劉 冰， 張智曉， 劉 鋼

·綜述·

微小RNA作為感染性疾病標(biāo)志物的研究進展

劉 冰， 張智曉， 劉 鋼

微小RNA； 感染性疾?。?標(biāo)志物

哺乳動物細胞內(nèi)非編碼RNA主要有短小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、核仁內(nèi)小分子RNA(small nucleolar RNAs，snoRNA)等[1]。miRNA基因構(gòu)成約3%人類基因組，而人類miRNA總基因數(shù)目有數(shù)千，據(jù)估計，單個的miRNA可調(diào)控數(shù)百到上千目標(biāo)基因，因此，人類基因約30%～92%可能是由miRNA調(diào)控[2]。

1993年, Lee等[3]首先在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了長度為22 nt的非編碼小RNA——lin-4, 同時發(fā)現(xiàn)lin-4 RNA在lin-14基因的3′UTR(非翻譯區(qū))內(nèi)存在著互補位點。進一步研究表明, lin-4 RNA通過與lin-14基因的3′UTR特異性結(jié)合降低了LIN-14蛋白的表達水平, 但對lin-14基因的mRNA水平影響并不顯著,而lin-4 RNA便是現(xiàn)在所熟知的miRNA[4]。

miRNA是一類非編碼小RNA,在不同的真核生物之間高度保守。miRNA通常編碼于基因間，經(jīng)過精細的轉(zhuǎn)錄和加工而成，由RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級產(chǎn)物[5]。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成由70個核苷酸組成的pre-miRNA, 經(jīng)exportin 5等蛋白轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中,另一個核酸酶Dicer將其剪切成約22個核苷酸長度的miRNA雙鏈, 其中一條為成熟的miRNA分子, 成熟的miRNA分子在細胞內(nèi)與Argonaute蛋白等形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC), 并作用于特異mRNA的3′UTR, 從而抑制翻譯過程或直接降解mRNA[6]。

1 miRNA 在感染性疾病發(fā)生中的可能機制

miRNA在病原體-宿主相互作用中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答呈復(fù)雜性、雙向性。一方面，微生物編碼的miRNA參與調(diào)節(jié)微生物在宿主體內(nèi)的復(fù)制、存活，甚至損害宿主防御系統(tǒng)；另一方面，宿主合成自身miRNA，靶向作用于病原微生物毒力因子基因或者對病原微生物有關(guān)鍵作用的自身基因，以抑制病原微生物在體內(nèi)增殖，參與抗微生物免疫[7]。

1.1 miRNA與膿毒癥

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展與機體的免疫功能紊亂密切相關(guān)。因miRNA對機體免疫有特殊的調(diào)控作用，故在膿毒癥發(fā)病機制的研究中受到越來越多的關(guān)注。

早期診斷膿毒癥的標(biāo)志物包括C反應(yīng)蛋白、細胞因子(IL-l、IL-6、IL-10和TNFα)、趨化因子(IL-8、MPC-1和G-CSF)、降鈣素原等，特別是降鈣素原曾經(jīng)被認為是膿毒癥的潛在標(biāo)志物[8]。但近來有文獻稱降鈣素原不能區(qū)分膿毒癥和非感染性的SIRS，因而不能作為診斷膿毒癥的特定指標(biāo)[9]。研究者對來自膿毒癥、SIRS和正常人的血清中miRNA(miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223、miR-15b、miR-126、Let-7i)進行分析，得出miR-146a和miR-223在膿毒癥組中有明顯的減少，受試者工作特征曲線(ROC)曲線下面積miR-146a、miR-223和IL-6各自為0.858、0.804和0.785，作為膿毒癥新的診斷標(biāo)志物，miR-146a和miR-223具有高特異度和高靈敏度[10]。

