苗 燕 王宏峰 郝玉慶.鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南鄭州 45005；.四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 6004

不同消毒方法對(duì)變形鏈球菌在牙本質(zhì)片上黏附的影響

苗 燕1王宏峰1郝玉慶2
1.鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南鄭州 450052；2.四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041

目的比較3種消毒方法對(duì)變形鏈球菌（S.mutans）在人牙本質(zhì)片上黏附的影響，為牙體標(biāo)本消毒提供參考。方法制備人牙本質(zhì)片60個(gè)，隨機(jī)均分為3組，每組20個(gè)，采用不同的方法消毒。第1組：高壓蒸汽滅菌30 min；第2組：10%福爾馬林溶液浸泡1周；第3組：3%過(guò)氧乙酸溶液浸泡1周。將不同消毒方法的牙本質(zhì)片與S.mutans進(jìn)行體外黏附實(shí)驗(yàn)，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察牙本質(zhì)片表面形態(tài)變化及S.mutans黏附量多少，并采用菌落形成單位計(jì)數(shù)法（CFU）計(jì)數(shù)S.mutans在不同消毒方法的牙本質(zhì)表面的黏附量，用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 不同消毒方法的牙本質(zhì)片在電子顯微鏡下表面形態(tài)無(wú)明顯變化，SEM顯示S.mutans在三組牙本質(zhì)片上黏附變化比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.21，P＞0.05），CFU顯示S.mutans培養(yǎng)后3組黏附差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.29，P＞0.05）。結(jié)論3種消毒方法對(duì)體外研究細(xì)菌黏附于牙本質(zhì)片影響甚微，目前高壓蒸汽滅菌法簡(jiǎn)單、可靠、易于操作，應(yīng)作為消毒方法的首選。

變形鏈球菌；黏附；消毒；牙本質(zhì)片

齲病是發(fā)生于牙體硬組織，多因素影響下以細(xì)菌感染為主的慢性感染性疾病，齲病的始動(dòng)因子是細(xì)菌在牙面黏附、定植，分泌酸性物質(zhì)導(dǎo)致無(wú)機(jī)物脫礦及有機(jī)物崩解[1]。變形鏈球菌（Streptococci mutans，S.mutans）是致齲菌中的優(yōu)勢(shì)菌，與齲病的關(guān)系最為密切[2]。在口腔醫(yī)學(xué)科研及實(shí)驗(yàn)教學(xué)等模擬口腔的體外黏附實(shí)驗(yàn)中，常利用S.mutans與人或牛的離體牙及羥基磷灰石片等來(lái)研究細(xì)菌黏附力的大小。在仿生模擬操作中，離體牙的形態(tài)、質(zhì)地及解剖形態(tài)是其他模擬材料所無(wú)法替代的[3]。但實(shí)驗(yàn)中的離體牙來(lái)源于口腔，自身帶有大量的病原微生物，因此在實(shí)驗(yàn)前對(duì)其消毒就很有必要[4]。因?yàn)檫@不僅可以保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可信穩(wěn)定可靠，而且對(duì)于操作者的安全也至關(guān)重要。但目前普遍的醫(yī)學(xué)工作者及臨床實(shí)習(xí)學(xué)生對(duì)離體牙消毒知識(shí)知之甚少[5]。目前離體牙的消毒主要是高壓蒸汽滅菌法、福爾馬林、戊二醛及過(guò)氧乙酸等化學(xué)液體消毒法等，但牙片的不同消毒方法對(duì)細(xì)菌的黏附有無(wú)影響目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)S.mutans在不同消毒方法的牙本質(zhì)片上黏附能力進(jìn)行研究，以期為牙體標(biāo)本消毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基及設(shè)備

