黃 頌 邢永華 張俊伶 路 璐 李程程 李德冠 孟愛民北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192

粒細胞集落刺激因子對輻射誘導間充質(zhì)干細胞遠期損傷的作用及其基因芯片分析

黃 頌 邢永華 張俊伶 路 璐 李程程 李德冠 孟愛民
北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192

目的研究粒細胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）對輻射誘導間充質(zhì)干細胞（MSCs）遠期損傷的作用及其可能分子機制。 方法將30只SPF級C57BL/6雌性小鼠均分為對照組、6 Gy照射組、6 Gy照射+G-CSF組。獲取各組小鼠MSCs細胞后進行全基因表達基因芯片分析。對差異表達的基因進行基因本體功能分類分析，并在京都基因和基因組百科全書生物信息數(shù)據(jù)庫中進行通路富集分析。 結(jié)果經(jīng)6 Gy照射后小鼠MSCs中表達上調(diào)最顯著的20個基因中，有12個基因在6 Gy+G-CSF組小鼠MSCs中表達下調(diào)（Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2）。經(jīng)6 Gy照射后小鼠MSCs中表達下調(diào)的所有基因中，有10個基因在6 Gy+G-CSF組小鼠MSCs中的表達上調(diào)（Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm）。以上基因主要富集在細胞因子及其受體間相互作用通路、細胞凋亡及細胞周期調(diào)節(jié)通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路中。 結(jié)論 G-CSF可能對輻射誘導MSCs遠期損傷有修復作用，其分子機制可能與調(diào)節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡、促進細胞分化及促進免疫應答有關。

G-CSF；間充質(zhì)干細胞；輻射；基因芯片

間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）最早發(fā)現(xiàn)于骨髓的非造血系，是一類具有自我更新、多向分化潛能的成體干細胞。MSCs可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及基質(zhì)細胞。MSCs不僅能夠支持造血、調(diào)節(jié)免疫功能，當機體受到損傷時，MSCs還會靶向遷移至受損組織和炎性反應位點，參與機體的損傷修復過程[1]。當MSCs受到電離輻射后，其細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，ROS過量生成并在細胞內(nèi)積聚，引起氧化應激反應，導致MSCs自我更新和多向分化功能受到損傷，以致機體受損時不能及時進行修復，甚至腫瘤發(fā)生[2]。

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是臨床用于救治輻射損傷的重要造血細胞因子，具有動員骨髓和外周血中MSCs的功能，能使骨髓和外周血中MSCs的數(shù)量顯著增多[3-4]，但其作用機制尚不明確。本研究利用小鼠全基因組表達譜芯片技術對接受全身照射小鼠骨髓MSCs的基因表達進行分析，觀察輻射對受照小鼠MSCs基因表達的遠期影響以及應用G-CSF治療對受照小鼠MSCs基因表達調(diào)節(jié)作用及其可能機制提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基均購自于Gibco公司（USA）；重組人粒細胞刺激因子購自于杭州九源基因工程有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自于Thermo Scientific公司；137Csγ射線輻射源、USD Autocell40購自于加拿大原子能有限公司。

1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠30只，18～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2009-0017，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及給藥方法 實驗分為對照組、6 Gy照射組、6 Gy照射+G-CSF組，每組10只小鼠。用137Csγ射線輻射源以1 Gy/min的劑量率，對6 Gy照射組和6 Gy照射+G-CSF組小鼠進行6 min照射，以達到6 Gy的照射劑量。對三組小鼠進行灌胃給藥。對照組每只小鼠給予200 μL生理鹽水，每日兩次；6 Gy照射組每只小鼠給予200 μL生理鹽水，每日兩次；6 Gy照射+G-CSF組每只小鼠給予G-CSF藥液200 μL（1 μg G-CSF/200 μL生理鹽水），每日兩次。照射當日分別于照射后2、6 h給藥，照射后連續(xù)給藥6 d，共給藥14次。

1.3.2 小鼠間充質(zhì)干細胞的獲取 照射后2個月取材，無菌分離小鼠雙側(cè)股骨脛骨，參照文獻中的方法分離培養(yǎng)MSC細胞[5]。在37℃，5%CO2的孵箱培養(yǎng)5 d后收集各組MSC細胞。

1.3.3 RNA處理及小鼠全基因組表達譜芯片檢測MSC細胞加入Trizol后送交上?？党缮锕具M行基因芯片的操作分析。主要步驟包括：①RNA提取及濃度的檢測后，用InvitrogenTMSuperScriptR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。②使用NimbleGen One-Color DNA標記試劑盒對cDNA進行標記，然后利用NimbleGen雜交系統(tǒng)進行雜交反應。③NimbleGen Wash Buffer試劑盒洗凈后，用Axon GenePix 4000B掃描儀進行掃描。將掃描后得到的TIFF格式圖像導入NimbleScan軟件（2.5版本）進行表達數(shù)據(jù)分析。④表達數(shù)據(jù)通過NimbleGen軟件包含的四分位數(shù)標準化和Robust Multichip Average（RMA）算法進行標準化后，將所有基因水平的文件導入Agilent GeneSpring GX軟件（11.5.1版本）進行進一步分析。本研究中，以表達倍數(shù)的變化程度（≥1.5倍）確定差異表達的基因，無監(jiān)督層次聚類則利用 Agilent GeneSpring GX軟件（11.5.1版本）進行。

