林耀華，安瑞芳，易莉莎，張勇華

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽421001；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061；3.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623)

絨癌細(xì)胞株BeWo合體化后對不同化療藥物敏感性變化的研究

林耀華1，安瑞芳2，易莉莎3，張勇華2

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽421001；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061；3.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623)

目的 通過檢測絨癌細(xì)胞株BeWo合體化前后對不同化療藥物敏感性的差異，探討滋養(yǎng)細(xì)胞合體化與惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤耐藥的關(guān)系，為臨床惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，尤其是耐藥惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的治療提供新的思路和方法。方法 利用forsoklin誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞株BeWo融合；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測Syncytin、Survivin基因在forskolin作用0、24h、48h、72h的絨癌細(xì)胞株BeWo中的表達(dá)；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測Survivin、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)蛋白在forskolin作用0、24h、48h、72h的絨癌細(xì)胞株BeWo中的表達(dá)；應(yīng)用噻唑藍(lán)比色分析實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測forskolin作用0、24h、48h、72h的絨癌細(xì)胞株BeWo的增殖以及絨癌細(xì)胞株BeWo融合前后對5-氟尿嘧啶(5-Fu)、甲氨蝶呤(MTX)、順鉑等不同化療藥物的敏感性。結(jié)果 ①forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株中Syncytin基因的表達(dá)增強(qiáng)，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，Syncytin的表達(dá)越強(qiáng)，于48小時(shí)達(dá)到高峰；forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株中Survivin基因的表達(dá)下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)Survivin mRNA越低；②forskolin處理后的BeWo細(xì)胞株中Survivin和PCNA蛋白的表達(dá)均下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)越弱；③與對照組比較，forskolin處理后的BeWo細(xì)胞株的增殖能力下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為5.722、6.380、7.131，均P<0.05)；隨著forskolin作用時(shí)間越長，BeWo細(xì)胞株增殖能力下降越明顯。同對照組比較， forskolin作用48h后的BeWo細(xì)胞株對5-Fu、MTX、順鉑等不同化療藥物的敏感性增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F值為5.806～11.203，均P<0.05)。結(jié)論 絨癌細(xì)胞株BeWo合體化后其增殖能力下降，且其增殖相關(guān)基因Survivin、PCNA的表達(dá)也下降。絨癌細(xì)胞株BeWo合體化后對5-Fu、MTX、順鉑等不同化療藥物的敏感性均增高，推測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞合體化可能改善惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的耐藥性，但妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞合體化與惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤耐藥的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾??；促融素；細(xì)胞融合；生存素；增殖細(xì)胞核抗原

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestational trophoblastic tumor，GTT)是由妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞異常發(fā)育及增殖所致的與妊娠相關(guān)的腫瘤。我國位于該病的高發(fā)區(qū)，葡萄胎在我國的發(fā)病率是0.8‰～1.0‰。由于我國龐大的妊娠婦女基數(shù)，使得該病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國育齡婦女生命健康的惡性疾病之一[1]。GTT對化療十分敏感，早期患者治愈率達(dá)90%以上，但晚期及耐藥的GTT治愈率僅在30 %～40 %，故解決GTT耐藥復(fù)發(fā)問題已經(jīng)成為該腫瘤的研究重點(diǎn)[2]。目前大多數(shù)相關(guān)研究主要從耐藥分子機(jī)制以及聯(lián)合化療方案開發(fā)等方面探索GTT耐藥問題，而對滋養(yǎng)細(xì)胞合體化及其與GTT耐藥關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 材料

人絨癌細(xì)胞株BeWo購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞庫；Ham’s F12 培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自四季青生物公司；forskolin由華誠生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)；PCR mix 和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermantas MBI公司；Syncytin、Survivin基因引物購自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鼠抗人Survivin多克隆抗體購自美國Santa Cruze公司；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司；5-Fu、MTX、順鉑購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

