戴 力，王學(xué)華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙　410128）

禾谷類花粉培養(yǎng)的生物學(xué)基礎(chǔ)研究進(jìn)展

戴 力，王學(xué)華*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128）

從植物生理代謝的角度總結(jié)禾谷類花粉培養(yǎng)中一系列過程的生理代謝機(jī)制，同時探討了小孢子脫分化和愈傷組織形成、分化及轉(zhuǎn)化等幾個關(guān)鍵過程的生理學(xué)或細(xì)胞學(xué)機(jī)制。對該領(lǐng)域當(dāng)前面臨的問題和未來發(fā)展的方向進(jìn)行了總結(jié)和展望。

禾谷類作物；花粉培養(yǎng)；脫分化；愈傷組織；生理生化機(jī)制

由于在育種實踐和基因工程操作等方面存在巨大優(yōu)勢，植物花藥、游離花粉（小孢子）培養(yǎng)獲得單倍體植株的技術(shù)自20世紀(jì)六七十年代開始備受關(guān)注。特別是在當(dāng)今追求高效的商業(yè)化育種中，其快速純合、大大縮短育種周期以及選擇效率高的重要特性便顯得尤為突出。游離花粉培養(yǎng)可生產(chǎn)大量單倍體（Haploid）和加倍單倍體（Doubled Haploid，DH群體），進(jìn)一步獲得純系，為外源基因的導(dǎo)入提供良好的受體；而DH群體又可為形態(tài)發(fā)生學(xué)、遺傳學(xué)和發(fā)育分子生物學(xué)等基礎(chǔ)研究提供遺傳背景多樣且穩(wěn)定的材料。除此之外，花粉培養(yǎng)還可作為細(xì)胞的分裂誘導(dǎo)和全能性、花粉發(fā)育途徑轉(zhuǎn)換及其調(diào)控等研究的理想實驗體系［1，2］，促進(jìn)這些方面理論研究的發(fā)展。因此，花粉培養(yǎng)理論與技術(shù)研究非常必要。

就其本質(zhì)而言，花粉培養(yǎng)其實就是特殊（單倍體）單細(xì)胞的培養(yǎng)，是具有一定分化程度的單倍體花粉細(xì)胞經(jīng)過脫分化和再分化形成完整的單倍體花粉植株的過程。它相對于花藥培養(yǎng)技術(shù)來說，具有不可替代的優(yōu)勢［3，4］。因此，盡管花粉培養(yǎng)比花藥培養(yǎng)的技術(shù)難度更大，然而近年來人們對它的研究卻并沒有減少?；ǚ奂?xì)胞脫分化和再分化的實質(zhì)就是基因在一定環(huán)境條件下的選擇性表達(dá)，即細(xì)胞全能性的表現(xiàn)。這從理論上說明各種基因型的花粉細(xì)胞在一定的內(nèi)外條件下都能夠通過花粉培養(yǎng)得到花粉植株。當(dāng)前實踐中仍有較多植物或品種未培養(yǎng)獲得花粉植株或者誘導(dǎo)率很低，其可能的原因是還未找到與其基因型相配套的最適培養(yǎng)條件。對于不同作物或同一作物不同品種的花粉，其培養(yǎng)條件的適宜性可能主要取決于花粉本身及在培養(yǎng)過程中的遺傳和生理生化特性。其中，生理生化特性既是遺傳與表型之間的重要紐帶，又對實踐性研究與生產(chǎn)具有重要的理論指導(dǎo)作用。研究花粉培養(yǎng)的生理生化機(jī)制，首先要了解其生物學(xué)基礎(chǔ)。

禾谷類作物作為全球主要的糧食作物，隨著世界人口的增長和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨耕地面積減少、全球氣候變化等挑戰(zhàn)，對其進(jìn)行特異性的遺傳改良與育種并加快優(yōu)良品種育成速度愈發(fā)重要。游離花粉培養(yǎng)技術(shù)是達(dá)到這一目的的一條重要途徑。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來國內(nèi)外在該培養(yǎng)技術(shù)方面的研究取得了較大進(jìn)步。為此，筆者擬綜述水稻、玉米、小麥、大麥等主要禾谷類作物花粉培養(yǎng)的生物學(xué)基礎(chǔ)及其過程中的生理生化和遺傳機(jī)制，以期有助于禾谷類作物花粉培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

