孫 雨，馬世春，時建忠，魏 巍，董 浩，徐 一，蘇增華，池麗娟，馬繼紅，王曉英

（中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

專論與綜述

牛副結(jié)核病的流行病學(xué)特征與實驗室診斷技術(shù)研究進展

孫 雨，馬世春，時建忠，魏 巍，董 浩，徐 一，蘇增華，池麗娟，馬繼紅，王曉英

（中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

牛副結(jié)核?。╞ovine paratuberculosis）是由副結(jié)核分支桿菌引起的以牛慢性增生性、頑固性腸炎和進行性消瘦為特征的人畜共患傳染病。其臨床癥狀與病理變化是頑固性腹瀉、漸進性消瘦、慢性肉芽腫回腸炎，腸粘膜增厚并形成皺褶。除常規(guī)的臨床診斷外，牛副結(jié)核病的確診依賴于實驗室診斷方法，主要有病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等方法。牛副結(jié)核病給畜牧業(yè)造成很大的損失。由于本病潛伏期長，傳播快，加之人工培養(yǎng)副結(jié)核分枝桿菌難度又高，因此加強對該病的病原學(xué)、流行病學(xué)特征的認識，加快實驗室診斷方法的研究對其綜合防控工作具有十分重要的意義。作者主要介紹了目前國內(nèi)外牛副結(jié)核病流行病學(xué)特征和診斷方法的研究進展，并比較了各種方法的優(yōu)點和缺點，為牛副結(jié)核病的臨床快速診斷和深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

牛副結(jié)核病；流行病學(xué)；實驗室診斷

牛副結(jié)核病（bovine paratuberculosis）是由副結(jié)核分支桿菌引起的以牛慢性增生性、頑固性腸炎和進行性消瘦為特征的人畜共患傳染?。?］。牛副結(jié)核病又稱副結(jié)核性腸炎或Johne病，主要臨床癥狀和病理變化是頑固性腹瀉、漸進性消瘦、慢性肉芽腫回腸炎，腸粘膜增厚并形成皺褶。人類的副結(jié)核病又稱為克羅恩?。–rohn’s disease），是由食用被該菌污染的牛奶或奶制品而造成的人過敏性腸道癥狀、潰瘍性腸炎［2］?？肆_恩病是人慢性炎癥性腸道疾病，其特征為腸道組織發(fā)生廣泛性炎癥反應(yīng)與肉芽腫。由于本病潛伏期長，特征性癥狀不明顯，人工培養(yǎng)分離難度較大，一旦發(fā)病在整個牛群傳播速度較快、危害較大，動物發(fā)病后會給地方畜牧業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失［3］。副結(jié)核病嚴(yán)重危害了人民群眾的身體健康和生命安全，影響社會與經(jīng)濟的發(fā)展。因此，加強對該病的病原學(xué)、流行病學(xué)特征的認識，加快實驗室診斷方法的研究對其綜合防控工作具有十分重要的意義。

1　病原特征

1.1病原分類

副結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium paratuberculosis，MP）在分類上屬于分枝桿菌屬。近年來的研究結(jié)果表明，該菌與禽分支桿菌有較多的相似性，變態(tài)反應(yīng)也與禽分支桿菌有明顯的交叉性［4］。

1.2病原的基本特征

副結(jié)核分枝桿菌為短桿菌，是一種細長桿菌，有的呈短棒狀，有的呈球桿狀，常呈縱排列，無鞭毛，無運動力，不形成莢膜和芽孢，革蘭氏染色為陽性，抗酸染色為陽性。本菌為需氧菌，最適生長溫度為37.5℃，最適pH值為6.8～7.2。該菌生長緩慢、原代分離極為困難，需在培養(yǎng)基中添加草分支桿菌素抽提物，一般需要6～8周才能發(fā)現(xiàn)小菌落［5］。

2　流行病學(xué)特征

2.1傳染來源

病畜和帶菌畜是主要傳染源，反芻動物對副結(jié)核分枝桿菌易感，其中奶牛最易感。牛奶或奶制品是人類副結(jié)核病的主要感染源，其次是被副結(jié)核分枝桿菌污染的環(huán)境、水源等［6］。人與人的直接接觸傳播尚未見報道。

2.2傳播途徑

主要傳播途徑是動物采食污染的飼料和飲水，消化道是最常見的感染途徑，也可通過精液和胎盤傳播。最易感時期是出生后3個月的哺乳期，犢牛因攝取成年牛糞便污染的奶或飲水而感染。一般感染后3～6年不發(fā)病，而成為隱性感染［7］。