S.mutans ATCC25175（血清型C），由口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)）提供。腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基（Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，England）；比濁儀（Becton Dickinson and Company，USA）；掃描電鏡（SEM）（Hitachi S-2460 N，Tokyo，Japan）；Melag-24型高壓蒸汽滅菌器（Melag，德國(guó)）；10%福爾馬林消毒液（湖北興銀河化工有限公司）；3%過(guò)氧乙酸（源樂(lè)，江西鍵寶醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人牙本質(zhì)片的制備、分組及消毒 收集四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院2008年3～4月因正畸需要而拔除的上頜第一前磨牙，取牙體完整無(wú)齲壞且根尖孔完全閉合的30顆牙齒，去盡牙齒表面的血污及牙周軟組織，生理鹽水反復(fù)沖洗后自然晾干。操作者戴醫(yī)用橡膠手套用慢速手機(jī)在持續(xù)噴水的狀態(tài)下于釉牙骨質(zhì)界處截?cái)嘌栏Ａ粞拦?。將牙冠包埋并固定于其特制的底座中，在精密切削機(jī)上用特制的金鋼砂片在注水的條件下以500 r/min的低速削去牙冠釉質(zhì)層，再按牙體長(zhǎng)軸方向?qū)⒔韺拥难辣举|(zhì)切削成5 mm×5 mm×0.5 mm的牙本質(zhì)薄片，選取60片形態(tài)較好，切面平整的牙本質(zhì)片隨機(jī)分成3組，每組20片，分別采用不同的方法進(jìn)行消毒。第1組：采用高壓蒸汽滅菌法，121℃滅菌，時(shí)間為30 min；第2組：10%福爾馬林溶液浸泡1周；第3組：3%過(guò)氧乙酸溶液浸泡1周。第2組和第3組消毒后的離體牙用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)蕩洗去除殘留消毒液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液準(zhǔn)備 復(fù)蘇S.mutans菌株，接種于BHI血瓊脂平板上，37℃，80%N2、10%CO2、10%H2培養(yǎng)S.mutans 24 h，涂片鏡檢為純培養(yǎng)后，再接種于液體BHI液體培養(yǎng)基，生長(zhǎng)時(shí)間同上，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化試驗(yàn)鑒定為純培養(yǎng)物，收集菌細(xì)胞，用BHI液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度為1×108cfu/mL備用。

1.2.3 細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn) 將3組不同消毒方法的牙本質(zhì)片各20個(gè)分別置于1 mL預(yù)先配制的菌液中，并加入8 mL的BHI培養(yǎng)基，37℃上述環(huán)境培養(yǎng)S.mutans 1 h后，每組分別取出10個(gè)，用無(wú)菌PBS液清洗牙本質(zhì)片表面非附著菌塊，然后進(jìn)行掃描電子顯微鏡標(biāo)本制作。3組各剩下的10個(gè)牙本質(zhì)用無(wú)菌PBS液清洗非附著細(xì)菌后置于5 mL生理鹽水的塑料離心管中，在超聲水浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）中以100 r/min振蕩2 min，洗滌液進(jìn)行10倍系列稀釋為1×104cfu/mL后用微量取樣槍選擇能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的最佳稀釋度樣液10 μL滴于BHI血瓊脂平板表面，均勻涂布開(kāi)后厭氧培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌落形成單位計(jì)數(shù)，每個(gè)牙本質(zhì)片涂布3個(gè)平板，取其平均值為菌落形成單位計(jì)數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)換算成單位面積牙本質(zhì)片上的菌落形成單位。

1.2.4 掃描電鏡標(biāo)本制作 牙本質(zhì)片室溫干燥，2.5%戊二醛固定2 h，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每個(gè)梯度脫水10 min，液態(tài)CO臨界點(diǎn)干燥，鍍金，SEM下觀察S.mutans在牙本質(zhì)片上的黏附差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)表面形態(tài)和細(xì)菌黏附情況

SEM觀察見(jiàn)三組牙本質(zhì)表面平整，形態(tài)清晰無(wú)破壞，牙本質(zhì)小管直徑相近。在牙本質(zhì)表面或牙本質(zhì)小管內(nèi)壁黏附有S.mutans。見(jiàn)圖1。3種不同消毒方法的牙本質(zhì)片掃描電鏡下隨機(jī)各選取10塊10 μm×10 μm面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，結(jié)果顯示三組S.mutans黏附量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.21，P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 三組細(xì)菌在牙本質(zhì)片上黏附后培養(yǎng)定量測(cè)定

結(jié)果顯示：S.mutans在3種不同消毒方法的牙本質(zhì)片上黏附差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=3.29，P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

S.mutans是目前公認(rèn)的口腔致齲菌，致齲機(jī)制主要是通過(guò)其菌毛表面分布的大量大分子類物質(zhì)，如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（GTF）、脂磷壁酸（LTA）、表面蛋白等，黏附定植于牙面形成牙菌斑，在牙菌斑內(nèi)發(fā)揮致齲作用，使牙齒脫礦，形成齲損。除非通過(guò)口腔衛(wèi)生措施將黏附的牙菌斑徹底清除，否則它將長(zhǎng)期聚集于牙面并導(dǎo)致齲病和（或）牙周疾病。因此S.mutans在齲病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6]，所以本實(shí)驗(yàn)選擇S.mutans作為實(shí)驗(yàn)用菌。