1　花粉細(xì)胞的類型及發(fā)育途徑

在高等植物花器官中，花粉母細(xì)胞經(jīng)兩次減數(shù)分裂后形成小孢子（microspore），再分裂形成生殖細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞后即為雄配子體。在花粉培養(yǎng)中通常將小孢子和雄配子體統(tǒng)稱為花粉（pollen）。根據(jù)花粉細(xì)胞中核數(shù)目的多少可將其發(fā)育過程依次分為:單核早期、中期和晚期及第一次核有絲分裂期、雙核期、第二次有絲分裂期和花粉成熟期等幾個階段。小孢子有廣義和狹義之分。狹義的小孢子包括四分體解體到第一次核有絲分裂時期的細(xì)胞，廣義的小孢子包括雙核期的花粉，即通?；ǚ叟囵B(yǎng)中所說的小孢子［5］。

王志武等［6］研究發(fā)現(xiàn)，大麥小孢子群體中存在有活力和無活力（衰?。┬℃咦庸泊娴默F(xiàn)象，被稱為花粉二態(tài)性或二型性（Pollen dimorphism）。這兩類小孢子最早出現(xiàn)于單核中晚期（ML）；區(qū)別較明顯:前者直徑隨發(fā)育推進(jìn)而漸增，在普通光源下，呈現(xiàn)出直徑大、細(xì)胞質(zhì)豐富和外形近圓形；后者從單核晚期到成熟期之間細(xì)胞大小增長十分緩慢，直徑明顯小于前者，胞質(zhì)缺乏，染色較淺，外壁皺縮。Ming T Chang于1989年在玉米中也進(jìn)行了類似的報導(dǎo)。二態(tài)性現(xiàn)象很好地解釋了密度梯度離心處理對小孢子離體培養(yǎng)的重要作用——對新取材的或經(jīng)一定前處理后的花粉進(jìn)行離心純化，可以提高活力小孢子在接種小孢子中的比例，從而提高花粉培養(yǎng)的效率和遺傳轉(zhuǎn)化率。

根據(jù)花粉發(fā)育途徑的不同或在離體培養(yǎng)中分裂能力的有無，活力小孢子可分為胚性和非胚性兩種。小孢子的發(fā)育可塑性很大，可因內(nèi)在生理及外界環(huán)境的變化而朝不同方向發(fā)育?？偟膩碚f，共有三種可能發(fā)育途徑［7］:①（雄）配子體發(fā)育途徑。小孢子發(fā)育的一般途徑——發(fā)展得到雄配子體，此類小孢子在離體培養(yǎng)中不能分裂形成多細(xì)胞花粉（multicellular pollen），通常培養(yǎng)一段時間后便退化死亡，因此被稱為非胚性花粉。②孢子體發(fā)育途徑。又稱“雄核發(fā)育途徑”，發(fā)育形成再生單倍性孢子體植株。這類小孢子因能在培養(yǎng)中分裂形成多細(xì)胞花粉并進(jìn)一步分裂分化出單倍體植株而被稱為胚性花粉。③雌配子體發(fā)育途徑。小孢子發(fā)育出類似雌配子的構(gòu)造，轉(zhuǎn)換為雌性配子體的途徑，這種途徑只在極其少見的特殊情況下出現(xiàn)，因此常被忽略。胚性小孢子較非胚性小孢子體積增大，具有中央大液泡和清晰的細(xì)胞質(zhì)［8］，在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)無細(xì)胞器區(qū)域，淀粉粒和脂質(zhì)體數(shù)量和大小急劇下降，且核糖體和細(xì)胞器總量下降［9，10］；表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)脫分化程度增大，有研究者稱之為細(xì)胞質(zhì)重組，并認(rèn)為它與胚胎誘導(dǎo)潛力有關(guān)［11］。

Clément等［10］報道認(rèn)為，小孢子早在減數(shù)分裂期便已開始發(fā)生細(xì)胞質(zhì)重組。在真核細(xì)胞中，已知的可引起細(xì)胞質(zhì)重組的路徑有兩種:泛素-26S蛋白酶系統(tǒng)——短命和長命分子退化的主要細(xì)胞途徑；細(xì)胞的自我吞噬作用——細(xì)胞器通過溶酶體降解和再生的主要細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。盡管這些都是發(fā)育調(diào)節(jié)途徑，但當(dāng)受到脅迫時也能被激活，比如饑餓、熱處理和低溫等。減數(shù)分裂期間的自我吞噬作用造成了整個細(xì)胞生理學(xué)狀態(tài)的不穩(wěn)定，這可能將賦予小孢子在預(yù)處理期間伴隨外界刺激轉(zhuǎn)換到孢子體發(fā)育途徑的能力［10］。如何依據(jù)兩組小孢子——活力小孢子與非活力小孢子、胚性小孢子和非胚性小孢子——在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)及發(fā)育學(xué)等方面的特征差異，發(fā)現(xiàn)和發(fā)明出能夠高效快捷地將之彼此篩選分離的指標(biāo)和方法，以提高活力和胚性小孢子在外植體小孢子中所占的比率，進(jìn)一步增大胚胎誘導(dǎo)率，還有待于更多的研究去探索。