2.3易感動物

該病的自然宿主為反芻動物，如牛、綿羊、山羊、鹿及駱駝對本菌易感，且多見于母牛，尤其是在妊娠以及泌乳期的母牛最易感［8］。馬、水牛、豬等也有自然感染的報道；實驗動物，如家兔、豚鼠、大鼠、小鼠、雞等小型實驗動物都可以用來進行副結(jié)核感染研究。但鼠類實驗動物最為易感，特別是BALB/c、C57/B6、SCID系鼠類［9］。

2.4流行特征

本病無明顯的季節(jié)性，但常發(fā)生于春秋兩季。潛伏期長，可達6～12個月或更長，主要呈散發(fā)，有時呈地方流行性。在青黃不接、草料供應(yīng)不上、羊只體質(zhì)不良時發(fā)病率上升。轉(zhuǎn)入青草期，病羊癥狀減輕，病情見好轉(zhuǎn)［10］。副結(jié)核病廣泛流行于世界各國。養(yǎng)牛業(yè)較為發(fā)達的國家，例如美國、英國、德國、加拿大、澳大利亞、意大利、丹麥等國受害嚴(yán)重。我國遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、貴州、陜西、河北等地區(qū)也有發(fā)生過本病的報道，幾乎遍及了東北、西北、華北大部分地區(qū)。近年來由于奶牛和肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展非常迅速，生產(chǎn)規(guī)模越來越大，集約化程度越來越高，牛流動范圍也越來越廣，副結(jié)核發(fā)病也呈上升趨勢［11］。

2.5對牛的致病性

幼齡期牛易感染副結(jié)核，尤其在1月齡內(nèi)最易感染。動物發(fā)病緩慢，有反復(fù)加重和緩解的過程，腹痛輕重不一。發(fā)病時臨床表現(xiàn)為漸進性消瘦，周期性、頑固性下痢，下痢呈噴射狀、惡臭、糞便中?；煊忻撀涞哪c粘膜和血液。牛在發(fā)病后期極度消瘦，有時可見到下頜和腹下水腫，最后衰竭而死［12］。

3　實驗室診斷技術(shù)

3.1細菌學(xué)檢測

該法為活體定性方法，并且為目前世界上認可推薦使用的方法。其具體操作步驟：取病牛直腸病變部位組織的刮取物或糞便放入蒸餾水中混勻，離心后取沉淀物用萋-尼氏抗酸染色顯微鏡下觀察。如果是陽性病料，顯微鏡下可見紅色球桿狀成團的細菌。該方法的缺點是由于糞便或者直腸刮取物中含有其他抗酸菌，所以容易干擾副結(jié)核分枝桿菌的檢測［13］。

3.2皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)診斷（PPD試驗）

副結(jié)核的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)診斷主要使用提純的副結(jié)核菌素對動物進行皮內(nèi)注射，一般使用劑量為0.1 mL，作用72 h后仔細觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測量皮皺厚度，作好詳細記錄。對疑似反應(yīng)牛應(yīng)立即在另一側(cè)以同一批PPD同一劑量進行第二次皮內(nèi)注射，再經(jīng)72 h觀察反應(yīng)結(jié)果。對陽性牛和疑似反應(yīng)牛，于注射后96 h和120 h再分別觀察一次，以防個別牛出現(xiàn)較晚的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。一般的判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性反應(yīng)局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于4.0 mm；疑似反應(yīng)的判定為局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于2.0 mm、小于4.0 mm；陰性反應(yīng)的判定為無炎性反應(yīng)，皮厚差在2.0 mm以下。本方法能檢測出副結(jié)核感染前期的大部分發(fā)病動物，對于感染中后期以及處于耐受期的動物敏感性不強或者不出現(xiàn)反應(yīng)狀態(tài)。另外其他一些分枝桿菌，如禽型結(jié)核分枝桿菌、鳥胞內(nèi)分枝桿菌可以干擾副結(jié)核分枝桿菌的檢測［14］。

3.3補體結(jié)合試驗（CFT）

補體結(jié)合試驗方法為檢測本病最早的方法，并且是國際上常用的一種經(jīng)典檢測方法，它的優(yōu)點與PPD檢測方法一樣可用于動物感染前期的抗體檢測。缺點是容易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，并存在一些非特異性的反應(yīng)，操作程序復(fù)雜，不適用于血清樣品的大規(guī)模檢測［15］。