Vasilescu 等[11]首先對比了膿毒癥患者白細胞miRNA 表達譜，發(fā)現(xiàn)在所有膿毒癥患者中均出現(xiàn)變化的miRNA 有4 個，miR-150 和miR-342-5p下調(diào)，miR-182和miR-486上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-150的含量與患者序貫性器官衰竭評分(SOFA) 分值呈負相關(guān)， 其中促炎因子TNFα 和抗炎因子IL-10、IL-18在膿毒癥患者的血漿中均顯著上升，其含量與miR-150 的血漿含量呈負相關(guān)，利用血漿IL-18 和miR-150 的比值，進一步可以區(qū)分miR-150 含量不同的膿毒癥患者。

循環(huán)血液中miR-150、miR-146a和miR-223皆可作為膿毒癥患者的血清標(biāo)志物[12]。Wang等[13]研究證實，miR-146a可以作為區(qū)分膿毒癥和非膿毒癥的潛在標(biāo)志物，有望用于臨床膿毒癥診斷。Wang 等[14]經(jīng)過綜合研究發(fā)現(xiàn)， 血液中miR-146a和 miR-223 含量能有效地區(qū)分感染和非感染原因?qū)е碌哪摱景Y和SIRS患者，當(dāng)特異度為100%時，其靈敏度分別是63.3%和80%。

綜上所述，膿毒癥患者外周血中miR-146a、miR-223、miR-150和miR-342-5p含量減少，而miR-182和miR-486含量增加。

最近的研究表明，90%血清miRNA結(jié)合到蛋白質(zhì)復(fù)合物，如Ago2，RNA結(jié)合蛋白核磷蛋白1 (NPM1) 和高密度脂蛋白[15]。這項研究證實了實驗性膿毒癥引起循環(huán)miRNA時間依賴性上調(diào)，這些miRNA有miR-16、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-26b、miR-106a、miR-106b、miR-195和miR-451。Wang等[16]的研究結(jié)論指出miR-16、miR-15a、miR-193b*和miR-483-5p與膿毒癥的診斷相關(guān)。血清中6種miRNA(miR-223、miR-15a、miR-16、miR-122、miR-193b*和miR-483-5p)編碼的蛋白質(zhì)為膿毒癥的標(biāo)志物，該蛋白對膿毒癥28 d病死率預(yù)測價值比SOFA和APACHE Ⅱ評分要高[17]。Roderburg等[18]的研究首次證實重癥監(jiān)護病房(ICU)患者的血清中miRNA測量值的預(yù)后價值。入院后的miR-150血清濃度與ICU膿毒癥等患者的生存和長期生存均密切相關(guān)，低miR-150水平表示預(yù)后不良。

1.2 miRNA與結(jié)核

miRNA在機體抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。幽門螺桿菌(Helicobaherpylori，HP)、沙門菌(Salmonella)、產(chǎn)單核細胞李斯特菌(L．monocytogenes，LM)、分枝桿菌等幾種常見細菌感染免疫中，miRNA調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答機制研究也取得了重要進展。

不同的miRNA，如miR-29a、miR-155、miR-155*、 miR-125b、 miR-3179a和miR-147可以是用于診斷結(jié)核的潛在生物標(biāo)志物，這些miRNA生物標(biāo)志物已被一部分獨立的科研團隊所驗證，但有待進一步確證[19]。Wu等[20]研究也證實miR-155、miR-155*可能是潛在的結(jié)核診斷的標(biāo)志物。Wiwanitkit等[21]研究表明 miR-155、miR-155*是活動性結(jié)核很好的診斷標(biāo)志物，并且miR-21在鏈霉素治療肺結(jié)核中起到了重要的作用。Zhang等[22]研究證實miR-378、miR-483-5p、miR-22、miR-29c、miR-101和miR-320b 6種血清miRNA的測定可以區(qū)分肺結(jié)核患者和健康人群。Qi等[23]研究提示 miR-361-5p、miR-889、miR-576-3p可作為快速診斷結(jié)核感染潛在的非侵襲性分子標(biāo)志物。Singh等[24]研究也提到miR-99B可能用于結(jié)核病的診斷和治療。Spinelli等[25]研究中結(jié)核病患者胸腔積液的單核細胞中miR-223、miR-421、miR-144*表達下調(diào)，外周血中單核細胞的miR-424升高。有研究表明 miR-29a表達在肺結(jié)核感染、發(fā)病過程中可能起到重要作用[26]，在抗結(jié)核感染中也起到了重要的作用[27]。Yi等[28]研究進一步說明miR-29a在抗結(jié)核免疫反應(yīng)中起到負向調(diào)節(jié)作用。