目前在模擬口腔的黏附實(shí)驗(yàn)中，常用的底物多選擇羥基磷灰石和離體牙，雖然羥基磷灰石粉或片形態(tài)均一，易于消毒，但在質(zhì)地、形態(tài)及仿生效果方面均不及離體牙。但離體牙來(lái)源于臨床患者口腔，拔除過(guò)程中常帶有大量的病原微生物，研究表明在離體牙的牙髓，根管及根尖可能存在大量的血源性病原體如：人類免疫缺陷病毒（HIV），乙肝病毒（HBV），丙肝病毒（HCV）及一些細(xì)菌性病原體[7]，在離體牙收集及將其磨切成牙本質(zhì)片的操作過(guò)程中，往往是在無(wú)冷卻液的環(huán)境下進(jìn)行，因此病原微生物可通過(guò)受損的黏膜皮膚或以水汽霧的形式等污染操作者，因此只有對(duì)離體牙進(jìn)行有效的消毒才能及時(shí)去除感染源，切斷傳播途徑，才能保證操作者的安全[8-9]。牙片消毒的方法很多，最常用的是高壓蒸汽滅菌法，其他還有化學(xué)熱力滅菌，微波輻射滅菌[10-11]，液體消毒有2%堿性戊二醛溶液、3%過(guò)氧化氫溶液、過(guò)氧乙酸溶液、5.25%次氯酸鈉溶液，醋及煮沸消毒法，氣體消毒有環(huán)氧乙烷等，但牙片經(jīng)不同消毒方法處理后S.mutans在上面的黏附有無(wú)差異目前鮮有報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)中采用常見(jiàn)的3種消毒方法：高壓蒸汽滅菌法、福爾馬林溶液及過(guò)氧乙酸溶液對(duì)牙本質(zhì)片進(jìn)行不同濃度不同時(shí)間的消毒，然后通過(guò)S.mutans體外黏附實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌在牙本質(zhì)片上黏附變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黏附牙片無(wú)論在掃描電鏡下觀察還是菌落計(jì)數(shù)法3種消毒方法的牙本質(zhì)片上黏附的S.mutans差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在本實(shí)驗(yàn)中影響細(xì)菌黏附差異主要存在于兩方面：細(xì)菌自身因素和消毒后的牙本質(zhì)表面特性。相同的S.mutans黏附量就取決于消毒后的牙本質(zhì)組成成分、硬度及表面粗糙度等[12]。為了最大限度地降低實(shí)驗(yàn)誤差，在本實(shí)驗(yàn)中所有的牙本質(zhì)片都是經(jīng)筆者親自磨切及拋光，所以黏附差異就決定于消毒后的牙本質(zhì)成分及硬度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌黏附量沒(méi)有明顯變化說(shuō)明不同消毒方法對(duì)牙本質(zhì)成分及硬度的影響變化不明顯。

消毒是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細(xì)菌芽孢的方法。滅菌是指把物體上所有的微生物（包括細(xì)菌芽孢在內(nèi)）全部殺死的方法，只有有效的消毒才能切斷疾病感染源和傳播途。在離體牙滅菌常采用的化學(xué)藥物消毒方法中，甲醛是一種無(wú)色有毒氣體，福爾馬林是甲醛在室溫下的水溶液，研究發(fā)現(xiàn)離體牙浸泡于10%的福爾馬林溶液7 d可有效達(dá)到滅菌的目的[13]，雖然福爾馬林是一種有效的滅菌劑，但同時(shí)它也具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性，操作不慎可引起皮膚和眼睛的灼傷和腐蝕，經(jīng)鼻腔吸入后可刺激上呼吸道，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)作是一種潛在的致癌物。長(zhǎng)期接觸可引起鼻咽癌和髓系白血病發(fā)病概率的增加，因此實(shí)驗(yàn)需要在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，但這既不安全也不方便實(shí)驗(yàn)的操作[14-15]。過(guò)氧乙酸溶液系廣譜、速效、高效滅菌劑，本品是一種強(qiáng)的氧化劑，可以殺滅一切微生物，對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌及芽孢均能迅速殺滅，可廣泛應(yīng)用于各種器具及環(huán)境消毒。0.2%溶液接觸物體10 min基本可達(dá)到滅菌目的。Hope等[9]發(fā)現(xiàn)離體牙浸泡于Gigasept PA（活性成分：過(guò)氧乙酸）中7 d可完全滅菌，是一種安全有效可替代福爾馬林作為離體牙消毒的方法，但Gigasept PA主要用于醫(yī)療器械的消毒，不易獲得。Tijare等[4]認(rèn)為醋作為家庭用品，容易得到，易于操作，也可達(dá)到消毒離體牙的目的，也可取代福爾馬林用于離體牙的消毒。但其他的消毒液如次氯酸鈉、過(guò)氧化氫、戊二醛等都不能達(dá)到百分百滅菌的效果。環(huán)氧乙烷低溫滅菌常實(shí)用于貴重、精密、怕熱怕濕物品的滅菌[16]，但研究發(fā)現(xiàn)[17-18]如果單純依賴環(huán)氧乙烷消毒離體牙，無(wú)論在30℃或60℃都可以檢測(cè)到孢子的存在，所以在消毒之前必須采用其他辦法消除牙齒上來(lái)自于血液中的病原菌。過(guò)量接觸環(huán)氧乙烷會(huì)引起溶血、過(guò)敏反應(yīng)、細(xì)胞突變等，離體牙上殘留的環(huán)氧乙烷會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者具有很大的危害。γ輻射消毒離體牙無(wú)高溫高壓，無(wú)氣體及化學(xué)物質(zhì)的加入，消毒后對(duì)牙齒的納米力學(xué)性能方面沒(méi)有影響，但能否達(dá)到徹底殺滅病原微生物還有待進(jìn)一步研究。

