DOI：10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2015.03.17

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81200151，81200708）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2011BAI11B20）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2013KTCL03－01）

作者單位：710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科（孫　萌、段維勛、劉金成、俞世強(qiáng)、梁宏亮、金振曉），郵編城市名，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心臟內(nèi)科（孫　萌）

通訊作者：梁宏亮，Dr.lianghongliang@hotmail.com

1　背景

傳統(tǒng)學(xué)術(shù)觀點(diǎn)將心臟定義為一種終末分化的“靜止”器官，因檢測不到進(jìn)行有絲分裂的心肌細(xì)胞，所以認(rèn)為心臟在人出生后就無法再生出新的心肌細(xì)胞，心肌組織處于永恒的生長阻滯中。然而也有科學(xué)家提出：假如心肌細(xì)胞不能夠再生，那么出生后不斷生長的心臟，或由疾病造成的心臟質(zhì)量與體積的增加就只能夠通過單個(gè)細(xì)胞質(zhì)量與體積增加（細(xì)胞肥大）解釋。但研究表明單細(xì)胞的質(zhì)量、體積變化總和遠(yuǎn)不能和整體心臟的質(zhì)量、體積變化匹配。事實(shí)上，心臟生長的原因不只是心肌肥大，更多是由心肌細(xì)胞數(shù)量增加造成的 ［1］。2009年Science報(bào)道科學(xué)家使用同位素標(biāo)記方法證明：人類每年心肌細(xì)胞以1%左右的速度進(jìn)行更新，健康人一生中約45%的心肌細(xì)胞來源于后天再生 ［2］。因此，雖然心肌細(xì)胞極少有絲分裂，但成體心臟一定存在新生心肌細(xì)胞來源。研究顯示心臟中存在一定數(shù)量的具有自我更新與分化能力的心臟干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSCs）是心肌細(xì)胞再生的重要來源 ［3］。這顛覆了心臟是終末分化的“靜止”器官的舊觀點(diǎn)，表明心臟可自我更新、再生。也使人們逐漸認(rèn)識(shí)到CSCs在心臟生理穩(wěn)態(tài)維持與病理再生修復(fù)中的關(guān)鍵作用，令研究CSCs成為國際熱點(diǎn)。特別是Lancet報(bào)道已將CSCs應(yīng)用于缺血性心臟的臨床治療，取得了良好療效，為此類患者的治療帶來了新的希望 ［4－5］。本文就CSCs的基本性質(zhì)與臨床應(yīng)用做以綜述。

2　心臟干細(xì)胞的分類與來源

Bergmann研究 ［2］發(fā)現(xiàn)在年輕人心肌細(xì)胞更新率為1%／年，老年人0.5%／年。CSCs理論上是心肌再生和間質(zhì)細(xì)胞再生的來源之一。CSCs具有自我更新、克隆形成、多種分化潛能干細(xì)胞的特性，并且在體內(nèi)、外能分化成心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。據(jù)CSCs表面的標(biāo)志和來源不同CSCs可分為：c－kit ＋／Lin CSCs ［6］、Sca－1 ＋CSCs ［7－8］、lsl1 ＋CSCs ［9］、側(cè)群CSCs（the cardiac side population） ［10－11］、SSEA－1 ＋CSCs ［12］、心外膜來源干細(xì)胞（Epicardium－derived cells） ［13］等類型。這些不同種類的CSCs之間存在一定的交叉，表達(dá)不同標(biāo)志物的CSCs可能是同一種CSCs，或是CSCs發(fā)育不同階段表達(dá)的不同標(biāo)志物，也可能是不同的CSCs特有的標(biāo)志。Quaini等 ［14］通過性別錯(cuò)配心臟移植的實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為心臟干細(xì)胞來源于骨髓。但隨著研究的進(jìn)一步深入，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSCs來自心臟，成體心臟存在心臟干細(xì)胞巢 ［15］。CSCs可被發(fā)現(xiàn)于心房、心室、房室溝、心外膜 ［16－18］，但分布不均勻，分布與組織所承受的壓力成反比 ［19］，心房多于心室 ［20］。Itzhaki－Al?fia等 ［21］的研究顯示從患者右心耳分離出來的ckit ＋CSCs多于心臟其他部位。

