DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.009

基金項目：國家自然科學基金海外及港澳學者合作研究基金（31428005）；國家自然科學基金（81171653、30950022）；江蘇省自然科學基金（BK2011246）；江蘇省科技條件建設與民生科技專項資金（BL2014034）

作者單位：213003 常州，蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心

通信作者：蔣敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

收稿日期：2015-06-08

自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過釋放趨化因子和細胞因子，廣泛參與炎癥反應與適應性免疫應答，在抗腫瘤、抗病毒感染以及干細胞移植等方面發(fā)揮重要作用 [1]。NK 細胞的活化取決于其細胞表面活化信號及抑制信號的共同調(diào)控。NKp30 是自然細胞毒性受體（natural cytotoxicity receptors，NCR）家族成員之一，是 NK 細胞表面重要的活化性受體，通過識別靶細胞上相關配體，介導 NK 細胞發(fā)揮生物學功能。B7-H6是新發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子 B7 家族成員，作為 NKp30 的潛在配體，能夠激活 NKp30 介導的 NK 細胞活化，促使其分泌細胞因子，發(fā)揮抗腫瘤細胞毒性 [2]。B7-H6 是 B7 家族首個被證實能夠直接誘導 NK 細胞活化的協(xié)同刺激分子，在部分腫瘤組織中有表達，正常組織中不表達，這一發(fā)現(xiàn)為揭示 NKp30 在腫瘤免疫監(jiān)視中的作用提供了新的依據(jù)。

1　協(xié)同刺激分子 B7-H6 的生物學特性

Brandt 等 [3]最先研究發(fā)現(xiàn) NKp30 Fc 融合蛋白可以與K562 細胞結(jié)合，其特異性結(jié)合僅被 NKp30 單克隆抗體阻斷，而不被 NKp46 單克隆抗體阻斷。并且，NKp30 Fc 融合蛋白能夠抑制 NK 細胞對 K562 細胞的結(jié)合能力與細胞毒活性。通過免疫沉淀技術(shù)對 NKp30 Fc 與 K562 細胞結(jié)合后的裂解產(chǎn)物進行沉淀并用凝膠電泳分離，質(zhì)譜分析其中的差異蛋白，最后由表面等離子金屬共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）確認一種蛋白（DKFZp686O24166）能特異性結(jié)合 NKp30，兩者結(jié)合活性可被能阻斷 NKp30介導的 NK 細胞活化的 NKp30 單克隆抗體所抑制。由于該蛋白基因和蛋白結(jié)構(gòu)與 B7 家族其他成員類似，并且其受體 NKp30 與 CD28 家族相關，因此被命名為 B7-H6分子。

B7-H6 基因定位于染色體 11p15.1，在人類 dbEST 數(shù)據(jù)庫中僅有 4 種 cDNA 的表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）。B7-H6 與 B7 家族成員中 B7-H1、B7-H3 同源性最高，其開放閱讀框編碼一個分子量為 51 kD 的免疫球蛋白超家族 I 型跨膜糖蛋白。B7-H6 胞外區(qū)含有兩個由外顯子編碼的 Ig 結(jié)構(gòu)域，包含 6 個重要的 N 連接糖基化位點。B7-H6 胞內(nèi)區(qū)域與 GAG 多聚蛋白同源性較高，含有多種信號基序，例如免疫受體酪氨酸依賴抑制基序、Src同源性 2 結(jié)合基序等，這種特性提示 B7-H6 可通過胞內(nèi)信號蛋白的交互作用誘導 NK 細胞表面受體活化 [3]。

2　協(xié)同刺激分子 B7-H6 的表達情況

小鼠基因的 B7-H6 相關序列僅與人類基因第一外顯子相對應，因此 B7-H6 在小鼠基因中表達缺失 [4]。B7-H6 mRNA 在絕大部分人類正常組織中不表達，這一結(jié)果與其基因微陣列檢測結(jié)果一致。用親和純化的 B7-H6 抗血清或 B7-H6 單克隆抗體在新鮮分離的人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中未檢測到B7-H6 的表達。此外，在植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激后的 PBMC 中也未觀察到 B7-H6 的表達。值得注意的是，盡管 NKp30 受體在 NK 細胞和 DC 細胞的交互調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，但是在經(jīng) IL-4、GM-CSF刺激誘導而來的靜止或活化的 DC 細胞中也未檢測到B7-H6 [5]。B7-H6 mRNA 主要表達于不同來源的腫瘤細胞系，包括淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、惡性上皮腫瘤以及其他原發(fā)性腫瘤等。在多種血液系統(tǒng)腫瘤患者的腫瘤細胞中也有 B7-H6 的表達。B7-H6 局限于腫瘤組織中表達與 NK細胞在壓力誘導模式下啟動固有免疫反應的機制吻合 [6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，B7-H6 除了在腫瘤組織表達外，其基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達可在 Toll 樣受體激動劑以及促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α 的誘導下于活化的單核細胞和中性粒細胞上表達。這一研究揭示，B7-H6 不僅對腫瘤免疫監(jiān)視有影響，還能在感染條件下參與機體炎癥反應 [7]。