3.4γ-干擾素ELISA檢測方法

動物感染副結(jié)核分枝桿菌后的前期并不產(chǎn)生抗體，只有在臨床癥狀階段才產(chǎn)生抗體，所以使用血清學(xué)方法不能準(zhǔn)確地鑒定動物是否患有副結(jié)核病。γ-干擾素ELISA檢測方法則可以用于檢測副結(jié)核病的亞臨床感染狀態(tài)。γ-干擾素ELISA檢測方法的原理是動物感染病原后，循環(huán)淋巴細胞對病原致敏，致敏后的淋巴細胞遇到副結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌抗原后會在體外模擬遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)后，致敏的淋巴細胞會釋放出γ-干擾素［16］。γ-干擾素是可以用于ELISA方法進行檢測的，并且檢測的含量與副結(jié)核分枝桿菌的含量呈正相關(guān)性。該方法的優(yōu)點是特異性強、敏感性好，可用于檢測動物的亞臨床感染狀態(tài)；缺點是采集的動物血清必須經(jīng)過前期刺激抗原的致敏處理，操作過程較為繁瑣［17］。

3.5酶聯(lián)免疫吸附實驗方法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附實驗方法是近幾年研究學(xué)者們比較關(guān)注的一個方法，并有可能取代PPD試驗與CFT試驗，用于樣品的大規(guī)模初篩檢測［18］。目前使用的ELISA方法大多為直接ELISA方法，其優(yōu)點是快速、簡便、可用于大規(guī)模定性檢測。但由于其敏感性較差，所以一般定量檢測還需要CFT試驗與γ-干擾素檢測方法輔助進行［19-21］。

3.6膠體金檢測技術(shù)

該方法是膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，檢測動物副結(jié)核病IgG1抗體的銀加強膠體金技術(shù)。用本法檢測動物血清中抗副結(jié)核分枝桿菌IgG1抗體的可信度高，并且具有敏感、特異、簡易、經(jīng)濟和適用于現(xiàn)場推廣應(yīng)用等優(yōu)點，作為一種新的血清學(xué)診斷方法具有較強的推廣價值［22］。

3.7RNA探針檢測方法

RNA探針方法以其較高的特異性而廣泛用于目前動物疫病檢測中。rRNA的一些基因存在于所有的副結(jié)核分枝桿菌中具有高度的同源性，檢測時有明顯的交叉反應(yīng)，而某些基因具有明顯的種屬特異性。利用具有特異性的rRNA標(biāo)記成rRNA探針就是檢測副結(jié)核分枝桿菌的基礎(chǔ)［23］。該方法的優(yōu)點是特異性好，結(jié)果較為可靠。

3.8聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）也逐步用于動物疫病病原的檢測工作中。在副結(jié)核分枝桿菌的檢測過程中，目前的研究熱點是細菌的插入序列IS900［15］。IS900由1 451個堿基組成，G+C的含量為66%，具有明顯的特異性［4，24］。利用IS900的某些片段標(biāo)記為DNA探針，結(jié)合套式PCR技術(shù)可以特異性的檢測出動物糞便中的細菌［25］。目前國外對這方面技術(shù)的研究，尤其是如何消除假陽性和假陰性因素的研究有了很全面的介紹。由于副結(jié)核分枝桿菌為無細胞壁的細菌，所以分離培養(yǎng)十分困難，一般常規(guī)培養(yǎng)細菌需要6周以上的時間且步驟十分繁瑣，而使用PCR技術(shù)檢測細菌只需要幾個小時，能夠快速、敏感、特異地檢出病料中的細菌，對于副結(jié)核病的控制具有十分重要的應(yīng)用價值，是目前診斷副結(jié)核病的理想方法［26］。由于PCR方法比其他方法具有更高的檢出效率，并且克服了其他常規(guī)方法耗時、敏感性不強等缺點，有望成為檢測副結(jié)核病的一種實用而可靠的手段［27-28］。

