■馬 根趙 巍崔俊濤

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉農(nóng)博瑞奶牛研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春 130118)

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人口的迅速增長(zhǎng)，資源、環(huán)境和人口已經(jīng)被國(guó)際社會(huì)公認(rèn)為是影響人類(lèi)可持續(xù)發(fā)展的三個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。所以，資源和環(huán)境問(wèn)題是當(dāng)今面臨的最主要的挑戰(zhàn)，尋找再生能源替代不可再生能源是應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的惟一途徑[1]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈是我國(guó)豐富的可再生資源，但是每年大部分的秸稈被焚燒和廢棄，尤其是在東北地區(qū)，不僅造成資源的浪費(fèi)，同時(shí)也造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，開(kāi)發(fā)高效利用纖維素類(lèi)可再生資源的微生物技術(shù)，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)人類(lèi)急需的燃料、飼料及化工產(chǎn)品，具有極其重要的意義和發(fā)展前景。目前，對(duì)纖維素的降解利用的有效手段就是采用微生物降解，利用纖維素降解菌可將纖維素轉(zhuǎn)化為飼料、化工原料等[1]，以便動(dòng)物更好地利用。所以篩選具有高活性纖維素酶的秸稈降解微生物的菌株已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，本研究旨在篩選一株高活性的纖維素降解菌，從而有效分解纖維素，提高秸稈中的糖含量和蛋白含量，從而提高秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

綿羊瘤胃液：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；腐敗樹(shù)葉：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)樹(shù)林；土壤：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)院內(nèi)地下10 cm處；堆肥牛糞：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)。

1.2 培養(yǎng)基[2-4]

種子培養(yǎng)基：蛋白陳10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖10.0 g、牛肉膏5.0 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.2，121℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基[羧甲基纖維素(CMC)培養(yǎng)基]：CMCNa 15.0 g、NH4NO31.0 g、酵母膏 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g、蒸餾水1 000 ml、瓊脂15.0 g，pH值自然，121℃滅菌20 min。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 15.0 g、NH4NO31.0 g、酵母膏1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 纖維素降解菌的富集

取收集的來(lái)自不同分離源樣品10 g于250 ml的三角瓶中，加入100 ml無(wú)菌水和滅菌的小玻璃珠數(shù)粒，28℃ 120 r/min振蕩30 min，使其充分混合均勻，然后取1 ml上清液接種至羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d。

1.3.2 纖維素降解菌的分離和純化[5]

將富集后的培養(yǎng)液取1 ml進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮?0-4～10-6培養(yǎng)液涂布于羧甲基纖維素鈉固體分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～5 d，然后選取單個(gè)菌落在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如此反復(fù)直到菌落形態(tài)一致。將分離純化后的菌株接種至固體羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，加入適量剛果紅染色液染色1 h，然后用生理鹽水進(jìn)行沖洗，根據(jù)水解圈的大小，初步篩選出降解纖維素能力較強(qiáng)的菌株。

1.4 纖維素酶酶活的測(cè)定

1.4.1 粗酶液的制備[6]

將得到的纖維素降解菌接種至液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d，然后接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取培養(yǎng)液3 000 r/min、4℃離心10 min，上清液用于酶活的測(cè)定。

1.4.2葡萄糖曲線的繪制[7]（見(jiàn)表1）

表1 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的繪制

將各管搖勻后，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即用流動(dòng)的冷水降溫，再以蒸餾水定容至25 ml，在540 nm波長(zhǎng)下，以0號(hào)管調(diào)0測(cè)定光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖 1)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.3 纖維素酶酶活的測(cè)定

纖維素酶活性的測(cè)定，參考文獻(xiàn)[8-9]介紹的DNS法測(cè)定纖維素酶酶活。

計(jì)算纖維素酶酶活的公式如下：

式中：X——纖維素酶酶活（IU/ml）；

W——從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖的含量(mg)；

N——酶液稀釋總倍數(shù)；

T——反應(yīng)時(shí)間(min)；

M——樣品體積(ml)[10]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)EXCEL表整理數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

通過(guò)分離純化，從4種分離源中分離得到4株纖維素降解菌，并進(jìn)行斜面保存。

2.2 菌株鑒定

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，4株菌菌落在PDA平板上生長(zhǎng)初期為白色，待長(zhǎng)出青綠色孢子后，孢子會(huì)向四面散射,在平板上形成許多菌落,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),孢子變成暗綠色。菌落絨狀,中心稍微隆起,邊緣整齊,背面淡黃色。同時(shí)結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]和《真菌鑒定手冊(cè)》[12]初步確定分離到的4株菌為真菌。

2.3 不同來(lái)源纖維素降解菌纖維素酶酶活的比較（見(jiàn)圖2及表2）

圖2 不同來(lái)源纖維素降解菌酶活的比較

表2 不同來(lái)源纖維素降解菌酶活的比較

通過(guò)表2和圖2可以看出，從不同來(lái)源分離到的4株菌產(chǎn)纖維素酶的能力差異較大，其中從腐敗的樹(shù)葉中分離到的纖維素降解菌的酶活性最強(qiáng)，其次為堆肥的牛糞中，再次為土壤、瘤胃液，而且從腐敗的樹(shù)葉中分離到的纖維素降解菌產(chǎn)纖維素酶的能力差異極顯著高于其他3株纖維素降解菌。

3 討論

纖維素降解菌可以降解纖維素，用于纖維素降解菌分離的方法有很多，而本文采用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，然后用剛果紅染色法進(jìn)行鑒別，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物[13]，而纖維素被纖維素降解菌降解為葡萄糖利用后很容易使剛果紅染料脫落游離后產(chǎn)生透明圈,所以通過(guò)產(chǎn)生透明圈可以初步判定有纖維素酶的產(chǎn)生，同時(shí)能利用以纖維素為唯一碳源的菌種可初步判定為纖維素降解菌。自然界中存在的纖維素降解菌對(duì)纖維素的降解能力差異較大，本研究表明，透明圈的大小和纖維素酶酶活成正比。圖3為腐敗樹(shù)葉中分離得到的纖維素降解菌，透明圈較大，進(jìn)一步測(cè)定其產(chǎn)物中的酶活，它所產(chǎn)生的纖維素酶酶活極顯著高于其他來(lái)源的纖維素降解菌。

圖3 腐敗樹(shù)葉中分離的纖維素降解菌

4 結(jié)論

通過(guò)比較不同分離源分離到的4株菌的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從腐敗的樹(shù)葉中分離到的纖維素降解纖維的能力最強(qiáng)，纖維素酶酶活達(dá)到35.62 IU/ml。