3　協(xié)同刺激分子 B7-H6 與其受體 NKp30 的作用通路及調(diào)控機制

B7-H6 特異性地在腫瘤細胞中表達，并能被 NKp30識別、誘導 NK 細胞活化。NKp30 基因定位于染色體6p21.32，分子量為 30 kD，與 CTLA-4 有 25% 的同源性，屬于免疫球蛋白超家族成員，胞外僅含有一個 IgV 樣區(qū)域，跨膜區(qū)有一個帶正電荷的精氨酸殘基，通過電荷作用與CD3ζ 鏈結(jié)合從而傳遞活化信號 [8]。NKp30 主要表達在人靜止或活化的 NK 細胞表面，但最近也有研究表明，在 IL-15刺激后的臍帶血 T 細胞以及黃體酮干預后的子宮內(nèi)膜上皮細胞中也有 NKp30 表達 [9-10]。作為 NK 細胞重要的活化性受體，NKp30 與 NKG2D、DNAM-1 等其他受體相同，可以識別多種配體，從而發(fā)揮不同的生物學效應 [11]。目前已知熱休克因子釋放的核蛋白 HLA-B 相關轉(zhuǎn)錄因子 3 和人巨細胞病毒 pp56 蛋白能夠結(jié)合 NKp30，但兩者均不在腫瘤細胞中表達。B7-H6 不被 NK 細胞表面 NKp44、NKp46 以及 NKG2D 等活化性受體識別，NKp30 也不與 B7-H1、B7-DC、B7-H3 等 B7 家族成員結(jié)合，表明 NKp30 胞外區(qū)域能與 B7-H6 胞外區(qū)直接并特異性結(jié)合。NKp30 通過與 B7-H6IgV 結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成的復合物主要依賴 NKp30 中 11 個氨基酸殘基與 B7-H6 中 12 個氨基酸殘基間的疏水作用力，并且 B7-H6 分子 125 ~ 130 位氨基酸形成的loop 環(huán)在與 NKp30 結(jié)合中發(fā)揮重要作用 [12]。

B7-H6/NKp30 途徑主要通過誘導 NK 細胞活化、促進其分泌 IL-2 和 IFN-γ 等細胞因子，增強 NK 細胞殺傷能力，參與抗腫瘤免疫反應。Schlecker 等 [13]發(fā)現(xiàn)整合素金屬蛋白酶 10（adisintegrin and metalloprotease 10，ADAM 10）可以介導腫瘤細胞外 B7-H6 分子的脫落，阻礙 NK 細胞通過 NKp30 受體途徑對腫瘤細胞的識別，通過抑制ADAM 10 的活性，能夠提高腫瘤細胞 B7-H6 的表達，增強 NKp30 介導的 NK 細胞活化能力。因此，B7-H6/NKp30途徑對阻止腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視發(fā)揮重要作用。

B7-H6 的表達主要與組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）的調(diào)節(jié)有關。Fiegler 等 [2]證實 I 型組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi）可以下調(diào) B7-H6 mRNA 在多種腫瘤細胞系上的表達，同時 I 型 HDACi 在轉(zhuǎn)染小干擾 RNA（siRNA）后，B7-H6 基因表達沉默，從而影響 NK 細胞對腫瘤細胞的識別能力。這些研究表明抑制 B7-H6 表達主要與減少其報告基因活性以及降低啟動子乙?；接嘘P。這一研究結(jié)果與之前報道的 HDACi 通過增強 NK 細胞活化受體 NKG2D相關配體的表達水平，從而提高 NK 細胞介導的抗腫瘤免疫反應截然相反。由此可見，腫瘤細胞表面不同配體的表達對 HDACi 聯(lián)合 NK 細胞腫瘤免疫治療的臨床轉(zhuǎn)歸有深遠影響。