4　防治措施

4.1綜合性防治措施

因病牛往往在感染后期才出現(xiàn)癥狀，因此用藥物治療的實際意義較小。預(yù)防本病主要是加強飼養(yǎng)管理，尤其要注意幼年牛的營養(yǎng)補充以便增強抵抗力。如從疫區(qū)引進牛只則必須進行健康檢查才能混群。對曾有過病牛的假定健康牛群，隨時做好觀察、定期進行臨床檢查，對所有牛只每隔3個月做一次變態(tài)反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)為陰性的牛方可調(diào)出，連續(xù)3次檢查為陰性的牛可視為健康牛。對變態(tài)反應(yīng)和臨床癥狀明顯的排菌牛，應(yīng)隔離分批撲殺。被污染的牛舍、欄桿、飼槽、用具、繩索、運動場要用生石灰、來蘇兒、氫氧化鈉、漂白粉、石碳酸等消毒液進行噴霧、浸泡或沖洗，糞便應(yīng)堆積高溫發(fā)酵后作肥料［29］。

4.2疫苗免疫接種

歐美一些副結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家由于流行面廣、感染率高，承受不了檢出撲殺的巨大經(jīng)濟損失。這些國家通過長期的論證認為，對新生犢牛進行免疫接種、配合必要的獸醫(yī)衛(wèi)生措施是控制本病的最有效措施［30］。但因犢牛的接種免疫效果不佳以及接種牛對變態(tài)反應(yīng)呈陽性等問題，未能在世界各國推廣。副結(jié)核病是在幼齡期感染的，并存在較高的垂直傳播，因此僅靠主動免疫防止感染較為困難。在實際應(yīng)用中，副結(jié)核疫苗只是抗臨床發(fā)病，不能徹底清除排菌牛。另外接種副結(jié)核疫苗的牛對結(jié)核菌素和副結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)都呈陽性，對識別結(jié)核病牛造成困難，從而影響牛結(jié)核病的檢疫，只有幾個國家使用此方法。目前使用的疫苗有兩種，一是弱毒疫苗，一是滅活疫苗。英國及一些東歐國家一般采用弱毒活疫苗，而美國、挪威等國家使用滅活疫苗［31］。

5　公共衛(wèi)生影響

近年來由于奶牛和肉牛業(yè)發(fā)展迅速，生產(chǎn)規(guī)模逐漸擴大，集約化程度越來越高，牛的流動范圍也隨之加大，副結(jié)核發(fā)病呈上升趨勢，需要重點關(guān)注。當(dāng)前一些劣質(zhì)奶及其乳產(chǎn)品的出現(xiàn)，人類免疫抑制性疾病的發(fā)病率逐漸增高，加劇了牛副結(jié)核病的潛在危險，也使人克羅恩病的發(fā)病率增大。要更好地預(yù)防副結(jié)核病的發(fā)生需要定期檢疫、處理或隔離病牛并采取相應(yīng)的衛(wèi)生消毒措施，對具有明顯臨床癥狀的開放性病牛和細菌學(xué)檢查為陽性的病牛，要及時捕殺處理，防止細菌繼續(xù)擴散。同時要加強食品衛(wèi)生的檢疫力度，及時發(fā)現(xiàn)并淘汰劣質(zhì)牛奶，爭取將其影響控制到最小程度［32］。

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Progress in the Epidemiological Characteristics and Diagnosis Technology of Bovine Paratuberculosis

Sun Yu，Ma Shichun，Wang Xiaoying，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

Bovine paratuberculosis is a zoonosis caused by mycobacterium paratuberculosis，which was characterized by chronic hyperplastic and intractable enteritis and progressive weight loss.Clinical symptom and pathological change of the disease is intractable diarrhea，progressive weight loss，chronic granulomatous ileitis，intestinal mucosal thickening and the formation of wrinkles.Diagnosis methods of paratuberculosis include clinical symptoms，while a final diagnos is depended on laboratory diagnostic methods，such as etiological diagnosis，serological diagnosis and molecular biological diagnosis.It results in considerable economic losses to the stock farming.Because of the long latence，easy transmissibility and the limitations of culture，so strengthening of the awareness of disease etiology and epidemiology is very important to comprehensive prevention measures of paratuberculosis.The author mainly introduced the research progress on pathogen，epidemiology and diagnosis technology of paratuberculosis.In addition，the advantages and disadvantages of various mothods were compared，in order to provide scientific basis for a further study and rapid diagnosis of paratuberculosis.

bovine paratuberculosis；epidemiology；laboratory diagnosis

S858.23

A

2095-3887（2015）02-0044-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.014

2015-02-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201403052）

孫雨（1983－），男，獸醫(yī)師，博士。

王曉英（1963－），女，研究員。研究方向：動物疫病預(yù)防控制。