BeWo細(xì)胞株用含15 %胎牛血清的 Ham’s F12培養(yǎng)基在37℃、5 %CO2中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，0.125%胰酶和0.01%EDTA 消化傳代。取指數(shù)生長期的BeWo細(xì)胞(約為70%～80%)，分為4組，用終濃度為100mmol/L forskolin分別作用0、24、48、72h。

1.2.2 RT-PCR檢測Syncytin、Survivin基因的表達(dá)

常規(guī)消化并收集細(xì)胞，按總RNA提取試劑盒fast200說明提取總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后按 PCR mix試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物：Syncytin基因：上游5′-CAACTGCTATC￣ACTCTGCCACTC-3′，下游5′ -TTCTCTTGCCTGATC￣TTGAA￣CTCC-3＇，產(chǎn)物大小為 169 bp；Survivin基因：上游5′-CTTCTGGGCTATGGGTGAGGTTC-3′，下游5′-TTGGCTTG￣CTGG￣TCTCTT￣CTGG-3′，產(chǎn)物大小為112bp；β-actin：上游5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游5′-AAAGGGTGTA￣ACGC￣AACT AA-3′，產(chǎn)物大小為 302 bp。

反應(yīng)條件：Syncytin基因：94℃欲變性5min，94℃變30s，57℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；Survivin基因：94℃欲變性5min，94℃變性30s，61℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min；β-actin：94℃欲變性5min，94℃變30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延7min。各擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.3 Western-blot檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Survivin 蛋白及PCNA蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)提取：常規(guī)消化、傳代細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞增長至80%時(shí)，各培養(yǎng)皿更換含100mmol/L forskolin的培養(yǎng)基，分別作用0、24、48、72h。吸凈培養(yǎng)基，4℃PBS洗細(xì)胞3次，將PBS吸凈，加入Triple裂解緩沖液200μL，將裂解物轉(zhuǎn)移至2.5mL離心管，充分混勻后離心，將上清液吸出，留待蛋白定量和實(shí)驗(yàn)。SDS-PAGE電泳和免疫印跡：采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，以30μg/孔上樣，在12%(體積分?jǐn)?shù))的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移法23V 12h將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，在含0.5g/L脫脂奶粉的TBST中37℃封閉1h，分別加入一抗(鼠抗人Survivin多克隆抗體，稀釋度為1:200或兔抗人PCNA多克隆抗體，稀釋度為1:200)，4℃孵育過夜，TBST充分漂洗(3min×6次)，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，稀釋:1:2 000)，37℃作用1h，TBST充分漂洗(3min×6次)，DAB顯色，觀察結(jié)果。數(shù)據(jù)分析采用凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.4 MTT檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株的增殖情況

常規(guī)消化細(xì)胞，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為 106～107/ L，取上述細(xì)胞懸液200μL接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組。當(dāng)細(xì)胞增長至80%時(shí)，取出96孔板，更換培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用含100mmol/L forskolin的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h，對照組用不含forskolim的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。加入5mg/ L的MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒出培養(yǎng)液，加入150μL 二甲基亞砜振蕩溶解10min?？瞻讓φ照{(diào)零，酶聯(lián)儀檢測波長為490nm時(shí)各孔的吸光值(A值)。該實(shí)驗(yàn)過程中每組各設(shè) 8個(gè)復(fù)孔，重復(fù)6 次。

1.2.5 MTT檢測forskolin作用前后的BeWo細(xì)胞株對不同化療藥物的敏感性

常規(guī)消化細(xì)胞，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為 106～107/L，取上述細(xì)胞懸液200μL接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增長至70%～80%時(shí)，每塊培養(yǎng)板一半繼續(xù)按原條件培養(yǎng)48h，另一半用含100mmol/L forskolin的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。更換培養(yǎng)基，分成3組，一組加入5-Fu，使終濃度分別為 25、50、100、200μg/mL , 一組加入MTX，使終濃度分別為 0.5、1、2、4μg/mL，一組加入順鉑，使終濃度分別為 0.5、1、2、4μg/mL，各組分別作用24h、48h。加入5mg/ L 的MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，倒出培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜振蕩溶解10min?？瞻讓φ照{(diào)零，酶聯(lián)儀檢測波長為490nm時(shí)各孔的吸光值(A值)。該實(shí)驗(yàn)過程中每組各設(shè) 8個(gè)復(fù)孔，重復(fù)6 次。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，采取重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料的方差分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01時(shí)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Syncytin基因及Survivin基因的表達(dá)

