經(jīng)得到完善，而且投放市場近5億全份產(chǎn)品無一例免疫失敗現(xiàn)象，樹立了企業(yè)品牌，取得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

通過對不同廠家血清的選擇、水解乳蛋白滅菌方式的對比、病毒增殖劑的使用來優(yōu)化細(xì)胞營養(yǎng)液，不但增加了可利用的有效活細(xì)胞數(shù)量，也提高了病毒在生產(chǎn)過程的增殖，使產(chǎn)品效價(jià)由原來的每羽份蝕斑含量3 000～4 000 PFU提高到6 000～10 000 PFU；同時(shí)在沒有優(yōu)化營養(yǎng)液前每萬羽份原材料投入是41.5元，優(yōu)化后每萬羽份的原材料投入是33元，既保證了產(chǎn)品質(zhì)量又降低了生產(chǎn)