1.3.4 GO功能分類及通路富集分析 利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）軟件對差異表達的基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能分類分析，并依據(jù)京都基因和基因組百科全書生物信息數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物信息數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析。

2 結(jié)果

本研究采用的基因芯片為Roche NimbleGen公司的小鼠12×135K全基因組表達譜芯片，包含源于NCBI及其他權威數(shù)據(jù)來源的共約44 170個基因。研究結(jié)果顯示，6 Gy照射組小鼠的MSCs基因表達與對照組相比發(fā)生了明顯的變化，基因芯片分析有意義上調(diào)基因中差異最顯著的前 20個分別為 Vangl1、Limk1、L1cam、Cks1b、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Cks2、Mapk8、Afp、Lep、Ntn3、Ccnb1、Prickle1、Ccna2、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2。這些基因表達上調(diào)的倍數(shù)為3.16～75.91倍（圖1）。分析6 Gy照射+G-CSF組小鼠MSCs的基因芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，以上20個基因中，有12個基因在給予G-CSF后表達下調(diào)，分別為Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2。這些基因在給予G-CSF后表達下調(diào)倍數(shù)為2.06～77.94倍（圖2）。在這12個下調(diào)基因中，Vangl1、L1cam、Id1、Itgb3在6 Gy照射后+G-CSF組中的表達恢復正常（圖3）。而在6 Gy照射組與對照組小鼠MSCs基因芯片分析得出的有意義下調(diào)基因中，有10個在6 Gy照射后給予G-CSF組中表達上調(diào)，分別為 Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm（圖2）。在此10個基因中，Ccl19、Ccl21a、Tnnt2在6 Gy照射+G-CSF組中表達恢復正常（圖4）。

將上述差異表達基因利用KEGG生物信息數(shù)據(jù)庫，以DAVID軟件進行通路富集分析后結(jié)果如表1所示。

3 討論

間充質(zhì)干細胞由于具有修復多種組織損傷的功能，現(xiàn)在已成為許多研究的熱點，并被廣泛應用于臨床的細胞治療[6-7]。MSCs不僅具有易于獲取、增殖和分化能力強、適宜同種異體移植等優(yōu)勢[8]，而且還能分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子、生長因子，這些細胞因子和生長因子進一步使MSCs具有調(diào)節(jié)固有免疫應答和適應性免疫應答的能力[6，9]。另外，由于一些分子信號通路的激活使細胞因子的表達上調(diào)，因此MSCs具有向輻射誘導損傷位點靶向遷移并對其進行修復的能力[10]。MSCs具有支持骨髓造血的功能，且具有一定程度的輻射抗性，因此可修復輻射對骨髓基質(zhì)和造血微環(huán)境的損傷，有利于造血重建[11]。輻射誘導MSCs細胞周期阻滯，克隆形成能力下降，細胞內(nèi)ROS積聚增多，并導致MSCs的DNA和干性受損[2，10]。GCSF作為臨床治療輻射暴露患者的首選藥物，能夠有效地動員MSCs增殖及釋放細胞因子[12]。為了探討GCSF對輻射誘導MSCs遠期損傷的作用及其可能的分子機制，本研究采用基因芯片的方法對照射后給予G-CSF小鼠的MSCs基因的表達進行了研究。

基因芯片的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，在6 Gy照射組小鼠MSCs中表達上調(diào)最顯著的20個基因中，有12個基因其在6 Gy照射+G-CSF組小鼠MSCs中的表達下調(diào)（Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2）。另外，與正常對照組比較，在6 Gy照射組小鼠MSCs中表達下調(diào)的基因中，有10個基因其在6 Gy照射+GCSF組小鼠 MSCs中的表達上調(diào)（Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm）。這些基因在功能上主要調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，細胞增殖與代謝，細胞周期和凋亡。通過對以上差異基因進行KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在細胞因子及其受體間相互作用通路（Ccl19、Ccl21a、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、G6pc2、Ikbkg、Acaca、Oxsm）、細胞凋亡及細胞周期調(diào)節(jié)通路（Hdac2、Ccnb1、Mad1l1、Ikbkg）、PI3K-Akt信號通路（G6pc2、Igf1、Ifna6、Ikbkg、Itgb3、L1cam）、NF-κB信號通路（Ccl19、Ccl21a、Ikbkg）、p53信號通路（Ccnb1、Rrm2）中。綜合文獻報道和基因芯片的生物信息學分析結(jié)果，L1CAM可以結(jié)合到酪氨酸激酶受體（RTKs）及整合蛋白，導致細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）活化，從而促進細胞周期進程，誘導血管生成和通過激活磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路來誘導細胞凋亡[13]。MAD1L1不僅能夠促進細胞在分化過程中退出細胞周期從而抑制細胞增殖，還能誘導細胞凋亡[14]。ITGB3作為整合素家族的一員，通過PI3K通路對細胞周期、細胞凋亡、細胞存活均有調(diào)節(jié)作用[15]。ID1可以通過與堿性促黃體激素蛋白結(jié)合而抑制細胞分化[16]。當VANGL1表達受到抑制時，通過對Wnt信號通路的調(diào)節(jié)可顯著減少肝癌細胞數(shù)量并誘導肝癌細胞死亡[17]。CCNB1調(diào)節(jié)細胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)換，且在腫瘤組織中普遍高表達，作為一種細胞周期進程調(diào)節(jié)劑在腫瘤細胞內(nèi)的表達量是判斷腫瘤惡性程度高低的指標之一[18-19]。IGF1可以通過減少G1期細胞數(shù)量，增加S期與G2～M期細胞來促進細胞的增殖和分化[20]。白細胞介素-13（IL-13）是T細胞分泌的細胞因子，具有調(diào)節(jié)單核細胞和B細胞功能以及抑制促炎癥細胞因子生成的作用[21]。CCL19、CCL21為重要的趨化因子配體，不僅能夠誘導樹突狀細胞（DCs）的成熟和遷移，還能直接調(diào)節(jié)DCs啟動T細胞應答。CCL19和CCL21與趨化因子受體CCR7共同作用，在適應性免疫應答過程中發(fā)揮重要作用[22]。

