張旭生 劉黎青 王 媛

山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250355

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽涞难芯窟M(jìn)展

張旭生 劉黎青 王 媛

山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250355

缺血性腦血管病是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是近年來(lái)醫(yī)學(xué)臨床基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ头譃槿X性和局灶性兩種，以局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ洼^為常用，后者的制備有開(kāi)顱閉塞法、血栓法、線栓法等多種方法。其中線栓法在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最為廣泛，自Koizumi首次制備該模型以來(lái)，醫(yī)學(xué)研究人員不斷對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。另外，由于基因工程在技術(shù)上有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，因此可以大膽預(yù)測(cè)其將在以后的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽浞矫姘l(fā)揮越來(lái)越重要的作用，能夠更好地服務(wù)于臨床實(shí)驗(yàn)研究。

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停恢苽?；分?lèi)

缺血性腦血管病是內(nèi)科疾病的常見(jiàn)病、多發(fā)病，占全部腦卒中的60%～80%[1]，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ驮谌毖阅X血管相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前腦缺血模型主要分為全腦缺血模型和局灶性腦缺血模型兩類(lèi)，然而針對(duì)各種腦缺血模型的制作方法、適用范圍、影響因素等方面沒(méi)有全面的認(rèn)知，這必將會(huì)影響腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽涞倪M(jìn)一步發(fā)展及更為廣泛的應(yīng)用。本研究將對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽涞难芯窟M(jìn)展做如下綜述：

1 全腦缺血模型

全腦缺血是指絕大部分或全腦血流量的降低，制作該模型對(duì)腦缺血實(shí)驗(yàn)中的某些生理代謝研究有著重要作用[2]。此外，該模型穩(wěn)定性高，病理改變充分，海馬、丘腦、尾狀核、皮質(zhì)記憶區(qū)受損嚴(yán)重，可以模擬血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制，也可用于神經(jīng)保護(hù)藥的評(píng)價(jià)研究[3]。此模型的造模方法多樣，有心跳驟停、主動(dòng)脈血流阻斷、斷頭術(shù)、頸動(dòng)脈氣囊阻斷大出血、低血壓、低氧性缺血、雙血管栓塞+低血壓、四血管栓塞、三血管阻斷、單向性頸動(dòng)脈栓塞等[4]；其中比較常用的為四血管閉塞模型、雙血管栓塞+低血壓模型、三血管阻斷缺血模型。

1.1 雙血管栓塞+低血壓模型

Eklof等[5]首先設(shè)計(jì)并制備該模型，通過(guò)阻斷大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）合并使用降壓藥物使其平均動(dòng)脈血壓降至50 mmHg（1 mmHg =0.133 kPa）左右，前腦血流量下降到基礎(chǔ)血流量的15%以下，產(chǎn)生可逆性前腦缺血。此法具有手術(shù)難度低、可操作性強(qiáng)、模型死亡率低等特點(diǎn)。但是血壓下降時(shí)易使其他重要器官的功能受到影響。武釗等[6]利用靜脈留置針代替頭皮針行靜脈插管術(shù)，避免了由于針頭過(guò)于銳利對(duì)血管造成的損傷；另外利用三通管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的靜脈穿刺來(lái)抽放血液，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液的自由抽放、回輸及血壓的監(jiān)測(cè)，使得造模成功率達(dá)87.5%。

1.2 三血管阻斷缺血模型

此模型在1985年由Kameyama等首先建立，大鼠麻醉后，做頸部正中切口，分離雙側(cè)CCA，除去枕骨腹側(cè)面部分顱骨，電灼斷扎基底動(dòng)脈（basilar artery，BA），通過(guò)對(duì)雙側(cè)CCA的夾閉實(shí)現(xiàn)全腦缺血再灌注時(shí)間。這種造模方法成功率高，可通過(guò)阻斷雙側(cè)CCA時(shí)間的長(zhǎng)短控制腦缺血的程度。但此造模方法是在顯微鏡下進(jìn)行的，BA在電灼斷過(guò)程中易出血，手術(shù)難度大。