花粉培養(yǎng)即通過人工培養(yǎng)使花粉經(jīng)孢子體途徑獲得單倍體再生器官或植株，用于基礎(chǔ)科學(xué)研究和育種實踐。孢子體發(fā)育分為兩個階段［7］。

第一階段，小孢子經(jīng)過幾次有絲分裂后形成多核花粉（或多細(xì)胞花粉）。根據(jù)啟動雄核發(fā)育時的細(xì)胞分裂方式不同，該階段又有4種主要的發(fā)育途徑［3］:①A-V途徑。單核小孢子進(jìn)行不均等分裂，得到大小不等的兩個細(xì)胞，之后大細(xì)胞持續(xù)分裂，最終發(fā)育為單倍體植株，即營養(yǎng)細(xì)胞；而小細(xì)胞停止分裂或分裂一兩次后退化，即生殖細(xì)胞。這種發(fā)育方式在高等植物中較為常見，如大麥、小麥和黑小麥等的雄核發(fā)育均依此進(jìn)行。②A-G途徑。單核小孢子不均等分裂，所得的生殖細(xì)胞保持不斷分裂，最終發(fā)育成為單倍體植株，而營養(yǎng)細(xì)胞停止分裂或僅分裂到有限程度即退化。此方式較為少見。以上二者統(tǒng)稱“不等分裂途徑”。③B途徑。亦稱“均等分裂途徑”。此途徑中小孢子進(jìn)行均等分裂，得到的營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞大小相同，且二者繼續(xù)同時分裂共同形成單倍體植株。甘藍(lán)型油菜的雄核發(fā)育便依此方式發(fā)生。④C途徑。小孢子營養(yǎng)核與生殖核不獨立分裂，而在同一紡錘體上同時分裂與融合，產(chǎn)生二倍體或非單倍體胚。此外，還有一些小孢子通過重復(fù)游離核分裂而進(jìn)行發(fā)育，但游離核的前途如何尚不清楚。

第二階段，多核花粉繼續(xù)分裂分化發(fā)育成為單倍體植株。根據(jù)發(fā)育方式不同，此階段又有兩種可能的發(fā)育途徑——胚狀體途徑（如曼陀羅）和器官發(fā)生途徑（先形成愈傷組織，再分化產(chǎn)生根、芽和完整植株，如水稻）。研究發(fā)現(xiàn)［12］，正確有效的人為調(diào)控可使兩途徑相互轉(zhuǎn)變，特別是外源激素的調(diào)控，作用明顯。同時二者各有特點:器官發(fā)生途徑易發(fā)生染色體變異，但其中自行發(fā)生的染色體增倍過程能夠使得二倍純合子植株大量形成，從而省去了人工使用秋水仙素誘導(dǎo)加倍的過程，而且二倍體幼苗生活能力強(qiáng)，更容易成活；胚狀體途徑細(xì)胞較穩(wěn)定，變異較少。因此，人們多希望誘導(dǎo)獲得胚狀體。至于禾谷類植物，常傾向于以器官發(fā)生的途徑再生植株。

孢子體途徑為何會存在？對此，鮮有討論。Horner與Mott于1980年報道，煙草單倍體植株是由非典型小孢子產(chǎn)生，此類小孢子易重復(fù)分裂——即僅某些特殊小孢子亞群才有可能誘發(fā)孤雄生殖，而正常小孢子可能不行。Heberle-Bors在1985年報道，用能引起植株雄性不育的殺雄劑和殺配子劑（乙烯利、生長素和抗赤霉素化合物）處理供體植株會增加胚性花粉量。離體培養(yǎng)的胚性花粉有可能就是在生長過程中因各種自然或人為因素而發(fā)生雄性不育的花粉。當(dāng)然，這個觀點有待于直接的試驗驗證。同時，花培時對供體植株及外植體進(jìn)行一定逆境處理（如低溫、高溫、高滲透壓等），可提高花粉植株誘導(dǎo)率，即可促進(jìn)孢子體途徑表達(dá)?；ǚ坻咦芋w發(fā)育很有可能是極少部分特異小孢子在一定外界環(huán)境的刺激下而發(fā)生的一種適應(yīng)性表達(dá)，即當(dāng)受到一定環(huán)境條件的影響時小孢子不能通過正常的配子體途徑延續(xù)后代，傳遞遺傳物質(zhì)，此時便改變內(nèi)部生理、結(jié)構(gòu)和遺傳機(jī)制，選擇通過孢子體途徑努力延續(xù)自身遺傳基因。這種適應(yīng)性表達(dá)在離體和非離體條件下均能發(fā)生，其表現(xiàn)被發(fā)現(xiàn)與否取決于是否遇上適宜繼續(xù)生長發(fā)育的條件。非離體條件下特異小孢子可能受到體細(xì)胞或其他正常小孢子的干擾難以進(jìn)一步生長發(fā)育而退化。

