沈建良，韓 穎，黃友章

造血干細胞低溫保存與復溫操作規(guī)程(討論稿)

沈建良，韓 穎，黃友章

低溫保存造血干細胞的效果受諸多因素的影響，如溫度、降溫速率、細胞含量、低溫保護劑、解凍復溫過程、保存時間以及檢測指標，由于各研究中心之間所用方法存在一定差異，導致結果可比性差，循證力度較弱。因此至今為止，國內(nèi)尚無相關操作指南，國外也只有歐洲的國際細胞治療學會和血液及骨髓移植組聯(lián)合認證委員會指南。作者結合自身多年血細胞低溫保存工作經(jīng)驗和各種文獻，起草了適用于醫(yī)院小型低溫保存庫的操作規(guī)程，供同行參考，并期待大家批評指正。

造血干細胞；低溫保存；復溫

低溫保存造血干細胞并應用于臨床治療已有數(shù)十年歷史，證明安全、可行。但至今為止，各中心執(zhí)行的操作方法差異較大，國外只有歐洲的國際細胞治療學會和血液及骨髓移植組聯(lián)合認證委員會指南，國內(nèi)尚無統(tǒng)一的操作指南或標準。導致這種狀況的原因是，在整個低溫保存過程中，諸多因素影響保存效果，各研究中心之間所用方法有所差異，研究結果可比性較差，循證力度較弱。其主要表現(xiàn)在:①保存溫度。20世紀80年代傾向于-196℃，90年代傾向于-80℃[1-9]。眾多研究認為，-196～-80℃是低溫保存的標準溫度[10-12]。②降溫速率。長期以來一直將程控降溫作為標準，但大量的研究表明，非程控降溫安全、簡便，結果與程控降溫可比[2，5-6，13-14]。不僅適用于來源于骨髓和外周血的干細胞[10，15]，也適用于臍血干細胞[16-17]。但也有研究表明，細胞活力上兩者無差異，粒細胞-巨噬細胞集落形成單位(colony-forming unit-granulocyte-macrophage，CFU-GM)檢測結果不如程控降溫方法[7]。③細胞含量。早期強調(diào)有核細胞含量不超過2×107/mL[4，18]。1994年Rowley等[19]發(fā)現(xiàn)，5.6×108/mL的細胞含量也能很好耐受。以后的其他研究也得出相似的結論[20]。目前推薦的細胞含量為2×108/mL[19]。④低溫保護劑。1959年二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)首次被用作低溫保護劑，此后一直被作為標準的低溫保護劑，通常為10%[1-2，6]。然而，臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，部分患者輸注后出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等不良反應[21]，還有患者出現(xiàn)心血管、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟、肝臟、溶血毒性表現(xiàn)，甚至有死亡病例報道。后來的研究表明，2.2%～6.0%的DMSO也有效[2-3，5，22-24]，2.2%～6.0%DMSO聯(lián)合細胞外保護劑羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)可以更有效地保存細胞[5-6，25]，也能明顯降低＞6.0%DMSO帶來的不良反應。進一步研究發(fā)現(xiàn)，丙烯乙二醇、維生素Eα、過氧化氫酶和抗壞血酸的聯(lián)合物以及海藻糖均可作為細胞內(nèi)和細胞外的保護劑[26-28]。⑤解凍(復溫)。標準解凍方法是37℃水浴箱加溫，使所有冰晶均消失為止[6]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在0、20、37℃下解凍20 min，結果無差異[29]。目前也有用干加熱設備進行解凍的報道[30]。⑥洗滌。解凍后洗滌去除DMSO是標準做法[12，27]，現(xiàn)有的標準洗滌方法是紐約血液中心的2步稀釋方案[12]。解凍后通過洗滌或稀釋來降低DMSO的含量已得到廣泛應用[21-22]。但也有研究報道，造血干細胞對 DMSO有抵抗性，不需洗滌[6]。國內(nèi)大多數(shù)單位也未進行洗滌[31]，因為洗滌過程不可避免會損失部分干細胞[32]。⑦保存時間。低溫保存干細胞的確切時間至今仍不清楚。低溫保存早期，紅系爆式集落形成單位(burst-forming unit-erythroid，BFU-E)、CFU-GM就有損傷，但總有核細胞和CD34+細胞以及在非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷病(non-obesity diabetes/severe combined immunedeficiency disease，NOD/SCID)小鼠中的植入能力可保持較長時間[1-2，5，7-8，25，33]，臍血干細胞也觀察到類似現(xiàn)象[11，27，29，34]。用流式細胞術和克隆形成方法證實干細胞保存 12年甚至15年是可行的[35-36]，用NOD/SCID小鼠移植方法證實，凍存15年的臍血仍保持造血功能。海軍總醫(yī)院血液科保存25年的骨髓仍能擴增出正常的間充質(zhì)干細胞[37]。在臨床上保存7年的骨髓用于臨床移植獲得成功[17]，也有報道保存8年[33]、11年[4]、21年[38]后成功移植的病例。Galmes等[39]報道，-80℃下保存的造血干細胞，單個核細胞活力與CFU-GM、BFU-E的回收率進行性下降，至24個月時降至0，長期保存組移植后造血重建速度較短期保存組慢，因此不推薦在5% DMSO、-80℃下保存時間超過6個月。但也有研究表明，5%DMSO聯(lián)合6%HES、-80℃保存5～18個月，仍有92%的有核細胞回收率和88%的細胞活力[40]。⑧細胞功能的檢測。移植前檢測低溫保存的造血干細胞功能最有價值的方法是在NOD/SCID小鼠進行移植[41-42]，但在臨床上該項目作為常規(guī)開展還有困難，目前仍以有核細胞形態(tài)、計數(shù)、臺盼藍拒染率、CD34+細胞計數(shù)、造血干細胞培養(yǎng)為主要檢測方法[43]。