3　心臟干細(xì)胞的分離與擴(kuò)增

分離、培養(yǎng)獲取可用于治療的足夠數(shù)量CSCs是臨床應(yīng)用的主要瓶頸之一。目前分離CSCs主要包括經(jīng)皮心內(nèi)膜心肌活檢法和外科手術(shù)法。外科手術(shù)方法最常獲取右心耳組織，相對(duì)安全，c－kit ＋／Lin －CSCs含量較多 ［21］。但由于開胸創(chuàng)傷大，應(yīng)用比較局限。經(jīng)皮心內(nèi)膜心肌活檢技術(shù)在臨床較常應(yīng)用，創(chuàng)傷性小，安全性高，較易于患者接受，且不易受疾病類型的影響。不足之處是獲取組織量相對(duì)有限。但隨著分離、培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，即使少量組織量也能擴(kuò)增獲得治療量的CSCs ［22］。目前的培養(yǎng)擴(kuò)增的方法有：在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子；培養(yǎng)條件預(yù)處理，如缺氧環(huán)境下，CSCs開始表達(dá)一些利于存活的信號(hào)蛋白和生血管因子，如血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子－1α、CXCR4等 ［23］。Tang等 ［24］研究表明，缺氧預(yù)處理提高了CSCs對(duì)心肌梗死的療效。

4　心臟干細(xì)胞的移植途徑與示蹤

CSCs的存在使心臟像肝臟、腦和皮膚組織一樣具有再生功能和自我修復(fù)能力。在動(dòng)物急、慢性心肌梗死，缺血性心肌病模型中，自體或異體CSCs經(jīng)過體外分離、培養(yǎng)、增殖后，可通過不同途徑進(jìn)行移植并具有各自的特點(diǎn)：①靜脈內(nèi)注射：無創(chuàng)且易操作，但細(xì)胞輸送效率低，大量移植細(xì)胞滯留于心臟外組織 ［25］，且CSCs的全身分布與影響不清楚；②心肌內(nèi)注射：避免開胸，比經(jīng)動(dòng)靜脈輸注所需干細(xì)胞數(shù)量少，經(jīng)超聲或肌電圖引導(dǎo)下經(jīng)皮以導(dǎo)管為基礎(chǔ)的心肌內(nèi)注射，肌電圖可描繪和分辨瘢痕組織及存活的心肌，因此可直達(dá)目標(biāo)部位；但由于采用心臟手術(shù)方式的侵入性操作存在術(shù)中和術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)且需特殊導(dǎo)管和影像技術(shù) ［26］；③冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射：可于第一時(shí)間內(nèi)在梗死部位及其周邊區(qū)域移植最大限度的干細(xì)胞，但輸送的有效性不確定，有發(fā)生栓塞的風(fēng)險(xiǎn)；④開胸心外膜注射：外科手術(shù)中在直視下注入CSCs，但創(chuàng)傷較大存在手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；注入體內(nèi)CSCs的示蹤方法有：①放射標(biāo)記物標(biāo)記后通過PET和SPECT定位；②鐵粒子標(biāo)記，通過MRI觀察；③基因標(biāo)記如生物熒光，進(jìn)行在體熒光成像。