另外，王憲曾［13］和加藤幸雄等［14］報道，花粉細(xì)胞中內(nèi)含物豐富，主要包括植物激素、糖類和脂類、維他命類及氨基酸等等?；ǚ壑械挠坞x氨基酸含量與花粉的育性、分類及生長緊密聯(lián)系?；ǚ鄣幕瘜W(xué)組成和貯藏物的種類及數(shù)量同時受到基因型和環(huán)境因素的影響，即其存在基因型差異。對于碳水化合物和脂類，甚至存在植株間差異。這可能與局部環(huán)境差異有關(guān)，如玉米花粉中淀粉含量在品種之間存在著12%～30%的差異；在弱光下，成熟花粉的碳水化合物含量變少［14］。據(jù)王兆龍1998年報道，同一玉米雄穗花序上，小穗中第1穎花較第2穎花發(fā)育及物質(zhì)累積要早且快，開花時花藥鮮、干重均略高。王志武等［6］在大麥中也發(fā)現(xiàn)，同一時期內(nèi)同一穗中可能擁有3～4種處于不同發(fā)育階段的花粉，其中中間小穗的花粉發(fā)育較兩邊的要早。還有研究報道，不同花粉細(xì)胞中滲透壓大小也不同［15］，這可能與化學(xué)成分及其數(shù)量不同有關(guān)?；ǚ哿５某鋵嵆潭纫部赡芘c花粉植物胚狀體的誘導(dǎo)有直接關(guān)系。饑餓作用中小孢子內(nèi)的糖類代謝似乎可以佐證?？磥?，因少淀粉或無淀粉而引起的花粉敗育（包括典敗、圓敗和染敗）可能是一種天然的饑餓作用，會造成不育花粉分解自身內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)和組成結(jié)構(gòu)以存活。伴隨著花粉中的營養(yǎng)成分和結(jié)構(gòu)物質(zhì)分解，一些處在雙核中期的花粉細(xì)胞進(jìn)入孢子體發(fā)育途徑［16］。只是沒有外部營養(yǎng)供應(yīng)時，發(fā)生了發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變的小孢子便會死亡。因此，不育花粉是否更易誘導(dǎo)單雄生殖，值得進(jìn)一步研究證明。

H6：品牌創(chuàng)新能力對新疆農(nóng)產(chǎn)品品牌競爭力有正向影響，即新疆農(nóng)業(yè)發(fā)展的技術(shù)創(chuàng)新能力、管理創(chuàng)新能力、形象創(chuàng)新能力越強(qiáng)，新疆農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域品牌競爭力越強(qiáng)。

綜上所述可見，對于相同品種的不同個體，同一個體（花序）上的不同小穗，乃至同一小穗中的不同花藥，可能由于局部生長環(huán)境、植株花期和物質(zhì)分配的不同造成其化學(xué)組成、營養(yǎng)條件及細(xì)胞滲透勢等的不同，從而進(jìn)一步導(dǎo)致其花粉群體內(nèi)個體生理狀態(tài)、細(xì)胞周期及發(fā)育狀況的差異。特定品種花粉進(jìn)入孢子體發(fā)育途徑的自身條件與外界條件要求在理論上應(yīng)是一定的。因此，這便造成同一批花粉內(nèi)部不同個體間誘導(dǎo)結(jié)果的差異。在進(jìn)行實驗取材時，除了選擇合適發(fā)育時期的花粉，還要特別注意花粉來源部位的適宜性和統(tǒng)一性，最好將供體材料培養(yǎng)于可控的人工氣候室中，以便調(diào)控并盡量統(tǒng)一供體植株的生長環(huán)境，以產(chǎn)生一定規(guī)模的同質(zhì)花粉群體供培養(yǎng)。