綜合以上研究結(jié)果，miR-155、miR-155*作為結(jié)核診斷標(biāo)志物的研究較多，而且miR-29a可能在結(jié)核診斷和治療中起到重要的的作用。

1.3 miRNA與肝炎

肝臟中含有大量的miR-122，Bihrer等[29]從患有慢性丙型肝炎的患者和正常人中分別抽取血清進行miR-122檢查，同時對患者組進行肝臟組織學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者血清中miR-122水平明顯高于正常對照組，并且miR-122水平與肝臟炎性反應(yīng)程度指標(biāo)具有相關(guān)性。因此，血清miR-122可作為慢性丙型肝炎壞死性炎性反應(yīng)的生物標(biāo)志物。還有研究小組研究了乙型肝炎患者以及乙肝病毒標(biāo)志陽性的肝癌患者血清中miRNA。Li等[30]選取正常對照組210例，乙型肝炎患者135例，丙型肝炎患者48例，乙型肝炎病毒標(biāo)志陽性的肝癌患者120例，使用 Solexa測序及實時定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗證分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16種有明顯差異的miRNA，其中13種血清miRNA(miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b、miR-23a、miR-342-3p miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、let-7c)可以作為乙型肝炎的生物標(biāo)志物，3種可以作為乙型肝炎病毒標(biāo)志陽性肝癌標(biāo)志物的miRNA(miR-375、miR-25、let-7f)。

1.4 miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)感染

病毒性腦炎是世界各地常見的腦部病毒感染，并且可由多種病毒引起，如蟲媒病毒、皰疹病毒，甚至艾滋病病毒。其中，1型單純皰疹病毒(HSV-1)具有嗜神經(jīng)性，能引起感染并且終身潛伏在神經(jīng)組織。與阿爾茨海默病類似，HSV-1感染與炎性反應(yīng)信號顯著上調(diào)相關(guān)，其中花生四烯酸的一個特定成員的表達增加已有報道。有研究也報道了在宿主的免疫調(diào)控和炎性反應(yīng)中miR-146a的作用[31]。Provost[32]研究顯示miR-342-3p可能成為動物和人類朊蛋白病的新型標(biāo)志物。

2 檢測方法

miRNA檢測方法大體可以歸為2類：一類是不需要樣本擴增的探針直接雜交法；另一類是基于樣本的miRNA擴增法[33]。

檢測循環(huán)miRNA的方法主要有：高通量測序法、miRNA芯片法、Northern blot 法、qRT-PCR 法。新一代的測序技術(shù)在序列未知的情況下可以對miRNA進行分析，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNA分子，但測序法價格昂貴，不適合普通實驗室開展。miRNA芯片是通過對樣本中已知miRNA序列進行的研究，得出特定的表達譜，但很難區(qū)分前體miRNA和成熟miRNA，所以芯片結(jié)果需要用qRT-PCR 進行確認。Northern blot 法步驟煩瑣，需要較多的樣本且靈敏度較低，不適合大批量臨床樣本檢測。qRT-PCR 是研究miRNA最常用的方法，可以對循環(huán)miRNA定性或者定量檢測，此法操作簡便、快速，且具有較高的靈敏度和特異度[34]。

3 應(yīng)用前景

大量的研究表明，miRNA控制一些重要的病理生理過程，如細胞增殖、黏附、凋亡和血管生成。miRNA深度測序的最新發(fā)展已經(jīng)改變了miRNA的身份，特別是那些有潛在診斷或預(yù)后價值的miRNA[35]。