2.1.1 RT-PCR檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Syncytin基因的表達(dá)

forskolin是一種常用的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，其可通過誘導(dǎo)Syncytin基因的表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的融合。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Syncytin基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株中Syncytin基因的表達(dá)增強(qiáng)，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，Syncytin的表達(dá)越強(qiáng)，于48h達(dá)到高峰，見圖1。

2.1.2 RT-PCR檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中 Survivin基因的表達(dá)

應(yīng)用RT-PCR檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中 Survivin基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株Survivin基因的表達(dá)下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)Survivin mRNA越低，見圖2。

圖1 forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Syncytin基因的表達(dá)(RT-PCR)

Fig.1 Expressions of Syncytin mRNA in BeWo treaded with forskolin

for different time(RT-PCR)

圖2 forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中 Survivin基因的表達(dá)(RT-PCR)

Fig. 2 Expressions of Survivin mRNA in BeWo treaded with

forskolin for different time(RT-PCR)

2.2 Western-blot檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Survivin 蛋白及PCNA蛋白的表達(dá)

2.2.1 Western-blot檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Survivin 蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Western-blot 檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Survivin 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株Survivin 蛋白的表達(dá)下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)Survivin 蛋白越低，見圖3。

圖3 forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中Survivin 蛋白的表達(dá)(Western-blot)

Fig.3 Expression of Survivin protein in BeWo treaded with forskolin for different time(Western-blot)

2.2.2 Western-blot檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中PCNA蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Western-blot 檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中PCNA蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株P(guān)CNA蛋白的表達(dá)下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)PCNA蛋白越低，見圖4。

圖4 forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株中PCNA蛋白的 表達(dá)(Western-blot)

Fig. 4 Expression of PCNA protein in BeWo treaded with forskolin for different time(Western-blot)

2.3 MTT檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株的增殖

應(yīng)用MTT檢測forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株的增殖情況，結(jié)果顯示forskolin作用后的BeWo細(xì)胞株的增殖能力顯著下降(均P<0.05)。隨著forskolin作用時(shí)間的越長，BeWo細(xì)胞株增殖能力下降的越明顯(見表1，圖5)。

圖5 forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株的增殖情況

Fig.5 Proliferations of BeWo treaded with forskolin for different time

2.4 MTT檢測forskolin作用前后的BeWo細(xì)胞株對不同化療藥物的敏感性

應(yīng)用MTT檢測5-Fu、MTX、順鉑等不同化療藥物不同濃度作用24h、48h對forskolin處理前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況，結(jié)果顯示同未予forskolin處理的BeWo細(xì)胞株即對照組比較，這些藥物對forskolin處理48h后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制增強(qiáng)，且通過重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料的方差分析，按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，均P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2至表7、圖6至圖11)。

圖6 不同濃度的5-Fu作用24h對forskolin處理前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況

Fig. 6 Inhibitory effects of 5-Fu with different concentrations for 24 hours on the proliferation of BeWo before and after treatment with forskolin

圖7 不同濃度的5-Fu作用48h對forskolin作用前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況

Fig.7 Inhibitory effects of 5-Fu with different concentrations for 48 hours on the proliferation of BeWo before and after treatment with forskolin

圖8 不同濃度的MTX作用24h對forskolin處理前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況

Fig.8 Inhibitory effects of MTX with different concentrations for 24 hours on the proliferation of BeWo before and after treatment with forskolin