為了在今后對我國低溫保存工作進行規(guī)范創(chuàng)造條件，作者結合自身多年血細胞低溫保存工作經(jīng)驗和各種文獻，起草了適用于醫(yī)院小型低溫保存庫的操作規(guī)程，供同行參考，并期待大家批評指正。

1 原則

造血干細胞(包括骨髓血、外周血和臍帶血來源)為有核細胞，對有核細胞的低溫保存與復蘇，基本原則是細胞中加入低溫保護劑，緩慢降溫、快速復溫(慢凍快融)。低溫保護劑多采用DMSO加白蛋白或DMSO加HES和白蛋白，這些物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。程控降溫時降溫速率要求:4～-30℃，1～2℃/min；-30～-80℃，3～10℃/ min；此后直接移入-196℃液氮中保存。非程控降溫2步法:第1步，樣本從4℃冰箱直接移入-80℃冰箱內(nèi)(至少24 h、降溫速率＜1.0℃/min)；第2步，至少24 h后，將樣本從-80℃冰箱移入液氮中。若保存時間預計在6個月內(nèi)，也可在-80℃冰箱中保存(不移入液氮中)；但若需長期保存(6個月以上)，則建議從-80℃冰箱移入-196℃液氮中長期保存。細胞復溫應采用快速融化的方法(37～40℃水浴箱)，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結晶對細胞造成損傷。

2 設備、器材與試劑

潔凈工作臺(千級)；

細胞培養(yǎng)儀器設備；

二甲基亞砜(分析純，推薦英、美產(chǎn)品)；

人血白蛋白；

磷酸鹽緩沖液(pH 7.25～7.35)；

低溫離心機(4℃)；

電子秤(精確到0.01 g)；

血漿擠壓器；

近年來，煙臺市接連實施三年荒山綠化、三年水系綠化、森林城市美麗煙臺建設等重點工程，林業(yè)生態(tài)建設邁出穩(wěn)健步伐。今年1月，市政府召開會議，印發(fā)《國土綠化提升三年攻堅行動實施方案》，在全市啟動實施國土綠化提升三年攻堅行動，明確至2020年，完成造林和生態(tài)修復32萬畝、森林撫育60萬畝，森林覆蓋率達到38%。市林業(yè)局組織各縣市區(qū)林業(yè)部門制定《國土綠化提升三年攻堅行動總體規(guī)劃（2018-2020）》和年度計劃，將任務分解落實到鄉(xiāng)鎮(zhèn)村莊。截至目前，全市完成造林11.68萬畝、森林撫育20萬畝，分別占省廳下達年度計劃的124%和100%，推動森林資源總量和質(zhì)量實現(xiàn)全面提升。