病毒利用miRNA調(diào)節(jié)自身和宿主細胞的基因表達，因此利用反義寡核苷酸對抗病毒miRNA或宿主細胞miRNA，可以作為抗病毒的治療策略。miRNA干擾途徑可以通過合成與pri-miRNA、pre-miRNA或成熟miRNA分子完全互補的抗miRNA反義寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides, AMO)分子來實現(xiàn)。目前最有效的AMO為與成熟miRNA分子完全互補的AMO分子[36]。Iannaccone等[37]研究表明抗miRNA物質(zhì)和miRNA類似物對感染、炎性反應(yīng)和惡性疾病中異常miRNA的調(diào)節(jié)有望成為相應(yīng)疾病有效的治療措施。

miRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是治療病毒感染性疾病的一個很有發(fā)展?jié)摿Φ氖侄巍５莔iRNA作為基因治療方法要應(yīng)用于臨床治療，仍有很多技術(shù)問題需要解決。例如一些miRNA的識別靶點因其二級結(jié)構(gòu)或高度褶疊而被遮蓋，一些mRNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而隱藏了其miRNA序列的識別位點，還有如何準(zhǔn)確地將miRNA投送入感染細胞中等[38]。

[ 1 ] 沈圣，屈彥純，張軍.下一代測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的重要應(yīng)用及進展[J].遺傳，2014,36(3)：256-275.

[ 2 ] Dai R, Ahmed SA. MicroRNA, a new paradigm for understanding immunoregulation, inflammation, and autoimmune diseases[J]. Translat Res, 2011, 157(4):163-179.

[ 3 ] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. TheC.elegansheterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[ 4 ] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science, 2001,294(5354): 853-858.

[ 5 ] Lu LF, Liston A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system[J]. Immunology, 2009, 127(3):291-298.

[ 6 ] 夏偉,曹國軍,邵寧生.MicroRNA靶基因的尋找及鑒定方法研究進展[J].中國科學(xué)(C輯：生命科學(xué))，2009 ，39(1): 121-128.

[ 7 ] 趙玉磊，蘇曉紅. 宿主microRNA調(diào)節(jié)細菌感染免疫應(yīng)答的研究進展[J].國際免疫學(xué)雜志，2013,36(3)：182-186.

[ 8 ] Levy MM, Fink MP, Marshall JC, et al.2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference[J]．Crit Care Med,2003,31(4):1250-1256.

[ 9 ] Tang BM, Eslick GD, Craig JC, et al. Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients: systematic review and meta-analysis[J]．Lancet Infect Dis,2007,7(3):210-217.

[10] Wang JF, Yu ML, Yu G ,et al．Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010, 394(1):184-188.

[11] Vasilescu C, Rossi S, Shimizu M, et al. MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis[J]. PLoS One, 2009,4(10):e7405.

[12] 李智鑫. 淺談miRNA與膿毒癥[J]. 內(nèi)科急危重癥雜志,2013,19(2):116-118.

[13] Wang L, Wang HC, Chen C, et al. Differential expression of plasma miR-146a in sepsis patients compared with non-sepsis-SIRS patients[J].Exp Ther Med, 2013,5(4):1101-1104.

[14] Wang JF, Yu ML, Yu G, et al. Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 394(1):184-188.

[15] Wu SC, Yang JC, Rau CS, et al. Profiling circulating microRNA expression in experimental sepsis using cecal ligation and puncture[J]. PLoS one, 2013, 8(10):e77936.

[16] Wang H, Zhang P, Chen W, et al. Serum microRNA signatures identified by Solexa sequencing predict sepsis patients’ mortality: a prospective observational study[J]. PLoS ONE, 2012, 7(6):e38885.

[17] Wang HJ, Wang BZ, Zhang PJ, et al. Identification of four novel serum protein biomarkers in sepsis patients encoded by target genes of sepsis-related miRNAs[J]. Clin Sci, 2014, 126(12): 857-867.

[18] Roderburg C, Luedde M, Cardenas D, et al. Circulating microRNA-150 serum levels predict survival in patients with critical illness and sepsis[J].PLoS one, 2013, 8(1):e54612.

[19] Singh PK, Singh AV, Chauhan DS. Current understanding on micro RNAs and its regulation in response toMycobacterialinfections[J]. J Biomed Sci, 2013, 20:14.