圖9 不同濃度的MTX作用48h對forskolin處理前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況

Fig.9 Inhibitory effects of MTX with different concentrations for 48 hours on the proliferation of BeWo before and after treatment with forskolin

圖10 不同濃度的順鉑作用24h對forskolin處理前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況

Fig.10 Inhibitory effects of Cisplatin with different concentrations for 24 hours on the proliferation of BeWo before and after treatment with forskolin

圖11 不同濃度的順鉑作用48h對forskolin處理前后的BeWo細(xì)胞株的增殖抑制情況

Fig.11 Inhibitory effects of Cisplatin with different concentrations for 48 hours on the proliferation of BeWo before and after treatment with forskolin

3 討論

3.1 細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是指在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源(種、屬間)細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合在細(xì)胞生物界中是非常少見的現(xiàn)象。在人體組織中存在3種典型的合胞體組織，即合體滋養(yǎng)細(xì)胞層、橫紋肌纖維、軟骨或破骨細(xì)胞。晶狀體纖維可能也具有融合活性。細(xì)胞融合是一種特殊的分化途徑，在生物體的正常生長、發(fā)育過程中起了非常重要的作用。在正常妊娠過程中，胎盤絨毛組織中細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞通過增殖、分化，最終融合形成合體滋養(yǎng)細(xì)胞，在胎盤正常結(jié)構(gòu)的形成和維持胎兒正常生長、發(fā)育等方面起了重要作用。目前關(guān)于滋養(yǎng)細(xì)胞合體化的具體機(jī)制尚不明了。有研究認(rèn)為這可能與滋養(yǎng)細(xì)胞特異性表達(dá)的一種膜糖蛋白Syncytin有關(guān)。

Syncytin是人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因HERV-WE1編碼的膜糖蛋白。正常情況下它僅表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)層，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞融合形成合胞體滋養(yǎng)層[3-4]。Syncytin的表達(dá)受到多種因素的影響。有資料顯示，低氧、超氧化物歧化酶-1 (Superoxide Dismutase-1，SOD-1)可以抑制Syncytin的表達(dá)，而粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、內(nèi)皮生長因子、forskolin、環(huán)腺苷酸 (Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)、地塞米松、雌激素、人絨毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin，hCG)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失-1 (glial cells missing-1，GCM-1)等可以誘導(dǎo)Syncytin的表達(dá)[5]。forskolin是一種常用的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，其可以通透細(xì)胞，激活腺苷酸環(huán)化酶，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高。國內(nèi)外許多研究證實(shí)forskolin可以通過誘導(dǎo)Syncytin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的融合。Borges等[6]應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)熒光標(biāo)記方法來觀察forskolin誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞株Bewo融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種不同細(xì)胞質(zhì)熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞在forskolin作用下共同培養(yǎng)一段時(shí)間后同一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了兩種不同的熒光，且于forskolin作用48h達(dá)到高峰，說明forskolin可以誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞株融合，且于forskolin作用48h達(dá)到高峰。本研究應(yīng)用RT-PCR檢測了forskolin作用不同時(shí)間后的BeWo細(xì)胞株中Syncytin mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Syncytin在forskolin處理后的細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)越強(qiáng)，并于48h達(dá)到高峰，證實(shí)了forskolin可以誘導(dǎo)Syncytin基因的表達(dá)。

3.2 細(xì)胞融合與細(xì)胞凋亡

在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞合體化過程中細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化到一定階段出現(xiàn)可逆的凋亡早期事件，如Caspase-3、6、7、8、10、14等表達(dá)，尤其是Caspase-3、6、8的活化、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)的外移[7-8]。Rote等[9]研究發(fā)現(xiàn)采用siRNA技術(shù)抑制Caspase-8表達(dá)，可以抑制促融劑forskolin引起的絨癌細(xì)胞株BeWo的融合。Caspase-8活化、PS外移是觸發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞合體化的重要原因，也是成熟合體滋養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。巧合的是，Caspase-8活化、PS外移也特征性地出現(xiàn)在細(xì)胞凋亡早期。本研究應(yīng)用MTT檢測了forskolin作用不同時(shí)間的BeWo細(xì)胞株的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同對照組比較，forskolin處理后的BeWo細(xì)胞株的增殖能力下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其增殖能力下降越明顯，說明forskolin誘導(dǎo)融合后的BeWo細(xì)胞株的增殖能力下降，推測融合后的BeWo細(xì)胞株增殖能力的下降可能與其融合過程中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡早期事件有關(guān)。