以此觀之，外植體預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)能夠在一定程度上提高花粉培養(yǎng)的誘導(dǎo)率的現(xiàn)象似乎也預(yù)示著同一品種花粉異質(zhì)性的可同化性，即通過一定的調(diào)控處理，使得處于不同發(fā)育時期不同營養(yǎng)狀態(tài)和內(nèi)源激素水平的花粉細(xì)胞達(dá)到相同或相近的狀態(tài)。Hu和Kasha 1999年研究發(fā)現(xiàn)，小孢子在預(yù)處理期間經(jīng)歷的脅迫處理造成了一種細(xì)胞分裂周期的整體協(xié)調(diào)。孟金陵［4］也認(rèn)為，高溫可以使小孢子發(fā)育同步化，增加處于發(fā)育周期中誘導(dǎo)敏感階段的小孢子數(shù)。這頗類似于作物生產(chǎn)中種子引發(fā)時生理狀態(tài)（如損傷程度、發(fā)芽活力等）不同的種子粒之間的同步化過程，而其目的是為了達(dá)到齊苗壯苗的效果。因此，花粉細(xì)胞異質(zhì)性的同化調(diào)控處理方法成為提高花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)率的一個可能的重要突破口。

2　花粉培養(yǎng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)及生理機(jī)制

花粉離體培養(yǎng)是人工誘導(dǎo)小孢子發(fā)育途徑發(fā)生轉(zhuǎn)變，由配子體途徑轉(zhuǎn)向孢子體途徑，并為發(fā)育轉(zhuǎn)變后的小孢子提供一定的繼續(xù)生長發(fā)育的條件，使之通過器官再生或胚狀體途徑形成完整的單倍體或加倍單倍體植株的過程。其中，發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變即花粉細(xì)胞脫分化過程和繼續(xù)生長發(fā)育條件是花粉培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。對于小孢子的脫分化，有人認(rèn)為其只需離體條件即可發(fā)生，也有人認(rèn)為其需要一定的特殊條件誘導(dǎo)，如各種預(yù)處理和外源激素作用。脫分化后的小孢子一部分會停止增殖或生長分裂到一定程度后停止生長而死亡，只有少部分通過四種可能的發(fā)育途徑（A-V、A-G、B或C途徑）繼續(xù)分裂增殖，形成多核花粉，隨后再進(jìn)一步生長發(fā)育成胚狀體或愈傷組織；生成的愈傷組織中有一部分能夠繼續(xù)生長分化為完整的植株，這一部分稱為胚性愈傷組織，另外一部分生長會發(fā)生停滯，無法獲得植株，則被稱為非胚性愈傷組織。不過，在一定的條件下兩種愈傷組織之間可以相互轉(zhuǎn)換。因此，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與調(diào)控是花粉培養(yǎng)的另一個關(guān)鍵，重點在于提供合適的激素、碳源、氮源以及培養(yǎng)環(huán)境等繼續(xù)生長發(fā)育條件。

從分子水平上看，花粉脫分化的實質(zhì)就是一定內(nèi)外條件下細(xì)胞分裂周期調(diào)控基因的選擇性表達(dá)，是受到細(xì)胞內(nèi)外信號刺激的成熟細(xì)胞在細(xì)胞分裂周期調(diào)控基因的指導(dǎo)下由細(xì)胞分裂停止?fàn)顟B(tài)重新進(jìn)入分裂周期的現(xiàn)象。細(xì)胞分裂周期分為G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。G1期為特別重要的周期調(diào)節(jié)階段，因為在這一階段中，大部分細(xì)胞面臨要么持續(xù)分裂，要么退出細(xì)胞周期的局面。在生長條件差或存在來自其他細(xì)胞的抑制信號的情況下，細(xì)胞有可能在G1期暫停更長的時間，甚至可能進(jìn)入到長期的非分裂狀態(tài)（G0期）。由G0期重新回到G1期是花粉細(xì)胞脫分化的重要標(biāo)志。

負(fù)責(zé)細(xì)胞周期事件的大量蛋白裝置于細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的嚴(yán)密控制下，此系統(tǒng)的核心成分是一群被稱為周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent Kinnses，CdK）的酶家族。CdKs催化來自 ATP的磷酸基團(tuán)共價結(jié)合到蛋白底物上，即發(fā)生磷酸化，使得底物的酶活性或與其他蛋白的相互作用發(fā)生改變。CdK活性隨細(xì)胞周期進(jìn)程上升或下降，使細(xì)胞周期裝置組分的磷酸化水平發(fā)生周期性變化，從而啟動細(xì)胞周期事件［17］。