田鶴邨等[7]將此法改良，在直視下采用特制的動(dòng)脈夾以控制BA的缺血-再灌注時(shí)間，使BA的損傷減輕。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型大鼠血壓正常穩(wěn)定，避免了由血壓降低引起的其他重要臟器的再灌注壓不足而導(dǎo)致的功能損害。

1.3 四血管閉塞模型

1979年由Pullsineli等[8]建立該模型。大鼠成功麻醉后，分離并暴露其雙側(cè)CCA和寰椎兩側(cè)橫突孔，剝離兩側(cè)椎動(dòng)脈（vertebral artery，VA）并用電凝器將其阻斷。24 h后夾閉其雙側(cè)CCA，造成全腦缺血。此模型可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，通過(guò)控制動(dòng)脈夾的夾閉來(lái)實(shí)現(xiàn)腦缺血-再灌流，從而實(shí)現(xiàn)不同程度的腦缺血損傷。有學(xué)者在此基礎(chǔ)上采用3階段制作方法對(duì)其進(jìn)行改良，第1階段：分離雙側(cè)CCA；第2階段：沿寰椎內(nèi)斜向上的神經(jīng)來(lái)尋找橫突孔，分2次灼燒阻斷雙側(cè)VA；第3階段：24 h后夾閉CCA 10 min。此法可顯著提高模型制作成功率和存活率[9]。

1.4 局灶性腦缺血模型

與全腦缺血模型比較而言，局灶性腦缺血模型的優(yōu)勢(shì)在于可對(duì)腦缺血特定部位進(jìn)行干預(yù)，全身不良反應(yīng)較小，與人類(lèi)腦缺血發(fā)病情況更為相似，因此，此類(lèi)模型應(yīng)用也更廣泛。局灶性腦缺血模型可以通過(guò)開(kāi)顱閉塞法、血栓栓塞法、線栓法、化學(xué)刺激誘導(dǎo)血栓阻斷法、內(nèi)皮素誘導(dǎo)法和光化學(xué)誘導(dǎo)法等多種方法實(shí)現(xiàn)[10]。目前常用制備方法主要為前3種。

2 制備方法

2.1 開(kāi)顱閉塞法

1981年Tamura等[11]建立該模型。首先經(jīng)顳下部或眼眶入顱，阻斷大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）及其分支，造成局灶性腦缺血。此法的可視性高，缺血效果好，術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分普遍要好于線栓組，其術(shù)后生存時(shí)間也長(zhǎng)于線栓組，可達(dá)2周，甚至更長(zhǎng)[12]。但是開(kāi)顱創(chuàng)傷大，對(duì)術(shù)者的手術(shù)技巧要求較高，尤其是MCA閉塞后無(wú)法實(shí)現(xiàn)再灌注，限制了其推廣應(yīng)用。2013年Yang等[13]采取氟烷吸入麻醉小鼠成功后，電凝其左側(cè)MCA，同時(shí)阻斷雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）血流15 min的方法建立模型。此手術(shù)操作用時(shí)短，腦缺血后小鼠死亡率低。該模型可用于評(píng)估小鼠局灶性缺血性腦卒中、遠(yuǎn)期神經(jīng)功能[14]。

2.2 血栓栓塞法

Kudo等[15]在1982年報(bào)道了該模型。此模型的優(yōu)點(diǎn)在于利用大鼠自體血栓栓塞，更加接近人類(lèi)腦缺血的實(shí)際情況；并且還可用來(lái)探索溶栓機(jī)制、評(píng)價(jià)溶栓藥物療效，具有其他模型無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)[16]。缺點(diǎn)在于存在栓子的走行和栓子是否阻塞期望血管不確定性等問(wèn)題。2012年Durand等[17]在此模型基礎(chǔ)上，經(jīng)顳葉開(kāi)顱，向MCA注射凝血酶，造成原位血栓，然后應(yīng)用溶栓藥物成功溶栓。開(kāi)辟了血栓栓塞-溶栓這一新的腦缺血模型研究領(lǐng)域。

