李春明 （內(nèi)蒙古錫林浩特市錫盟畜牧工作站 026000）

精子分離技術(shù)及在牛性別控制中的應(yīng)用

李春明 （內(nèi)蒙古錫林浩特市錫盟畜牧工作站 026000）

自人類馴化動物開始，人們就有控制動物后裔性別的愿望。無數(shù)的民間偏方被流傳數(shù)千年，而首次成功只是大約30年前的事情，即從牛附植前胚胎組織采集細(xì)胞做核型分析，鑒定性別。近10年隨著應(yīng)用PCR技術(shù)的特效方法的發(fā)展，使快速和準(zhǔn)確鑒定胚胎性別成為可能。但是，采取胚胎性別鑒定的路線要丟棄不希望性別的胚胎。另外，它還需要實施胚胎移植操作。然而，受精前的精子性別分離可克服這些不足。由于X精于和Y精子客觀存在的物理、化學(xué)和免疫上的差異，引起許多研究者嘗試去分離它們，但直到高分辨率的精子分揀技術(shù)問世前，并未取得明顯進(jìn)展。因而，精子性別分離技術(shù)的最新成果，提供了一個準(zhǔn)確、高效和較少浪費的后裔性別先決的方法。

1 公牛精子流動分揀技術(shù)

依據(jù)DNA含量不同的精子流動分揀技術(shù)預(yù)選牛的性別，提供了一個預(yù)先決定犢牛性別的方法，其準(zhǔn)確率為85～95%。這項性別分離技術(shù)采用細(xì)胞分揀儀，其工作原理是依據(jù)精子的DNA含量分離精子。帶X染色體的精子，所含DNA比帶Y染色體的精子約多4%。DNA含量的測定是用一種結(jié)合DNA的特異染料二苯并咪唑?qū)Σ杉孽r精做活體染色。在精子與這種染料共培養(yǎng)1h后，當(dāng)被染色的精子暴露在短波長光的激光束下時，發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。被二苯并咪唑著色的X精子比Y精子發(fā)出較強的熒光，因為它的DNA含量較高。被染色的X精子和Y精子發(fā)出的熒光信號能被光電倍增管準(zhǔn)確地檢測到。當(dāng)排成一列縱隊而行的精子通過光電倍增管前時，它們發(fā)出的熒光信號被定量檢測和經(jīng)過計算機處理，可使大部分精子 （不是所有的）的DNA含量得到準(zhǔn)確測量。只有位于適宜的方向時，精子的DNA含量才能被儀器準(zhǔn)確測量，并且這個測定只是在含有精子的液流流出分揀儀的噴口時才發(fā)生。噴口自身以非常高的頻率震動，以約l/90000s的速率形成一個微滴。這些含有精子的微滴具正電荷或負(fù)電荷，依檢測儀得到的DNA含量信息而異。在沒有精子時、多于一個精子或精子的DNA含量不能被準(zhǔn)確地檢測時，微滴不具電荷。死精子用另一種不透過膜的染料染色，從活的精子中分離出來，作為廢物棄掉。這個用于精子性別分離的流動細(xì)胞分揀系統(tǒng)就是著名的SX MoFlo。具正電荷或負(fù)電荷的含有精子的微滴被沖有與精子相反電荷的黃銅板吸引而發(fā)生偏轉(zhuǎn)。

這些含有X精子或Y精子、沒有精子或多于一個精子的液滴流經(jīng)噴口，被收集于3個不同的容器中。這項分揀技術(shù)能使性別分離和收集的精子達(dá)40%，精子約以100km/h的速度通過分揀儀，處理精子的速率為20000個/s（以總精子數(shù)計）。這樣，每秒可同時分揀4000個兩性別的精子，因而能以每小時 （10-13）×106的速率生產(chǎn)各性別活精子，準(zhǔn)確率達(dá) 85～95%。

經(jīng)分離的精子，按授精劑量 （通常少于未經(jīng)篩選分離的精液）包裝，再用于人工授精。從Seidel（1999）的試驗來看，這種分離技術(shù)分離出的精子人工授精所獲得的懷孕率（懷孕率稍低，但無統(tǒng)計上的差異）、出生率及隨后的生長發(fā)育與對照組獲得的相似。

2 分離精子在畜牧上的應(yīng)用

英國的Cogent公司是世界上第一家利用分離精子技術(shù)投入生產(chǎn)的公司。2000年7月，在英國皇家農(nóng)業(yè)博覽會上，Cogent公司正式宣布為其下屬的牧場提供奶牛分離精子的服務(wù)。Cogent擁有10臺流動細(xì)胞分揀儀，全天24h運轉(zhuǎn)，該公司分離X精子和Y精子的日產(chǎn)量為24億個。直至2002年，該公司已在其屬下的162個農(nóng)場進(jìn)行了2000頭牛的人工授精。分離精子市場處于供不應(yīng)求的狀況，只能滿足其下屬的牧場。

除美國和英國外，世界上目前擁有流動細(xì)胞分揀儀的國家還有瑞士、日本、澳大利亞、德國、阿根廷等，但這些國家尚處于研究或者中試階段。

盡管目前最科學(xué)有效的分離精子的方法是流動細(xì)胞分揀儀分離法，而且分離X精子和Y精子的速度也在不斷提高。但是，要大量地應(yīng)用于牛的人工授精，分離速度還是顯得較慢。因此，如何進(jìn)一步提高分離速度是今后研究的重要課題。分離精子受精后的懷孕率亦需進(jìn)一步提高。