Survivin基因由Ambrosini 等首次從人類基因組庫中分離出來，是迄今最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞周期調(diào)控、參與并促進(jìn)血管形成等功能，是聯(lián)系細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的重要因子，其主要表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織中，在大多數(shù)分化成熟的正常成人組織中沒有表達(dá)[10-11]。PCNA由Miyachi等首次發(fā)現(xiàn)，其廣泛表達(dá)于各類組織的增殖細(xì)胞中，是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的多肽鏈，在DNA主鏈復(fù)制、修復(fù)，正常細(xì)胞周期循環(huán)中必不可少，同時(shí)也是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，存在于細(xì)胞核中，作為DNA聚合酶的輔助蛋白，直接參與細(xì)胞增殖過程中DNA復(fù)制，其表達(dá)水平反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖情況[12-13]。Survivin、PCNA蛋白都是與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白，它們的表達(dá)下降說明細(xì)胞增殖下降，細(xì)胞凋亡增加。

本研究應(yīng)用Western-blot檢測了forskolin作用0、24h、48h、72h的絨癌細(xì)胞株BeWo中Survivin、PCNA蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)forskolin處理后的BeWo細(xì)胞株Survivin和PCNA蛋白的表達(dá)均下降，且隨著forskolin作用時(shí)間的延長，其表達(dá)越低，進(jìn)一步證實(shí)了融合后的絨癌細(xì)胞株BeWo的增殖能力下降，其細(xì)胞凋亡增加。

3.3 細(xì)胞凋亡與惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤耐藥

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多途徑、多步驟的過程。原癌基因、癌基因的激活和抑癌基因的失活，擾亂了細(xì)胞正常的增殖、分化調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。而細(xì)胞凋亡的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞存活期延長，死亡率下降。細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞凋亡的抑制打破了細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，破壞了機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的平衡，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的失調(diào)關(guān)系表現(xiàn)為：①細(xì)胞增殖增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減弱；②細(xì)胞增殖不增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡顯著減弱；③細(xì)胞增殖和凋亡均增強(qiáng)，但前者明顯超過后者。

腫瘤治療的目的在于殺傷腫瘤細(xì)胞，臨床上的化學(xué)藥物治療、放射治療、熱療以及一些生物治療的重要機(jī)制之一是引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。放射治療和化學(xué)藥物治療是目前臨床上治療腫瘤最常用的方法，其治療腫瘤的機(jī)制雖是多方面的，但近來許多研究發(fā)現(xiàn)放療和化療均可引起腫瘤細(xì)胞凋亡，可能是腫瘤細(xì)胞死亡的主要方式。放療輻射可引起腫瘤細(xì)胞的DNA無法修復(fù)的損傷。p53、bcl-2、bax基因參與了放療引起的細(xì)胞凋亡。許多抗腫瘤化療藥物如烷化劑、順鉑、氮芥類化合物、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、干擾微管藥物等則可能通過p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性是腫瘤化療失敗的主要原因之一，因此，腫瘤的抗藥性仍是有待解決的一大難題。隨著對細(xì)胞凋亡研究的深入，人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞的抗藥性有著內(nèi)在的密切關(guān)系，細(xì)胞凋亡的抑制在腫瘤細(xì)胞抗藥性的形成過程中起一定的作用。