2.3 線栓法

線栓法造模因其可操作性高，缺血部位固定，并可按照實(shí)驗(yàn)要求控制缺血-再灌注時(shí)間，成為沿用至今的經(jīng)典MCAO模型制備方法。1986年Koizumi等[18]首次報(bào)道該模型，將大鼠麻醉成功后，行頸部正中切口，玻璃分針?lè)蛛x其右側(cè)CCA、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）、ICA，結(jié)扎ECA后，在CCA分叉處下方用眼科剪沿ICA方向做一楔形切口，將線栓插入切口，通過(guò)ICA到達(dá)MCA起始端感到阻力后，結(jié)扎CCA近心端，由此造模成功。若要進(jìn)行再灌注，則由ECA插入線栓至MCA起始端，然后再將尼龍線往回抽到ECA處。

近年來(lái)，研究者們?cè)诰€栓制備、麻醉、手術(shù)等環(huán)節(jié)加以改良優(yōu)化，使該模型更加完備。

2.3.1 線栓影響因素

線栓的直徑及插線深度、表面涂層及末端平滑度對(duì)栓塞效果影響較為顯著。

2.3.1.1 線栓的直徑及插線深度 關(guān)于線栓的直徑，1989年Longa等[19]將4-0單尼龍線頭端燙成光滑而膨大的球形，使其直徑稍大于尼龍線本身替代Koizumi的線栓制備方法，此法優(yōu)點(diǎn)是較為便捷，缺點(diǎn)在于沒(méi)有考慮到因大鼠體重的不同而產(chǎn)生的血管直徑差異。有研究表明，隨著大鼠質(zhì)量的增加，其線栓的直徑也隨之增加[20]。杜郭佳等[21]認(rèn)為體重在250～300 g的大鼠，對(duì)手術(shù)的耐受性強(qiáng)，血管變異小，更適宜制備MCAO模型。

關(guān)于線栓的插線深度，文獻(xiàn)報(bào)道不一。崔龍等[22]采用測(cè)量TC線[門(mén)齒根部前沿（T點(diǎn)）至CCA分叉點(diǎn)（C點(diǎn)）的連線]長(zhǎng)來(lái)確定穿線深度，并給出公式：插線深度=1.0657×TC線長(zhǎng)（mm）-2.6345，對(duì)預(yù)估插線深度有著很好的指導(dǎo)作用。

2.3.1.2 線栓涂層 劉運(yùn)泉[23]在線栓頭端覆以硅橡膠，然后用左旋多聚賴(lài)氨酸處理，此法避免了因線栓頭端太銳利刺破動(dòng)脈血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，同時(shí)也增強(qiáng)了缺血的穩(wěn)定性，保證了可靠的缺血效果。有研究表明，石蠟涂層線栓的建模成功率達(dá)100%，與裸露尼龍線栓相比，梗死效果更好，模型動(dòng)物死亡率更低，是一種新型可靠的MCAO制備方法[24]。

2.3.2 手術(shù)方法

有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)中采用頸部旁正中切口，不用微血管夾，改用線套法控制CCA以及ECA血流，松開(kāi)套線恢復(fù)血液循環(huán)，避免空間小、血管夾夾閉困難及易出血等問(wèn)題。此法視野暴露充分，易于分離肌肉和血管，出血少，對(duì)氣管刺激小，總模型成功率為93.75%[22]。

馮珂等[25]在造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，從CCA分出的ICA和ECA基本呈背腹分布，正面觀察不宜辨別。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步剝離才可確定在腹側(cè)的是ECA，在背側(cè)的是ICA。而孫念霞等[26]在結(jié)扎ICA斷端外，線結(jié)外端用電刀阻斷，并在插線時(shí)借助彎鑷的力量使線栓沿CCA分叉處ICA血管的方向前行。此法可使線結(jié)不易脫落，插線成功率亦隨之提高。