[20] Wu J, Lu C, Diao N, et al. Analysis of microRNA expression profiling identifies miR-155 and miR-155*as potential diagnostic markers for active tuberculosis: a preliminary study[J]. Human Immunol, 2012, 73(1):31-37.

[21] Wiwanitkit S, Wiwanitkit V. MicroRNA from tuberculosis RNA: A bioinformatics study[J]. J Thorac Dis, 2012, 4(3):296-297.

[22] Zhang X, Guo J, Fan S, et al. Screening and identification of six serum microRNAs as novel potential combination biomarkers for pulmonary tuberculosis diagnosis[J]. PLoS one, 2013, 8(12):e81076.

[23] Qi Y, Cui L, Ge Y, et al. Altered serum microRNAs as biomarkers for the early diagnosis of pulmonary tuberculosis infection[J]. BMC Infect Dis, 2012, 12:384.

[24] Singh Y, Kaul V, Mehra A, et al.Mycobacteriumtuberculosiscontrols microRNA-99b (miR-99b) expression in infected murine dendritic cells to modulate host immunity[J]. J Biolog Chem,2013, 288(7): 5056-5061.

[25] Spinelli SV, Diaz A, D′Attilio L, et al. Altered microRNA expression levels in mononuclear cells of patients with pulmonary and pleural tuberculosis and their relation with components of the immune response[J]. Mol Immunol, 2013, 53(3):265-269.

[26] 劉守江,張帆,魏巍,等. 外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染者中的表達[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(22):36-38.

[27] Fu Y, Yi Z, Wu X, et al. Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(12):4246-4251.

[28] Yi Z, Fu Y, Ji R, et al. Altered microRNA signatures in sputum of patients with active pulmonary tuberculosis[J]. PLoS one, 2012, 7(8):e43184.

[29] Bihrer V, Friedrich-Rust M, Kronenberger B,et al.Serum miR-122 as a biomarker of necroinflammation in patients with chronic hepatitis C virus infection[J].Am J Gastroenterol,2011,106(9):1663-1669.

[30] Li LM, Hu ZB, Zhou ZX,et al.Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma[J].Cancer Res,2010,70(23):9798-9807.

[31] Thounaojam MC, Kaushik DK, Basu A. MicroRNAs in the brain: it′s regulatory role in neuroinflammation[J]. Mol Neurobiol, 2013, 47(3):1034-1044.

[32] Provost P. MicroRNAs as a molecular basis for mental retardation,Alzheimer′s and prion diseases[J]. Brain Res, 2010, 1338: 58-66.

[33] 景花，宋沁馨，周國華.MicroRNA定量檢測方法的研究進展[J].遺傳,2010, 32(1)：31-40.

[34] Reid G，Kirschner MB，van Zandwijk N． Circulating microRNAs: association with disease and potential use as biomarkers[J]． Crit Rev Oncol Hematol，2011，80(2) : 193-208．

[35] Ma Y, Vilanova D, Atalar K, et al. Genome-wide sequencing of cellular microRNAs identifies a combinatorial expression signature diagnostic of sepsis[J]. PLoS one, 2013, 8(10):e75918.

[36] 馬永潔，周吉吉，王升啟. 靶向微小RNA的病毒感染疾病治療新策略[J]. 國際藥學(xué)研究雜志, 2009, 36(2):86-89.

[37] Iannaccone M, Dorhoi A, Kaufmann SHE. Host-directed therapy of tuberculosis: what is in it for microRNA?[J]. Expert Opin Ther Targets, 2014, 18(5):491-494.

[38] 孫靜,劉勇,郝彥玲,等. MicroRNA與病毒感染的新進展[J].國際病毒學(xué)雜志，2008,15(4)：111-114.

Research update of microRNA as a marker of infectious diseases

LIU Bing, ZHANG Zhixiao, LIU Gang

. (Department of Infectious Diseases, Children′s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院感染科，北京 100045。

劉冰(1991—)，男，首都醫(yī)科大學(xué)2009級七年制臨床醫(yī)學(xué)(兒科方向)學(xué)生。

劉鋼，E-mail：liugang10@hotmail.com。

R51

A

1009-7708(2015)04-0391-04

2014-07-23

2014-09-22