關(guān)于雄配子體的正常形成途徑，Borg等［18］對雄性生殖細(xì)胞系特化及其保持的作用模式進(jìn)行了設(shè)想:PMI（減數(shù)第一次分裂）階段的不對稱分裂形成了兩個在形態(tài)和發(fā)育命運(yùn)上完全不同的子代細(xì)胞（生殖細(xì)胞與營養(yǎng)細(xì)胞）。細(xì)胞質(zhì)分裂保證了子代細(xì)胞中不同細(xì)胞命運(yùn)決定子的分配。PMI階段后，在生殖細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞分裂周期抑制因子KRP6和KRP7。FBL17在生殖細(xì)胞中的短暫表達(dá)使這些細(xì)胞分裂周期抑制因子（KRP6／7）降解，從而激活CDKA，生殖細(xì)胞進(jìn)入S期。一旦完成S期，激活的G2／M期調(diào)節(jié)因子即與CDKA活性偶聯(lián)（G2／M期調(diào)節(jié)因子激活依賴于DUO1），從而促進(jìn)生殖細(xì)胞通過G2／M期的控制點進(jìn)行有絲分裂，在有關(guān)因子的作用下發(fā)育成精細(xì)胞。營養(yǎng)細(xì)胞不表達(dá)FBL17，因此其CDKA活性被持續(xù)高表達(dá)水平的KRP6／7所抑制而無法進(jìn)入細(xì)胞分裂周期［19］。據(jù)此可以推測，大麥、小麥等禾谷類作物孢子體發(fā)育途徑中的A-V途徑可能與FBL17或其類似基因在營養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)和在生殖細(xì)胞中的受抑制有關(guān)。

禾谷類花粉小孢子細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期實現(xiàn)脫分化后，細(xì)胞不斷有絲分裂，通常形成愈傷組織，一定誘導(dǎo)條件下也能形成胚狀體。培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的愈傷組織多種多樣，對于其分類也有較多不同的意見，通常將其分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織兩種:非胚性愈傷組織呈白色，質(zhì)地松軟，粘稠或水漬狀，無繼代和分化能力；胚性愈傷組織呈鮮黃色、質(zhì)地致密、松脆、呈易分散小顆粒狀、表面干燥、繼代和分化能力強(qiáng)［20］。不同植物的愈傷組織，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有著很大的不同。對于禾谷類植物而言，色澤鮮黃或乳白、質(zhì)地致密、表面光滑且凹凸不平的愈傷組織（易以器官發(fā)生的方式實現(xiàn)植株再生）和結(jié)構(gòu)松脆、顆粒狀的愈傷組織（易以體胚發(fā)生的方式實現(xiàn)植株再生），都屬于質(zhì)量好的愈傷組織［12］。王海波［12］認(rèn)為，愈傷組織培養(yǎng)其實是一種細(xì)胞類型多樣性的衍生體系，愈傷組織的類型由組成愈傷組織的主要細(xì)胞領(lǐng)導(dǎo)類型決定，并且在一定的條件誘導(dǎo)調(diào)控下，不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞可以相互轉(zhuǎn)變，即胚性與非胚性愈傷組織之間可以通過調(diào)控相互轉(zhuǎn)化；其調(diào)控因子按應(yīng)該優(yōu)先考慮的順序依次為:培養(yǎng)基激素、N源（類型及用量）、無機(jī)離子（如K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO24-和PO34-等）、維生素、C源和滲透壓。一般情況下，只要把握好激素和N源的使用就可達(dá)到很好的調(diào)控效果；其中生長素和還原態(tài)N主要是使細(xì)胞進(jìn)入或保持在亢進(jìn)狀態(tài)，它們能夠促進(jìn)生物合成和細(xì)胞分裂、促使細(xì)胞壁松弛和膜透性發(fā)生改變等，從而愈傷組織不斷生長而不利于進(jìn)一步分化出根、芽等器官；細(xì)胞分裂素和硝態(tài)氮主要是使細(xì)胞進(jìn)入或穩(wěn)定在保守狀態(tài)，多表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生或強(qiáng)化某些功能、促使細(xì)胞間產(chǎn)生分工、促進(jìn)某些生命活動所需物質(zhì)的合成和產(chǎn)生代謝物等，促進(jìn)愈傷組織分化。另外，物理因素也可作為調(diào)控因子，如光照、低溫可作為保守因子，熱激等可列為衰敗因子（造成愈傷組織衰敗死亡）。離體培養(yǎng)的核心就是“細(xì)胞狀態(tài)調(diào)控”。“細(xì)胞狀態(tài)”是由遺傳、生理、化學(xué)、物理、組成、結(jié)構(gòu)等因素控制或影響的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、潛能的綜合反映［12］。細(xì)胞狀態(tài)決定愈傷組織的質(zhì)量，決定培養(yǎng)的效果和結(jié)果。成功的細(xì)胞和組織培養(yǎng)是以獲得理想的愈傷組織狀態(tài)為目標(biāo)，協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)外的各種因素，使之達(dá)到理想的組合與配合。