綜上所述，本研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞在全身照射小鼠遠期基因調(diào)節(jié)仍有顯著改變。提示G-CSF不僅對造血干細胞、造血祖細胞有促進增殖和動員的功能，G-CSF可能對輻射造成的MSCs遠期損傷有促進修復和功能調(diào)節(jié)作用。其分子機制可能與下調(diào)L1cam、Mad1l1、Id1、Ccnb1等調(diào)節(jié)細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制細胞分化基因的表達從而增強MSCs增殖分化功能有關；或與上調(diào)Ccl19、Ccl21a、Il13等免疫相關基因的表達有關。這一基因芯片的結(jié)果為探討G-CSF對輻射誘導小鼠MSCs遠期損傷作用的分子機制提供了思路，反映了給予G-CSF后小鼠MSCs內(nèi)編碼這些蛋白質(zhì)的mRNA表達量的改變，但還需要有后期蛋白質(zhì)功能實驗的支持，以及分子生物學方法驗證這些基因調(diào)控的信號途徑。

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Microarray analysis and the effect of G-CSF on ionizing radiation induced long term mesenchymal stem cells injury

HUANG Song XING Yonghua ZHANG Junling LU Lu LI Chengcheng LI Deguan MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Tianjin 300192, China

ObjectiveTo study the effect of G-CSF on ionizing radiation (IR)induced long term mesenchymal stem cells (MSCs)injury and its possible molecular mechanisms.Methods 30 SPF C57BL/6 female mice were divided into control group,6 Gy irradiation Group,6 Gy irradiation+G-CSF administration group equally,RNA of mice's MSCs was extracted from the mice of three groups,and then biotin-labeled cDNA was generated by reverse transcription of mRNA for hybridization with Roche NimbleGen 12x135K mouse gene expression microarrays.The differentially expressed genes with 2-fold change were identified.Gene ontology enrichment analysis and pathway analysis based on Kyoto Encyclopedia of genes and genomes database were used to distribute the differentially expressed genes into biological processes and pathways.Results Among top 20 of up-regulated genes in 6 Gy group compared to control group, 12 genes were down-regulated in 6 Gy+G-CSF group (Vangl1,L1cam,Hdac2,Polk,Id1,Ttc37,Afp,Ccnb1,Ikbkg, Mad1l1,Itgb3,Rrm2).10 genes were up-regulated in 6 Gy+G-CSF group while down-regulated in 6 Gy group(Ccl19, Ccl21a,G6pc2,Igf1,Tnnt2,Ifna6,Tnfrsf14,Il13,Acaca,Oxsm).Pathway analysis based on KEGG database showed all the differentially expressed genes described above were mainly associated with cytokine-cytokine receptor interaction pathway,cell cycle and cell apoptosis regulation pathway,PI3K-Akt signaling pathway,NF-κB signaling pathway and p53 signaling pathway.Conclusion G-CSF may repair the IR-induced long term MSCs damage,and its molecular mechanisms may relate to regulation of cell cycle,inhibition of cell apoptosis,promotion of cell differentiation,or improve the immune response.Further researches are required to clarify the related signal transduction pathways.

G-CSF;MSCs;Radiation;Microarray

R329.2

A

1673-7210（2015）03（c）-0009-05

2014-12-20本文編輯：任 念）

國家自然科學基金海外合作基金項目 （編號81129020）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（“973”計劃）（編號2011CB964800-G）；國家自然科學基金面上項目（編號81372928）。

黃頌（1988.2-），女，北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所2012級放射醫(yī)學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：放射醫(yī)學。

孟愛民（1963.4-），女，碩士，博士生導師；研究方向：造血免疫損傷及腫瘤治療領域的藥理毒理學研究。