4　協(xié)同刺激分子B7-H6在腫瘤治療中的意義

B7-H6 主要表達在造血系統(tǒng)或非造血系統(tǒng)腫瘤細胞系表面，但對于其在腫瘤組織中的表達情況研究還不夠深入。到目前為止，應用免疫組織化學法已在胃癌及非小細胞肺癌等人類腫瘤組織中檢測到 B7-H6 蛋白的表達。

Chen 等 [14]檢測到 B7-H6 在原發(fā)性胃癌中有表達，雖然 B7-H6 在原發(fā)性胃癌中的表達與患者臨床病理特征和預后沒有相關性，但發(fā)現(xiàn) B7-H6 的表達水平與腫瘤細胞的分化程度相關，細胞分化程度越高，B7-H6 蛋白表達水平也越高。Zhang 等 [15]在非小細胞肺癌中檢測到了 B7-H6 的表達，并用流式細胞術(shù)檢測了 B7-H6 受體 NKp30 在組織中的表達情況，結(jié)果顯示，B7-H6 在腫瘤組織及鄰近非腫瘤組織中的表達無統(tǒng)計學意義，且 B7-H6 表達與除細胞分化水平外的其他臨床病理特征無相關性，B7-H6 的受體NKp30 在腫瘤組織及鄰近非腫瘤組織中表達也無顯著差異，這一結(jié)論與 Chen 等在胃癌中的研究結(jié)果相似。有關B7-H6 蛋白在其他腫瘤組織中的表達有待于研究。

NK 細胞對靶細胞的識別模式之一為“壓力誘導”模式（stress-induced mode），是指靶細胞在惡性轉(zhuǎn)化、病毒感染、炎性反應或化學刺激等壓力作用下，靶細胞自身蛋白可在轉(zhuǎn)錄因子 HSF 的調(diào)控下上調(diào)表達，從而被 NK 細胞活化受體識別，激活 NK 細胞，發(fā)揮殺傷功能。Kellner 等 [16]首先制備出一種包含 B7-H6 分子胞外結(jié)構(gòu)域以及 CD20 抗體單鏈可變區(qū)段 7D8 的重組融合蛋白，該蛋白可以與 CD20 +的淋巴瘤細胞特異性結(jié)合，使細胞高表達 B7-H6 分子，并通過 B7-H6/NKp30 途徑使 NK 細胞活化并釋放顆粒酶、穿孔素溶解靶細胞。

B7-H6 除了在 NK 細胞的活化及生物學功能的發(fā)揮中有重要作用，還可以通過基因修飾等途徑參與 T 細胞介導的抗腫瘤免疫應答。Zhang 等 [17]報道，利用基因工程技術(shù)，將以非 MHC 限制性方式識別目標抗原（B7-H6）的嵌合受體（NKp30）通過激活信號，以病毒載體或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)方式轉(zhuǎn)染 T 細胞，由此制備出的 NKp30-CAR-T 細胞可以不依賴于 MHC 限制性，特異性識別 B7-H6 +的腫瘤細胞，分泌 IFN-γ 并殺傷腫瘤細胞。研究者將這種胞內(nèi)含有CD28 信號區(qū)的 NKp30-CAR-T 細胞過繼轉(zhuǎn)移給 B7-H6 +的淋巴瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制小鼠腫瘤的生長。這一研究成果為過繼細胞免疫治療的臨床應用提供了新的思路。

5　展望

B7-H6/NKp30 途徑的發(fā)現(xiàn)揭示了 NK 細胞活化的一種嶄新的分子機制。B7-H6 局限在腫瘤組織中表達也是機體在應激壓力下誘導自身蛋白表達的一個新發(fā)現(xiàn)。目前，對B7-H6 的作用機制尚未明確，在腫瘤患者的縱向研究中，需要探究 B7-H6 在腫瘤組織中的表達不受腫瘤免疫編輯的影響而發(fā)生變化，以及 B7-H6 與其受體 NKp30 如何與腫瘤微環(huán)境中其他信號分子共同形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡以調(diào)節(jié)免疫效應細胞的活化與功能。如果明確 B7-H6 能特異性并穩(wěn)定地在腫瘤組織中表達，提示將 B7-H6/NKp30 作為腫瘤免疫治療新靶標有廣闊前景，也為腫瘤的臨床綜合診療提供了新的策略。