注射器推動器；

條碼機；

高頻熱合儀；

冰箱(4℃)；

采血袋；

冰塊冰凍袋；

低溫保存袋(耐-196℃低溫)；

低溫保存樣本盒(材質(zhì)泡沫塑料，2 cm厚，用前置4℃冰箱)；

液氮保存夾；

防凍手套；

倒置相差顯微鏡；

超低溫冰箱(-80℃)或程控降溫儀；

液氮容器；

恒溫水浴(35～40℃)振蕩器。

3 無菌培養(yǎng)室的準備

使用前將無菌培養(yǎng)室內(nèi)桌面、地面用消毒液擦拭；潔凈工作臺(千級)及無菌培養(yǎng)室用紫外線燈照射消毒30 min；潔凈工作臺內(nèi)空氣細菌培養(yǎng)結果應符合無菌標準。

4 造血干細胞低溫保存方法

(1)低溫保護劑配制:①DMSO-HES低溫保護劑配制為DMSO 0.1 L、12%HES 0.5 L(用磷酸鹽緩沖液配制)、20%人血白蛋白0.32 L、磷酸鹽緩沖液0.18 L。②DMSO 0.2 L、20%人血白蛋白0.4 L、磷酸鹽緩沖液0.40 L。

低溫保護劑配方有多種，推薦使用第1種，臨用前配制，置4℃冰箱待用。

(2)將收集的造血干細胞置4℃冰箱30 min。骨髓血和臍帶血造血干細胞樣本體積大，有核細胞含量也低；當體積＞100 mL，有核細胞低于10×109/L時，需對細胞體積和有核細胞進行適當濃聚。機器收集的外周血造血干細胞往往體積小，有核細胞含量高(如美國Bexter，CS3000-Plus血細胞分離機分離收集的外周血造血干細胞，體積常約為55 mL，有核細胞可達600×109/L)，則需要適當稀釋。低溫保存時最大有核細胞可為200×109/L。

骨髓血和臍帶血濃聚:骨髓血體積常有800～1 200 mL，而臍帶血體積常有150～200 mL。濃縮體積和細胞的方法是將骨髓血或臍帶血樣本注入采血袋，用熱合器熱合所有管道，放入4℃低溫離心機中，400 g離心10 min，用血漿擠壓器，去上清(濃縮體積，骨髓血至300 mL左右、臍帶血至80 mL左右，1 mL約等于1 g)，置4℃冰箱待用。

(3)在潔凈工作臺內(nèi)(室溫＜25℃)，將等量低溫保護劑緩慢加入造血干細胞懸液內(nèi)，用熱合器剪斷所有管道。

加低溫保護劑的方法有人工加樣或自動加樣(自動加樣器)。

人工加樣方法:①取出低溫保護劑，將低溫保護劑抽入注射器，并在注射器上連上頭皮針，排出空氣。②取出冰塊冰凍袋，將其放在搖床上固定，移入潔凈工作臺內(nèi)。③將裝有造血干細胞的袋平放于冰塊冰凍袋上，消毒造血干細胞袋的袋口邊連接處，將上述連有低溫保護劑的頭皮針插入造血干細胞袋連接處，緩慢將低溫保護劑注入造血干細胞中(時間約15 min左右)，充分混勻。

(4)將含低溫保護劑的造血干細胞分裝于低溫保存袋內(nèi)，每袋50～55 mL，小心排出袋內(nèi)所有氣泡，用高頻熱合儀封口，貼上條碼。條碼信息包括姓名、性別、年齡、住院號、樣本類型、保存日期，操作者簽名。置于4℃冰箱的樣本盒內(nèi)30 min。

