白春俠

（遼寧省營口市中心醫(yī)院病理科，遼寧 營口 115000）

卵巢腫瘤組織中鳥嘌呤交換因子Dock180的表達(dá)及作用

白春俠

（遼寧省營口市中心醫(yī)院病理科，遼寧 營口 115000）

目的 分析卵巢腫瘤組織中鳥嘌呤交換因子Dock180的表達(dá)及作用。方法 選取我院收治的卵巢良性腫瘤患者40例、卵巢交界性腫瘤24例及卵巢癌患者36例為本次研究對象，采用免疫組化法SP法對其組織中Dock180蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測并分析。結(jié)果 在本次研究中，卵巢癌患者組織中Dock180蛋白灰度值顯著高于卵巢交界性腫瘤及卵巢良性腫瘤（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。卵巢癌患者組織中Dock180蛋白的陽性表達(dá)率為66.7%，卵巢交界性腫瘤組織中Dock180蛋白的陽性表達(dá)率為33.3%，卵巢良性腫瘤組織中Dock180蛋白的陽性表達(dá)率為15.0%，卵巢癌患者組織中Dock180蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于卵巢交界性腫瘤及卵巢良性腫瘤（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 鳥嘌呤交換因子Dock180蛋白在卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用，是反映卵巢癌惡性生物學(xué)行為的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

卵巢腫瘤組織；鳥嘌呤交換因子Dock180；表達(dá)；作用

Dock180是小GTP酶Rho家族的鳥嘌呤核苷交換因子，也就是Crk下游結(jié)合分子，其相對分子質(zhì)量為180×103，在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與細(xì)胞形態(tài)中具有重要意義。根據(jù)大量研究可知，CrkI、Dock180以及Racl在卵巢癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用[1]。我院為研究卵巢腫瘤組織中鳥嘌呤交換因子Dock180的表達(dá)及作用，選取40例卵巢良性腫瘤患者、24例卵巢交界性腫瘤及36例卵巢癌患者為研究對象，均采用Western blot及免疫組化法SP法對其Dock180表達(dá)進(jìn)行檢測，現(xiàn)相關(guān)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1組織標(biāo)本：選取我院病理科2013年1月至2014年6月收集的石蠟存檔標(biāo)本為研究組織標(biāo)本，其中卵巢良性腫瘤患者40例（均屬于漿液性囊腺瘤）、卵巢交界性腫瘤24例（均屬于漿液性交界性囊腺瘤）及卵巢癌患者36例（其中漿液性囊腺癌28例，黏液性囊腺癌8例）。本次研究的所有標(biāo)本在取材前均未進(jìn)行化療。在36例卵巢癌患者中，最大年齡為68歲，最小年齡為24歲，平均（48.1±3.3）歲；根據(jù)FIGO分期：Ⅰ期患者6例，Ⅱ期患者11例，Ⅲ期患者19例；根據(jù)組織學(xué)分級：高分化者8例，中分化者13例，低分化者15例。所有標(biāo)本均通過病理學(xué)診斷確定；使用10%的福爾馬林進(jìn)行固定，石蠟進(jìn)行包埋處理，4 μm連續(xù)切片。

1.2試劑與方法：選擇美國SANTA CRUZ公司生產(chǎn)的鼠抗人Dock180單克隆抗體，北京中山金橋生物有限公司生產(chǎn)的SP免疫組化試劑盒（SP-9002）以及DAB顯色試劑盒。①Western blot。在裂解組織或細(xì)胞中提取總蛋白，采用BCA法對總蛋白濃度進(jìn)行測定，取各項(xiàng)本上60 μg總蛋白實(shí)施SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封存，再依次加入一抗4 ℃過夜、二抗37 ℃反應(yīng)1.5 h，采用ECL plus試劑盒顯影曝光，待其凝膠成像儀照相后選擇Quan-tity One圖像分析軟件計(jì)算所有標(biāo)本的灰度值，計(jì)算目的蛋白條帶的灰度值以及β-actin灰度值之間的比值，獲取目的蛋白的相對表達(dá)水平。②免疫組化。對4 μm石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化，使用濃度為3%的過氧化氫孵育10 min，隨后進(jìn)行PBS沖洗，進(jìn)行微波修復(fù)抗原，加1∶500稀釋的一抗4 ℃過夜、二抗37 ℃孵育0.5 h，PBS沖洗，DAB顯色，并經(jīng)蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片，在光鏡下觀察、成像。

