■魏 振 柯 靜 崔荷楓 周峻明 張博宣 劉恬麟 蘭 月 姚貝貝 龍 淼

（沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113112）

芽孢桿菌屬的一些菌株對(duì)動(dòng)物和人類具有廣泛的作用而被認(rèn)為是益生菌[1]。芽孢桿菌最重要的特性是其在一定條件下形成芽孢，具有穩(wěn)定性和不易喪失活性。芽孢桿菌屬的一些菌株在哺乳動(dòng)物的糞便和回腸內(nèi)均被檢測(cè)到[2-4]。芽孢桿菌的最基本特性包括它能夠在腸道存活并繁殖，形成芽孢，并分泌一些抗菌物質(zhì)[5-6]。芽孢桿菌的一些菌株被歐洲食品安全局授權(quán)可以作為微生態(tài)制劑添加于飼料和食品中，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌被認(rèn)為是安全有效的菌株[7]。這些菌株具有促進(jìn)生長(zhǎng)、促進(jìn)飼料利用率和促進(jìn)消化系統(tǒng)的健康等作用。這主要與其產(chǎn)生多種蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等生物活性物質(zhì)有關(guān)，同時(shí)還可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌等都有抑制作用，其微生態(tài)制劑在醫(yī)藥和畜牧養(yǎng)殖方面有較高的應(yīng)用價(jià)值[8]。

地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力的菌種之一。地衣芽孢桿菌在植物病害防治、飼料加工、醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境污染治理等方面具有廣泛的應(yīng)用[9]。目前很多芽孢桿菌已從很多種動(dòng)物腸道中分離鑒定出來(lái)，并作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于豬[10-11]、牛[12-13]、羊[14]、家禽[15-16]、家兔[17-18]等動(dòng)物上，作用效果也已得到證實(shí)。由于菌株的來(lái)源不同、生存環(huán)境不同，從不同動(dòng)物胃腸道分離鑒定的菌株，最好應(yīng)用于其來(lái)源相同的動(dòng)物上，才能發(fā)揮其最高的生物學(xué)活性。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)家兔腸道分離鑒定出具有益生作用的芽孢桿菌菌株，初步研究其生物學(xué)特性，進(jìn)而為研制家兔微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PCR Mix試劑盒、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司，PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基及改良GAM肉湯購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；生化試劑、微量生化管等均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液（自配）；家兔購(gòu)自沈陽(yáng)某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離

無(wú)菌采取家兔腸道內(nèi)容物，分段收集腸道內(nèi)容物（十二指腸、空腸、回腸和盲腸），用無(wú)菌棉簽沾取腸道內(nèi)容物，迅速將其加入到含有20 ml滅菌水的滅菌三角瓶?jī)?nèi)，搖動(dòng)片刻，然后小火加熱至懸液沸騰，維持2 min。而后靜止5 min，吸取上層液0.1 ml，涂布于LB固體培養(yǎng)基，用封口膜將平皿封好，倒置于厭氧培養(yǎng)罐中，迅速放入?yún)捬醮⑸w好蓋，厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，于改良GAM肉湯進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)特性，進(jìn)行革蘭氏染色，選取疑似芽孢桿菌的菌株進(jìn)行生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2 生化鑒定

將改良GAM肉湯培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移接種于生化反應(yīng)管，根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司《細(xì)菌微量生化反應(yīng)管使用說(shuō)明書》觀察反應(yīng)結(jié)果。主要鑒定項(xiàng)目：耐鹽能力測(cè)定、運(yùn)動(dòng)性測(cè)定、需氧性測(cè)定、油脂水解試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、亞甲基藍(lán)還原試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、過(guò)氧化氫試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)。

1.2.3 16S rRNA序列測(cè)定及同源性分析

16S rRNA序列引物采用通用引物：采用通用引物 ：27f：5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’；1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’；分離株進(jìn)行基因組DNA提取，基因組DNA的提取采用生工柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提取，操作方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)，以提取的菌株基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rRNA序列，體系為30 μl體系模板1 μl，上游引物和下游引物各1 μl，PCR Mix 15 μl，剩下由無(wú)菌水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：PCR條件：95℃5 min，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)序由上海生物工程技術(shù)有限公司純化和測(cè)序。序列的數(shù)據(jù)處理。測(cè)序結(jié)果在NCBI使用Blast比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得與菌株16S rDNA源的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，使用Clustal X 1.8把不同的序列對(duì)齊后，使用 DNAman5.1構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 耐酸性試驗(yàn)

將 100 ml/瓶的改良GAM肉湯用0.10 mol/l的鹽酸調(diào) pH 值分別為 2、3、4，分別取 5 ml分裝于試管中，每個(gè)梯度做兩個(gè)平行，121℃滅菌15 min冷卻，接種活化的體積分?jǐn)?shù)為10%的地衣芽孢桿菌菌液，37℃恒溫培養(yǎng)每隔2 h用無(wú)菌生理鹽水以10倍依次遞減稀釋，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)0～6 h的活菌變化情況。

1.2.5 耐高溫試驗(yàn)

將GAM肉湯中的芽孢桿菌生長(zhǎng)末期已完全形成芽孢的培養(yǎng)物分別在 60、70、80、85、90、95、100、121℃水浴中處理后，迅速流水冷卻，然后采用稀釋平板法測(cè)定芽孢存活率[19]。

1.2.6 耐膽鹽試驗(yàn)

在LB液體培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%，121℃、15 min滅菌備用，菌種按體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接種，37℃厭氧培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)變化情況[19]。

1.2.7 安全性檢測(cè)