5　心臟干細(xì)胞修復(fù)心臟的機(jī)制

CSCs具有自我更新，集落生長和多潛能等特性，在心梗動(dòng)物模型在體實(shí)驗(yàn)中顯示具有大量再生的潛力 ［27］，能分化成為心肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前，c－kit ＋CSCs被認(rèn)為是心肌再生治療的最合適的細(xì)胞類型。其對(duì)心臟穩(wěn)態(tài)的維持及損傷修復(fù)的機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：一是直接分化機(jī)制 ［24］，c－kit ＋內(nèi)源性CSCs對(duì)損傷的心肌有很強(qiáng)的趨向性，移植到受損心臟后可以分化成心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，通過增加心臟功能細(xì)胞的數(shù)量或者來自細(xì)胞間的協(xié)同作用，從而改善心臟功能。有實(shí)驗(yàn)證明長期培養(yǎng)CSCs ［28］，可上調(diào)GATA－4表達(dá)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞分化能力，證明高表達(dá)GATA－4／c－kit ＋CSCs有很強(qiáng)的心臟再生潛力。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)中的β1整合素可通過MAPK通路調(diào)節(jié)CSCs的存活，也可以通過Rho及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)影響CSCs分化中Cx40和Cx43的表達(dá)。另外，梗死灶邊緣的殘存心肌細(xì)胞可通過細(xì)胞間連接與CSCs建立聯(lián)系，傳遞終末分化信息，誘導(dǎo)其向心肌方向分化，并有利于實(shí)現(xiàn)其與周圍心肌同步舒縮。二是通過自分泌和旁分泌機(jī)制 ［24］分泌促血管生成及保護(hù)心臟的多種生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、胰島素樣生長因子1 （IGF－1）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、可溶性血管細(xì)胞黏附分子1（sVCAM－1）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 ［27］。當(dāng)c－kit ＋CSCs與成熟心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí) ［29］，由于上調(diào)VEGF、IGF－1表達(dá)，通過激活A(yù)kt信號(hào)通路，可以增加CSCs數(shù)量，增強(qiáng)心肌細(xì)胞存活能力，當(dāng)ckit ＋CSCs植入心肌梗死大鼠心臟后 ［28］，可分化成心肌細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生許多新的再生心肌，促進(jìn)心臟功能的修復(fù)，從而改善心功能。目前的研究表明，IGF－1和VEGF是特殊的生長因子，可增加培養(yǎng)基營養(yǎng)，從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞存活能力。其中sVCAM－1 ［30］被認(rèn)為是主要的旁分泌信號(hào)因子之一，通過激活A(yù)kt，ERK，p38 MAPK等蛋白激酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和CSCs的遷移及血管生成，在氧化應(yīng)激的條件下，預(yù)防心肌細(xì)胞死亡，保護(hù)心臟，其在對(duì)心臟損傷的修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用。旁分泌的細(xì)胞因子有抗凋亡作用，從而改變細(xì)胞外基質(zhì)，吸引更多內(nèi)源性CSCs。但細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化和長期存活非常有限。需要指出的是旁分泌作用包括兩個(gè)不同的效應(yīng)：第一個(gè)是體液刺激內(nèi)源性再生，第二個(gè)是保護(hù)現(xiàn)有的細(xì)胞 ［31］。多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c－kit ＋CSCs對(duì)心臟穩(wěn)態(tài)的維持及損傷修復(fù)機(jī)制中的旁分泌作用大于心臟干細(xì)胞的直接分化作用 ［27］。此外，活化的CSCs通過細(xì)胞融合對(duì)損傷的冠脈血管修復(fù)也起一定的作用。