采用溶液浸泡消毒，對(duì)溶液的濃度及浸泡時(shí)間都要有嚴(yán)格的要求，本實(shí)驗(yàn)采用的溶液濃度低，浸泡時(shí)間短，不影響實(shí)驗(yàn)觀察效果，但若過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的浸泡就有可能會(huì)引起牙齒理化性質(zhì)的改變，況且浸泡消毒后牙本質(zhì)片上殘留的消毒液去除也比較麻煩，如果去除不徹底就會(huì)殺滅實(shí)驗(yàn)用菌，對(duì)細(xì)菌的黏附結(jié)果產(chǎn)生影響。高壓蒸汽滅菌是目前認(rèn)為最為有效可靠、安全且易于操作的滅菌方法，這需要121℃，至少15 min就可達(dá)到滅菌目的，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)研究或是臨床離體牙消毒操作都易于進(jìn)行，應(yīng)為首選，值得推廣[19]。但對(duì)于銀汞充填的牙齒應(yīng)避免高壓蒸汽滅菌，因?yàn)樵诟邏号艢鈺r(shí)汞蒸汽可釋放于空氣中，而引起污染，另外要避免體外實(shí)驗(yàn)中離體牙反復(fù)的高壓蒸汽消毒，因?yàn)檫@可能影響牙齒的機(jī)械性能，導(dǎo)致牙齒變脆而易折斷[20]。

在體外大量模擬口腔的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，如何選擇一種安全方便易于操作而又不影響離體牙自身特性的消毒方法，還需要我們做進(jìn)一步深入的研究。

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Influence of different sterilization on adhension of streptococci mutans to dentin slices

MIAO Yan1WANG Hongfeng1HAO Yuqing2
1.Department of Operative and Endodontics,Zhengzhou Stomatological Hospital,He'nan Province,Zhengzhou 450052, China;2.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Sichuan Province,Chengdu 610041,China

ObjectiveTo compare the influence of 3 different sterilization methods on adherence of S.mutans to dentin slices.Methods 60 dentin slices were randomly divided into three groups with 20 specimens in each group,they were given 3 different sterilization methods.The first group of detin slices was disinfected by autoclaving for 30 min;the second group was immersed in 10%formalin solution for 1 week;and the third group was immersed in 3%peracetic acid for 1 week.The quantification of attached S.mutans on the surfaces of different dentin was assayed by means of scanning electron microscope (SEM)and clone forming unit (CFU)method in vitro.Results There was no obvious change in morphology among the three groups of dentin slices under the electron microscope.The quantification of attached S.mutans was no statistically significant difference among the three groups under SEM(F=3.21,P＞0.05),and there was no statistically significant difference from CFU after bacterial culturer(F=3.29,P＞0.05).Conclusion Little effect is observed in the test of bacterial adhesion to dentin slices of different sterilization methods.So far,autoclaving is seen as the simple and reliable sterilization method.

S.mutans;Adhesion;Disinfect;Dentin slices

R187

A

1673-7210（2015）03（c）-0114-04

2014-12-15本文編輯：蘇 暢）

苗燕（1977.2-），女，河南內(nèi)鄉(xiāng)人，碩士研究生；研究方向：齲病病因及其防治。