3　問題與展望

隨著近年來國內(nèi)外生物技術(shù)的不斷發(fā)展，禾谷類作物花粉培養(yǎng)的研究不論是在基礎(chǔ)理論還是在實踐應(yīng)用上都取得了較大的進(jìn)步，但是仍然還有較多問題需要探討。

（1）植物中孢子體發(fā)育途徑存在的生物學(xué)意義是什么？孢子體途徑是否是植物在特殊情況下的一種遺傳物質(zhì)傳遞和種群延續(xù)的特殊機(jī)制？對于這個問題的探討有利于從進(jìn)化學(xué)上更進(jìn)一步地了解認(rèn)識花粉培養(yǎng)過程。

（2）脅迫處理對于胚性小孢子來說是起到篩選純化作用還是誘導(dǎo)創(chuàng)造作用？當(dāng)前的研究只是說明其能夠增加小孢子胚胎的誘導(dǎo)效率，而其對胚性小孢子的具體作用仍不是很清楚。有可能是通過殺死非胚性小孢子而相對增加胚性小孢子在總外植體中的比例，也有可能是使得非胚性小孢子發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝孕℃咦?，增加胚性小孢子的?shù)量。這需要更深入的研究去探明。

（3）脅迫處理后小孢子的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)變化的信息還比較少，還不足以支持一個關(guān)于預(yù)處理后小孢子行為的全面的觀點［10］。該問題的存在一方面是由于預(yù)處理和試驗品種的多樣性造成的，另一方面則是因為研究工作的相對缺乏所致。

（4）脫分化和多細(xì)胞花粉結(jié)構(gòu)的形成（主要是細(xì)胞壁的形成）哪個才是花粉胚誘導(dǎo)的關(guān)鍵決定因子？當(dāng)前兩方面的論述都比較多，或者說兩者都是比較重要的。對于這個問題的探討，有利于在實踐中更具針對性地去采取措施提高花培誘導(dǎo)率。

（5）花粉的不育性與花粉的單雄生殖反應(yīng)能力之間是否存在著一定的關(guān)系？如果真如前面推測所說——花粉的不育性也許是一種天然的饑餓作用，不育花粉細(xì)胞是一種具有較好誘導(dǎo)條件和較強(qiáng)誘導(dǎo)潛力細(xì)胞，那么依此將禾谷類作物普遍存在且研究較深入透徹的不育系引入花培體系，對于其培養(yǎng)材料來源就是一個很大的突破，既利于增大培養(yǎng)規(guī)模，又利于提高培養(yǎng)效率。

另外，小孢子重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期的基因調(diào)控機(jī)制，小孢子重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期與體細(xì)胞相比是否存在著一定的特異性等，還有待于進(jìn)一步研究。對于小孢子離體培養(yǎng)的遺傳調(diào)控機(jī)制研究，除了細(xì)胞分裂周期的基因調(diào)控機(jī)制之外，研究比較多的還有各種谷類花粉培養(yǎng)能力的遺傳模式［21，22］和小孢子胚胎誘導(dǎo)過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分子機(jī)制［23～25］，如小孢子脅迫前處理、花粉脫分化、發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變以及白化苗的形成分子機(jī)制等；其中涉及到的基因種類眾多，包括形態(tài)特征、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞壁變化、細(xì)胞保護(hù)、防御和毒性及脅迫反應(yīng)、新陳代謝、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、蛋白質(zhì)降解、質(zhì)體發(fā)育以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因。然而由于缺乏系統(tǒng)有效的歸納總結(jié)，這部分理論研究成果還較難用于指導(dǎo)花培實踐。因此對這些繁雜的分子機(jī)制研究成果進(jìn)行總結(jié)歸納，使基礎(chǔ)理論進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為應(yīng)用技術(shù)也非常重要。

［1］ 陸瑞菊，孫月芳，王亦菲，等.提高大麥游離小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的研究［J］.大麥科學(xué)，2004（2）:14-16.

［2］ 董 靜，鄔飛波，張國平.麥類作物小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.麥類作物學(xué)報，2005，25（2）:102-106.

［3］ Razdan MK（印度）.植物組織培養(yǎng)導(dǎo)論（第2版）［M］.肖尊安，祝揚(yáng)譯.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［4］ 孟金陵.植物生殖遺傳學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，1997.368-406.

［5］ 王俊麗.細(xì)胞工程原理與技術(shù)［M］.北京:中央民族大學(xué)出版社，2006.

［6］ 王志武，鞏東營，潘月勝，等.大麥小孢子原位發(fā)育過程中二態(tài)性現(xiàn)象的研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）:7-9.