進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，采用腹腔注射法：刮取平板上純培養(yǎng)的菌苔，以無(wú)菌生理鹽水制成濃度為5.0×109CFU/ml的菌懸液，設(shè)置空白組合對(duì)照組，每組共10只小鼠。每只健康成年昆明小鼠一次性腹腔注射0.3 ml，連續(xù)觀察7 d。記錄觀察期間小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況，如與對(duì)照組相比未觀察到受試小鼠有毒性反應(yīng)及引起死亡，則判定待檢菌株無(wú)毒性。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征

菌株在GAM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，24 h形成直徑為4～5 mm左右大小的圓形菌落，白色而有光澤，表面濕潤(rùn)、平坦、邊緣整齊，如圖1。油鏡觀察：24 h后進(jìn)行鏡檢，菌株菌體形態(tài)為長(zhǎng)桿狀，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，如圖2所示。

圖1 WZ01在GAM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)

圖2 WZ01菌株鏡檢涂片(10×100倍)培養(yǎng)48 h

2.2 生理生化特征

生理生化鑒定見表1，將上述鑒定結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上關(guān)于芽孢桿菌的描述及其他一些生化特性相對(duì)照，該分離株可初步判定為地衣芽孢桿菌。

表1 WZ01生理生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA序列測(cè)定及同源性分析結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明，所用引物所擴(kuò)增的菌株WZ01的16S rRNA片段長(zhǎng)度為1 452 bp（見圖3）。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果已呈送GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中并被收錄，收錄號(hào)為：KP696780。用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明：分離菌株與GenBank中發(fā)表的Bacillus licheniformisstrain NJ-5（登錄號(hào)FJ435674.1）和Bacillus licheniformisstrain CCMMB907（登錄號(hào)KF 879261.1）16S rRNA同源性均達(dá)到99%。用DNAStar軟件對(duì)WZ01菌株基因與GenBank中已公布的序列比對(duì)分析，生成系統(tǒng)發(fā)生樹，由圖4和圖5可知，WZ01菌株與Bacillus licheniformisstrain 2-20菌株屬于同一分支，核苷酸同源性最高，達(dá)到99.6%，與另一分支的地衣芽孢桿菌DHXJ13、bC37、D50的核苷酸同源性分別為98.8%、99%和99.4%。確定分離菌株為Bacillus licheniformis，命名為Bacillus licheniformisWZ01。

2.4 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

微生態(tài)制劑要發(fā)揮益生作用就必須通過(guò)胃部、進(jìn)入腸道，胃液中含有酸及各種酶類，檢驗(yàn)益生菌株對(duì)酸性耐受性非常必要。人和動(dòng)物空腹時(shí)胃液的pH值在0.9～1.8之間，進(jìn)食過(guò)程中在1.8～5.0之間波動(dòng)，通常維持在3.0左右。將菌株在不同酸性培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，該菌株具有很強(qiáng)的耐酸性。

圖3 WZ01菌株P(guān)CR電泳圖

圖4 WZ01基因系統(tǒng)發(fā)生樹

圖5 WZ01菌株與參考株序列同源性分析

表2 WZ01酸耐受能力（lgN/ml)

2.5 耐高溫結(jié)果

如圖6所示，菌株WZ01具有一定的耐熱性，但是相對(duì)較差，當(dāng)處理溫度低于80℃時(shí)，芽孢存活率保持100%，而隨著處理溫度的進(jìn)一步上升，芽孢存活率則急劇下降，100℃處理15 min后，存活率僅為4.5%，在121℃處理14 min存活率為0。

圖6 溫度對(duì)WZ01菌株活性的影響

2.6 膽鹽耐受性

益生菌對(duì)于膽鹽的抗性是其能夠在腸道存活、生長(zhǎng)并發(fā)揮功效的先決條件之一。膽鹽對(duì)菌株的抑制作用取決于膽鹽的濃度和菌株本身的特性,動(dòng)物小腸中膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%之間波動(dòng)。能夠在正常生理膽鹽濃度中生長(zhǎng)和代謝的菌株才可能在腸道消化過(guò)程中存活，結(jié)果見表3。WZ01在豬膽鹽濃度為0.30%時(shí)還能夠生長(zhǎng)，具有優(yōu)良的耐膽酸鹽能力。

表3 WZ01在不同濃度膽鹽中的生長(zhǎng)情況

2.7 安全性檢測(cè)

對(duì)腹腔注射的昆明小鼠連續(xù)觀察7 d并未見到中毒癥狀及死亡情況。剖檢后也未見任何病理變化，未從各臟器培養(yǎng)出該菌。各對(duì)照組均正常。試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離芽孢桿菌菌株沒(méi)有致病性。

3 討論

近年來(lái)，不少研究學(xué)者從土壤、糞便及不同動(dòng)物腸道中分離鑒定出地衣芽孢桿菌，但從家兔腸道中分離鑒定出地衣芽孢桿菌并研究其生物學(xué)特性還尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果可以進(jìn)一步證實(shí)，家兔腸道中存在地衣芽孢桿菌。但從家兔腸道內(nèi)分離鑒定的地衣芽孢桿菌在家兔腸道是常在菌還是路過(guò)菌及在兔腸道內(nèi)主要的功能還有待于進(jìn)一步研究。肉兔消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)不同于豬、牛、羊、家禽，有它固有的消化生理特點(diǎn)和免疫特性[17]，因此，進(jìn)一步需研究其對(duì)肉兔腸道發(fā)育、免疫功能、生長(zhǎng)性能等影響，為其進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論參考與科學(xué)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從健康兔腸道內(nèi)分離到一株芽孢桿菌，經(jīng)形態(tài)培養(yǎng)觀察、革蘭氏染色和16S rRNA序列分析，確定其為地衣芽孢桿菌。通過(guò)菌株的耐酸性、耐膽鹽、耐高溫和安全性試驗(yàn)，初步得出結(jié)論，該分離株具有益生作用，為制備兔用微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。