2.3.3 麻醉方法及麻醉劑的選擇

常用的麻醉方法有氣體麻醉和腹腔注射麻醉。氣體麻醉優(yōu)點(diǎn)是作用迅速，易于控制麻醉時(shí)間。缺點(diǎn)是需持續(xù)給藥，且對(duì)呼吸道有一定的刺激作用。腹腔注射麻醉常用藥物為戊巴比妥鈉和水合氯醛。有學(xué)者對(duì)兩者的麻醉效果進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示，戊巴比妥鈉應(yīng)用劑量較水合氯醛小，前者有效量與致死量更接近。且戊巴比妥水溶液不穩(wěn)定，易分解。因此，就穩(wěn)定性及安全性而言，腹腔注射麻醉劑優(yōu)于水合氯醛[27-28]。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究水平不斷提高，腦缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑炷７椒ㄔ谠械幕A(chǔ)上不斷被加以改良和優(yōu)化，使其能夠更好地模擬出人類(lèi)腦缺血時(shí)出現(xiàn)的病理生理變化，為臨床醫(yī)學(xué)工作者提供了有力的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)設(shè)施。目前，國(guó)外有學(xué)者在基因水平對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物加以篩選，培育出更加適用于實(shí)驗(yàn)研究的轉(zhuǎn)基因大鼠。依據(jù)基因改造方法的不同可分為R169C、R90C、R142C和C428S 4種CADASIL大鼠模型，由于基因改造方法的差異，造成各個(gè)模型的基因表達(dá)水平不同[29-30]。在沒(méi)有血-腦屏障破壞和血管結(jié)構(gòu)改變的情況下，CADASIL大鼠模型易出現(xiàn)腦血管功能紊亂、循環(huán)障礙、腦血管內(nèi)徑變窄、肌源性反應(yīng)減弱、自動(dòng)調(diào)節(jié)能力減弱等表現(xiàn)[31]。但是目前的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ腿允艿絼?dòng)物體重、性別、麻醉方法、操作熟練程度、溫度、栓子類(lèi)型等諸多因素的影響。如何能夠簡(jiǎn)便有效地制作出損傷小，成功率高，重復(fù)性好的腦缺血模型是亟待解決的問(wèn)題。相信在不久的將來(lái)，通過(guò)廣大學(xué)者不懈的努力和鉆研，腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹苽浞椒▽⒏油晟?，能夠更好地服?wù)于臨床實(shí)驗(yàn)研究，為腦缺血疾病提供更多的理論依據(jù)。

[1]王擁軍，張?zhí)K明.中國(guó)缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級(jí)預(yù)防指南2010[J].中華神神經(jīng)科雜志，2010，43（2）：154-160.

[2]孫蓉，張亞囡.缺血性腦血管病動(dòng)物模型研究概況與中藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)思考[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（16）：2299-2302.

[3]欒永福，李曉驕陽(yáng)，孫蓉.多梗死性腦癡呆模型研制與中藥藥效評(píng)價(jià)思考[J].中藥藥理與臨床，2012，28（4）：121-124.

[4]鄒永杰，崔高宇，馮華.腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯窟M(jìn)展[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2012，39（5）：423-426.

[5]Eklof B，Siesjo BK.The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state of the rat brain[J].Acta Physiol Scand，1972，86（2）：155-165.

[6]武釗，黃偉青，文銳玲，等.改良二血管阻斷加低血壓法制作大鼠全腦缺血再灌注模型[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（17）：4-5.

[7]田鶴邨，陳前芬，謝群.三血管阻斷與重開(kāi)放造成的大鼠全腦缺血再灌流損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，18（2）：113-116.

[8]Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke，1979，10（3）：267-272.

[9]李文東，姜洪波，連曉清，等.Pulsinelli四血管法大鼠全腦缺血模型制作方法的改進(jìn)[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27（3）：237-239.

[10]陳曉娟，肖宗宇，潘琪，等.改良線栓法大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（3）：24-27.

[11]Ginsberg MD，Busto R.Rodent models of cerebral ischemia[J].Stroke，1989，20（12）：1627-1642

[12]趙強(qiáng)，朱偉杰，王芙昱，等.小鼠局灶性腦缺血模型的比較分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（8）：870-872.

[13]Yang D，Nakajo Y，Iihara K，et al.A logliptin，a dipeptidylpeptidase-4 inhibitor，for patients with diabetes mellitus type 2，induces tolerance to focal cerebral ischemia in non-diabetic，normal mice[J].Brain Res，2013，1517（6）：104-113.