［7］ 楊弘遠(yuǎn).植物生殖尋幽探密［M］.北京:科學(xué)出版社，2009.103-108.

［8］ Maraschin SF，Lamers GEM，de Pater BS，et al.14-3-3 isoforms and pattern formation during barley microspore embryogenesis［J］.Journal of Experimental Botany，2003，51，1033-1043.

［9］ Maraschin SF，Vennik M，Lamers GEM，et al.Timelapse tracking of barley androgenesis reveals positiondetermined cell death within pro-embryos［J］.Planta，2005，220:531-540.

［10］Clément C，Rajbir SS，Brigitte SN.Microspore embryo induction and development in higher plants:cytological and ultrastructural aspects［A］.／／Palmer CE，Keller WA， Kasha KJ.Bio-technology in Agriculture and Forestry，Vol.56 Haploids in Crop Improvement II［C］.Berlin Heidelberg:Springer-Verlag，2005.

［11］Maraschin SF，de Priester W，Spaink HP，et al.Androgenic switch:an example of plant embryogenesis from the male gametophyte perspective［J］.Journal of Experimental Botany，2005，56:1711-1726.

［12］王海波.愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生［A］.／／孫敬三，朱至清.植物細(xì)胞工程實驗技術(shù)［C］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.15-65.

［13］王憲曾.解讀花粉［M］.北京:北京大學(xué)出版社，2005.9.

［14］加藤幸雄，志佐誠（日）.植物生殖生理學(xué)［M］.周永春，劉瑞征譯.北京:科學(xué)出版社，1987.

［15］刑小黑.禾谷類作物游離花粉培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)通報，1995，12（增刊）:21-24.

［16］滕海濤，魯守平，趙邦青，等.植物花藥培養(yǎng)預(yù)處理及其生理生化變化規(guī)律［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（10）:46-49，59.

［17］摩爾根DO（英）.細(xì)胞周期調(diào)控原理［M］.李朝軍，潘飛燕，戴谷譯.北京:科學(xué)出版社，2010.

［18］Borg M，Brownfield L，Twell D.Male gametophyte development:a molecular perspective［J］.J Exp Bot，2009，60:1465-1478.

［19］黃學(xué)林.植物發(fā)育生物學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2012.

［20］夏燕莉.玉米愈傷組織分化的遺傳分析及相關(guān)基因克隆［D］.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［21］孫海鵬，路鐵剛，孫敬三.大麥雄核發(fā)育的基因型效應(yīng)及相關(guān)的RAPD標(biāo)記［J］.植物學(xué)報，2000，42（7）: 736-740.

［22］孫 娜，石培春，魏凌基，等.小黑麥花藥培養(yǎng)力的遺傳模式分析［J］.麥類作物學(xué)報，2009，29（3）:374-379.

［23］Mu?oz-Amatriaín M，Svensson JT，Castillo AM，et al. Expression profiles in barley microspore embryogenesis［A］.In:Touraev A，F(xiàn)orster BP，Jain SM.Advances in Haploid Productionin Higher Plants［C］.Springer，2009:127-134.

［24］Mu?oz-Amatriaín M，Svensson JT，Castillo AM，et al. Microspore embryogenesis:assignment of genes to embroy formation and green vs.albino plant production［J］. Funct Integr Genomics，2009（9）:311-323

［25］Sánchez-Díaz RA，Castillo AM，Vallés MP.Microspore embryogenesis in wheat:new markers genes for early，middle and late stages of embryo development［J］.Plant Reprod.2013，doi:10.1007／s00497-013-0225-8.

Research Progress on the Biological Basis of Cereal Pollen Culture

DAILi，WANG Xue-Hua*
（College of Agronomy，Hunan Agriculture University，Changsha，，Hunan 410128，China）

From the angle of plant physiological metabolism，the physiological and metabolic mechanism of series of process in the cerealmicrospore culture are summarized，at the same time，the physiological or cytologymechanism of several key process is discussed in this paper，such asmicrospore dedifferentiation and callus formation，differentiation and transformation，etc.And the current problems we are facing in this field and the direction of future development is summarized and prospected.

cereal crops；microspore culture；de-differentation；callus；physiological and biochem icalmachanism

Q943.1

A

1001-5280（2015）06-0672-06

10.3969／j.issn.1001-5280.2015.06.25

2015-04-03

戴 力（1992-），男，湖南隆回人，碩士研究生，Email:1436156290＠qq.com。*通信作者:王學(xué)華，博士，教授，從事作物栽培與耕作學(xué)研究，Email:wxh6011＠163.com。