(5)將低溫保存袋(含低溫保護劑的造血干細胞保存袋)移入程控降溫儀內(nèi)進行程序降溫，或?qū)⒌蜏乇４娲糜跇颖竞袃?nèi)，再將樣本盒置于-80℃冰箱內(nèi)進行非程控降溫。

5 造血干細胞復溫與輸注操作

(1)從-80℃冰箱或-196℃液氮中取出需要復溫的造血干細胞保存袋并核對條形碼。

(2)迅速將其投入40℃水浴中，不時搖動，盡量使樣本在水浴中均勻受熱，當袋內(nèi)無有形冰并為液態(tài)(內(nèi)部溫度約4℃)時取出。

(3)DMSO去除法。無菌條件下，將含2.5%人血白蛋白的5%右旋糖酐40溶液推注入解凍后的低溫保存袋內(nèi)，在4～10℃溫度下離心10 min，去除上清。如此重復1～2次，最后用上述溶液稀釋造血干細胞懸液至原有體積。洗滌時加液量比例:若DMSO為10%，加入造血干細胞懸液容量的2倍量溶液進行離心；若DMSO為5%或以下，加入等量溶液進行離心。有報道，1次洗滌可使DMSO含量下降到原來的1/6[44]。

(4)也可不洗滌直接應用。無菌條件下，用50 mL注射器抽出含低溫保護劑的造血干細胞，并給受者進行靜脈推注，也可直接將保存袋內(nèi)細胞輸注給受者。

(5)細胞復溫后或洗滌后至靜脈推注或輸注入患者體內(nèi)的時間盡量在20 min內(nèi)完成；如果含有塊狀物，用孔徑約40 μm的濾器過濾，但濾器孔徑不能太小，以避免造血干細胞損失。注意避光并觀察患者是否有不良反應。

(6)檢測項目包括細胞涂片形態(tài)分析、細胞計數(shù)、臺盼藍活體染色、CD34+細胞計數(shù)、微生物(細菌和真菌)培養(yǎng)、造血干細胞培養(yǎng)。

(7)填寫實驗報告。

6 注意事項

(1)各種器材和試劑均應購于符合國家標準、有相關批文的企業(yè)，標有生產(chǎn)廠家、名稱、出廠日期、生產(chǎn)批準文號及有效期。

(2)每一步工作，包括離心、擠壓、血漿去除、標志和冰凍都應盡量快和就近而無菌操作。每一步驟均應有2人或2人以上進行操作，并核對條形碼編號。每步實驗都有操作者及復核者的簽名。

(3)每年至少1次質(zhì)量檢查，確保造血干細胞活性與分化能力。

(4)實驗室、冰箱、儲存罐有實時的溫濕度監(jiān)控與報警系統(tǒng)(采用電話、電郵方式)。

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Protocol for cryopreservation and thawing of hematopoietic stem cells(for discussion)

SHEN Jianliang1，HAN Ying2，HUANG Youzhang1
(1.Department of Hematology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Beijing Institute of Blood Transfusion，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100039，China)

The efficacy of cryopreservation of hematopoietic stem cells was influenced by a lot of factors，such as temperature，cooling rate，cell concentration，cryopreservative，thawing procedure，preserved period and measurement of cell functionalities.There were some differences in technology and methodology between research centers in the world，so the results from their publications could be poorly compared with each other and had a weak potency in evidence-based medicine.Except for the established protocol for cryostorage of mobilized peripheral blood(MPB)hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells(HSC/HPC)and bone marrow(BM)HSC/HPC in Joint Accreditation Committee of International Stem Cell Transplantation(ISCT)Europe and European Bone Marrow Transplantation(EBMT)(JACIE)guidelines，there was no guideline in China and the world.With the help of our experiences(for many years in cryomedical field)and related literatures we have drawn up this protocol for cryopreservation and thawing of hematopoietic stem cells suited for petty bank in hospital.Any comments or revisions will be welcome.

Hematopoietic stem cells；Cryopreservation；Thawing

R329

A

2095-3097(2015)05-0316-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.05.017

2014-08-25 本文編輯:張在文)

100048北京，海軍總醫(yī)院血液科(沈建良，黃友章)；100039北京，軍事醫(yī)學科學院北京輸血研究所(韓 穎)