1.3陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：Dock180蛋白主要以細(xì)胞質(zhì)中存在明顯棕黃色顆粒細(xì)胞，可將其判斷為陽性。根據(jù)Shimizu方法，選擇5個(gè)400倍的高倍鏡視野計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和Dock180陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出Dock180陽性細(xì)胞比例，。無陽性染色體，可記為0分；陽性細(xì)胞數(shù)小于1/3，可記為1分，陽性細(xì)胞數(shù)在1/3～2/3，可記為2分；陽性細(xì)胞數(shù)＞2/3，可記為3分；著色為多數(shù)陽性細(xì)胞呈染色記分，無顯色，可記為0分；中度染色，可記為1分；強(qiáng)度染色，可記為2分。前述2分值之和為最終結(jié)果，其中0分可視為陰性（-），2分可視為弱陽性（+），3分可視為中度陽性（++），4分可視為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本次研究的所有數(shù)據(jù)均選用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)滿足P＜0.05時(shí)，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1Western blot檢測Dock180在三種卵巢組織中的表達(dá)分析：卵巢癌患者組織中Dock180灰度值為（1.054±0.113），卵巢交界性腫瘤組織中Dock180灰度值為（0.517±0.125），卵巢良性腫瘤組織中Dock180灰度值為（0.419±0.073）。卵巢交界性腫瘤與卵巢良性腫瘤組織中Dock180灰度值比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且卵巢癌患者組織中Dock180灰度值顯著高于卵巢交界性腫瘤及卵巢良性腫瘤（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2免疫組化法檢測Dock180蛋白在三種卵巢組織中的表達(dá)分析：Dock180蛋白一般存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，呈棕色或棕黃色顆粒，且為彌漫性表達(dá)。卵巢良性腫瘤中Dock180（-）34例，（+）2例，（++）2例，（+++）2例，陽性表達(dá)率為15.0%；卵巢交界性腫瘤中Dock180（-）16例，（+）4例，（++）2例，（+++）2例，陽性表達(dá)率為33.3%；卵巢癌中Dock180（-）12例，（+）7例，（++）8例，（+++）9例，陽性表達(dá)率為66.7%；卵巢癌患者組織中Dock180蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于卵巢交界性腫瘤及卵巢良性腫瘤（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討 論

卵巢癌是臨床常見的一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率極高，對患者的生活質(zhì)量及健康影響較大。由于有效篩選手段的缺乏，導(dǎo)致約有67%的卵巢癌患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，已基本喪失了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，預(yù)后效果較差，臨床一般采用腫瘤細(xì)胞滅減術(shù)以及以鉑類藥物為主的化療手段治療[3]。惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤以及轉(zhuǎn)移的主要條件為腫瘤細(xì)胞動(dòng)力的增加，這與細(xì)胞信號傳導(dǎo)關(guān)系密切[4]。在本次研究中，卵巢癌患者組織中Dock180灰度值為（1.054±0.113），均高于卵巢交界性腫瘤及卵巢良性腫瘤組織中Dock180灰度值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且卵巢癌組織中Dock180陽性表達(dá)率為66.7%，均高于高于卵巢交界性腫瘤（33.3%）及卵巢良性腫瘤（15.0%），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可知，Dock180表達(dá)在卵巢癌組織中最為明顯。

Dock180是Rho家族GTP酶的鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子，但不具有其他鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子的DH-PH（Db1）結(jié)構(gòu)域，主要含有可直接特異性結(jié)合Rac并調(diào)控Rac酶活性的結(jié)構(gòu)域。其中Rho家族GTP酶主要有Rac、RhoG、Cdc42等，都是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與細(xì)胞形態(tài)的關(guān)鍵分子。鳥嘌呤交換因子Dock180在人體細(xì)胞內(nèi)信號結(jié)合物下游，可直接和Crk的SH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行特異性結(jié)合，并將上游細(xì)胞內(nèi)信號直接傳遞至下游的小分子GTP酶的Racl中，經(jīng)激活Racl來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白，在細(xì)胞增殖基因表達(dá)與質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用。一旦在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中信號分子傳導(dǎo)發(fā)生異常，則可發(fā)生腫瘤病變[5]。因此用Western blot以及免疫組化法檢測對卵巢癌、卵巢交界性腫瘤及良性腫瘤組織中 Dock180蛋白進(jìn)行半定量式檢測，可有效掌握Dock180在女性卵巢癌組織中的表達(dá)情況及在該惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，可作為卵巢癌診斷以及反應(yīng)其惡性生物學(xué)行為中的新型標(biāo)志物。

[1] 高一萌,張瑜,李文燕,等.C3G/Rap1和 Dock180/Racl信號通路在卵巢癌浸潤中的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(11):1031-1034.

[2] 王瑾.Elmo1協(xié)同Dock180對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及卵巢癌惡性浸潤的作用[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2011.

[3] 羅淑娟,車亞玲,彭慧娟,等.C3G在卵巢癌組織中的表達(dá)及其在SKOV3細(xì)胞增殖中的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(14): 1471-1474.

[4] 張瑜,高一萌,李文燕,等.鳥嘌呤核苷交換因子Dock180與Elmol在卵巢癌細(xì)胞中的共表達(dá)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(13): 1277-1280.

[5] 王輝,令狐華,姚珍薇.鳥嘌呤交換因子Dockl80在卵巢腫瘤組織中的表達(dá)和意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(5):517-520.

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1671-8194（2015）30-0070-02