[14]Ma J，Peng C，Guo W，et al.A modified model of middle cerebral artery electrocoagulation in mice[J].CNS Neuroscience&Therapeutics，2012，18（9）：796-798.

[15]Kudo M，Aoyam A，Ichimori S，et al.An animal model of cerebral infarction；hanologous blood clots boli in rats[J]. Stroke，1982，13（4）：505-508.

[16]孫文昊，陳會(huì)生.嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦缺血模型的回顧與研究進(jìn)展[J].中國(guó)腦血管病雜志，2013，10（8）：432-443

[17]Durand A，Chauveau F，Cho TH，et al.Spontaneous reperfusion after in situ thromboembolic stroke in mice[J]. PLoS One，2012，7（11）：50083.

[18]KoizumiJ，Yoshida Y，NakazawaT，etal.Experimentalstudies of ischemic brain edema.1.A new experimental model of cerebral embolism infarcts in the ischemic area[J]. Japan J Stroke，1986，（8）：1-8.

[19]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Recersible middlecerebralartery occlusion without craniectomyin rats[J]. Storke，1989，20（1）：84-91.

[20]Kuge Y，Minematsu K，Yamaguchi T，et al.Nylon mono of filament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke，1995，26（9）：1655-1657.

[21]杜郭佳，朱國(guó)華，范雁東，等.改良法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型[J].中國(guó)醫(yī)刊，2013，48（12）：42-44.

[22]崔龍，李忠仁.“同身寸”法估算大鼠局灶性腦缺血模型線栓深度[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21（1）：40-42.

[23]劉運(yùn)泉，戴穎.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的改進(jìn)[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2005，23（2）：222.

[24]Zuo XL，Wu P，Ji AM.Nylon filament coated with paraffin for intraluminal permanent middle cerebral artery occlusion in rats[J].Neuroscience Letters，2012，519（1）：42-46

[25]馮珂，紀(jì)立金.線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型的體會(huì)[J].遼寧中醫(yī)雜志，2013，40（1）：21-23.

[26]孫念霞，高維娟，易忠良.改良線栓法制作SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型[J].中國(guó)組織工程研究，2014，18（2）：225-230.

[27]謝健，閔蘇.參附注射液對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)的影響[J].中國(guó)藥房，2011,22（27）：2517-2519.

[28]盧英，蔡光先，譚琥，等.大腦中動(dòng)脈線栓法腦缺血模型制作的改進(jìn)及經(jīng)驗(yàn)探討[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：6-9.

[29]AyataC.CADASIL：experimental insights from animal models[J].Stroke，2010，41（10）：129-134.

[30]劉勝敏，楊志宏，孫曉波.沙鼠腦缺血模型特點(diǎn)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013,21（6）：79-83.

[31]Joutel A，Monet-Leprêtre M，Gosele C，et al.Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease[J].J Clin Invest，2010，120（2）：433-445.

Research progress of preparation of cerebral ischemia animal model

ZHANG Xusheng LIU Liqing WANG Yuan
School of Basic Medicine,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Province,Ji'nan 250355, China

Ischemic cerebrovascular disease is a common and frequently occurring disease.It is a recent hotspot in the field of clinical basic research.Animal model of cerebral ischemia is divided into global cerebral ischemia and focal cerebral ischemia,and the animal model focal cerebral ischemia is more commonly used.There are several methods for preparing the latter model,including occlusion method with craniotomy,thrombosis method,suture-occluded method etc.In which the suture method is the most widely used in experimental research.Since Koizumi prepared the model for the first time,medical researchers have continued to improve it and achieved good experimental results.Besides, since genetic engineering technology has unparalleled advantages,it is a bone predict that it will play an increasingly important role in the preparation of future animal models of cerebral ischemia,and it will better serve the clinical studies.

Cerebral ischemia animal model;Preparation;Classification

R743.9

A

1673-7210（2015）11（c）-0056-04

2015-08-14本文編輯：趙魯楓）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（8140151367）。

張旭生（1984-），男，山東中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)中西醫(yī)結(jié)合專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

劉黎青（1961-），女，教授，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。