本研究正是基于上述理論，根據(jù)滋養(yǎng)細(xì)胞合體化過程中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡早期事件和合體化的滋養(yǎng)細(xì)胞處于細(xì)胞分化終末期，脫離了細(xì)胞周期，不具有細(xì)胞增殖的能力，利用forskolin誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞株BeWo融合，并應(yīng)用MTT檢測了BeWo細(xì)胞株融合前后對5-Fu、MTX及順鉑等不同化療藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)與融合前的BeWo細(xì)胞株比較，融合后的BeWo細(xì)胞株對上述不同化療藥物的敏感性均增高，且兩者間的差異通過重復(fù)設(shè)計(jì)資料的方差分析，按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，均P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即絨癌細(xì)胞株BeWo融合后對化療藥物的敏感性增高，說明滋養(yǎng)細(xì)胞合體化后可以改善其對化療藥物的敏感性，推測誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞融合可能可以改善惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的耐藥。但滋養(yǎng)細(xì)胞合體化后對化療藥物敏感性增高的具體機(jī)制目前尚不明了，滋養(yǎng)細(xì)胞合體化與惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤耐藥的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Changes of sensitivity of choriocarcinoma cell line BeWo to different chemotherapy drugs after fusion

LIN Yao-hua1, AN Rui-fang2, YI Li-sha3, ZHANG Yong-hua2

(1.FirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversity,HunanHengyang421001,China；2.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China；3.GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,GuangdongGuangzhou510623,China)

Objective To develop a new therapy for gestational trophoblastic tumor (GTT), especially drug-resistant GTT in clinics through researching the changes in the sensitivity of BeWo before and after fusion to different chemotherapy drugs and exploring the relationship between syncytial fusion of trophoblast cells and drug resistance of GTT. Methods Forskolin was utilized to induce intercellular fusion of choriocarcinoma cell line BeWo. The expressions of Syncytin and Survivin mRNA in choriocarcinoma cell line BeWo treated with forskolin for 0, 24, 48 and 72 hours were detected by RT-PCR, while Western-blot was used to detect the expressions of Survivin and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) proteins in BeWo treated with forskolin for 0, 24, 48 and 72 hours. The proliferations of choriocarcinoma cell line BeWo treated with forskolin for 0, 24, 48 and 72 hours and the sensitivity of BeWo to 5-Fu, MTX and Cisplatin before and after fusion were detected by MTT. Results The expression of Syncytin gene in BeWo cell line treated with forskolin increased, and with the prolonging of treatment, the expression was higher and reached its peak at 48 hour. The expression of Survivin gene in BeWo cell line treated with forskolin declined, and with the prolonging of treatment, the expression was lower. After treatment with forskolin, the expressions of Survivin and PCNA proteins in BeWo cell line declined, and as the cell line were treated longer, the expressions were lower. Compared with the control group, the proliferation of BeWo cell line treated with forskolin decreased with statistical significance (Fvalue was 5.722, 6.380 and 7.131, respectively, allP<0.05). The decrease of proliferation of BeWo cell line was more serious when treatment with forskolin was longer. Compared with the control group, BeWo cell line treated with forskolin for 48 hours were more sensitive to 5-Fu, MTX and Cisplatin, and the differences were significant (Fvalue ranged 5.806-11.203, all P<0.05). Conclusion The proliferation of choriocarcinoma cell line BeWo decreases after fusion, and the expressions of related Survivin and PCNA genes in these cells also decrease. Choriocarcinoma cell line BeWo is more sensitive to 5-Fu, MTX and Cisplatin after intercellular fusion. So it can be speculated that intercellular fusion of trophoblast cells may improve drug resistance of malignant GTT. However, the relationship between intercellular fusion of trophoblast cells and drug resistance of malignant GTT needs further researches.

gestational trophoblastic disease; Syncytin; cell fusion; Survivin; proliferating cell nuclear antigen

2015-06-07

林耀華(1983-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤研究。

安瑞芳，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.026

R711.7

A

1673-5293(2015)06-1189-06