6　心臟干細(xì)胞的臨床應(yīng)用

CSCs具有定向分化心臟細(xì)胞的特性且致瘤率低，自體移植后不存在免疫排斥反應(yīng)和倫理道德問題且可凍存，重復(fù)多次使用。這些特點(diǎn)更適合應(yīng)用于臨床治療。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，c－kit ＋CSCs可改善心肌梗死后的左室功能紊亂，生成新的心肌細(xì)胞從而增加心肌細(xì)胞的數(shù)量及局部毛細(xì)血管密度，改善局部缺血心肌細(xì)胞的血液供應(yīng)，修復(fù)缺血受損的心肌細(xì)胞，改善心臟收縮、舒張末期的容積從而抑制心室重構(gòu)，改善左室射血分?jǐn)?shù)和血流動(dòng)力學(xué)，提高心臟功能，從根本上達(dá)到治療缺血性心肌病的目的。盡管如此，CSCs移植入人體內(nèi)的有效性還是不太明確的。2009年2月，Bolli等 ［4］人開始了自體CSCs移植治療缺血性心肌病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（SCIPIO）?；颊叩募{入標(biāo)準(zhǔn)為心肌梗死后、射血分?jǐn)?shù)≤40%且接受過冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)。實(shí)驗(yàn)方法是手術(shù)后4個(gè)月的患者經(jīng)冠脈內(nèi)重新移植從右心耳分離出的自體性心臟干細(xì)胞，對(duì)照組沒有接受治療。在A階段，對(duì)治療組的9位患者與對(duì)照組的4位患者進(jìn)行連續(xù)性評(píng)估自體CSCs移植后的短期安全性和可行性。在B階段，患者以2∶3的比例使用劃分為5塊大小的隨機(jī)性方案納入治療組和對(duì)照組。納入后評(píng)估其連續(xù)時(shí)間內(nèi)的安全性和有效性的終點(diǎn)事件。結(jié)果顯示81例患者中，80例患者自體性CSCs成功分離并擴(kuò)增。16位治療組的患者沒有觀察到不良反應(yīng)。三維心臟超聲顯示移植CSCs后4個(gè)月左室射血分?jǐn)?shù)從（30.3±1.9）%增至（38.5±2.8）%，局部室壁運(yùn)動(dòng)得到改善，且患者生活質(zhì)量有了一定的提高。相反地，對(duì)照組7位患者在相應(yīng)的間隔時(shí)間內(nèi)沒有明顯地改變。更重要的是自體CSCs移植1年后左室射血分?jǐn)?shù)較前提高了（12.3±2.1）%，對(duì)心臟功能有更顯著的改善作用。7位治療組的患者通過心臟MRI顯像心肌梗死面積在4個(gè)月減少了23.8%，1年減少了30.3%。因此，SCIPIOⅠ階段實(shí)驗(yàn)證明通過冠脈內(nèi)移植自體CSCs治療缺血性心肌病是可行、安全的，治療1年后可以明顯改善左室收縮功能，取得一定的臨床療效。SCIPIOⅡ階段需要對(duì)自體CSCs移植提供大量的臨床數(shù)據(jù)，為指導(dǎo)臨床治療提供有效的依據(jù)。2009年5月，Makkar等 ［5］人開始了（CADUCEUS）自體CSCs移植逆轉(zhuǎn)左室功能紊亂的前瞻性、隨機(jī)性研究。患者納入標(biāo)準(zhǔn)為心肌梗死后2至4周且左室射血分?jǐn)?shù)為25%～45%。以2∶1的比例隨機(jī)分配患者接受自體CSCs移植治療或標(biāo)準(zhǔn)治療。Ⅰ階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自體CSCs移植24 h后沒有并發(fā)癥，治療6個(gè)月后射血分?jǐn)?shù)提高且沒有患者死亡或發(fā)展心臟腫瘤等副作用。自體CSCs移植治療6個(gè)月，12個(gè)月后與對(duì)照組相比，心臟MRI提示瘢痕質(zhì)量占左室質(zhì)量從基礎(chǔ)值24%分別減少7.7%，12.3%（P＝0.001），對(duì)照組僅減少0.3%，2.2%。同時(shí)增加了有效的心臟質(zhì)量（P＝0.01），局部收縮力（P＝0.02）和局部收縮厚度（P＝0.015）。提示自體CSCs移植治療后可以減少心肌梗死面積，刺激健康心肌組織的再生長的同時(shí)改善局部室壁運(yùn)動(dòng)。雖然有兩項(xiàng)臨床研究證明骨髓干細(xì)胞治療可以減少心肌梗死面積，但CSCs治療比其治療效果更明顯。盡管如此，CSCs治療的有效性仍需要大規(guī)模的臨床研究。

7　結(jié)語

雖然針對(duì)CSCs已有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，但目前的結(jié)果并不能滿足臨床的需要，還有很多問題有待解決：CSCs是否受到疾病狀態(tài)的影響？CSCs在不同分化階段是同一細(xì)胞類型嗎？CSCs的移植方式和最佳時(shí)機(jī)的選擇？CSCs自身的穩(wěn)態(tài)平衡及動(dòng)態(tài)變化是如何調(diào)控的？如何使用有效的方法獲得足夠數(shù)量的高純度CSCs？如何提高CSCs移植后的存活率、增殖能力及分化率？如何最有效地追蹤C(jī)SCs移植后的命運(yùn)？目前對(duì)于CSCs治療缺血性心肌病的機(jī)制存在爭議，更多證據(jù)傾向于旁分泌機(jī)制，但具體的信號(hào)通路及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討和完善。雖然有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明自體CSCs移植具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但開展的臨床試驗(yàn)仍較少且觀測時(shí)間不夠長，缺少大樣本量的臨床試驗(yàn)，這些都需要更進(jìn)一步的研究和論證。