■胡水鑫 王驥騰 韓 濤 李新宇 姜宇棟

（浙江海洋學(xué)院，浙江舟山 316000）

三疣梭子蟹主要分布于亞洲東部海岸[1]。由于其高的市場(chǎng)需求和市場(chǎng)價(jià)格，在中國東部沿海被廣泛的養(yǎng)殖。因此，在過去的數(shù)十年中，三疣梭子蟹的育苗技術(shù)得到了極大的進(jìn)步[1]。

眾所周知，二十碳五烯酸(EPA，20∶5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6n-3)是n-3系列高不飽和脂肪酸（n-3 HUFA），他們是細(xì)胞膜重要的結(jié)構(gòu)和生理部件，在生物膜的滲透性、酶的活性和生物膜中的其他功能上扮演著重要的角色[2-5]。因此，近些年越來越多的研究開始關(guān)注這些脂肪酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生理機(jī)能所產(chǎn)生的影響。相比于那些擁有將亞麻酸(LNA,18∶3n-3)轉(zhuǎn)化為DHA和EPA能力的淡水動(dòng)物，海水動(dòng)物需要從食物中獲得這些脂肪酸，這是因?yàn)楹Ｋ畡?dòng)物缺乏合成n-3 HUFA過程中所必需的去飽和酶和碳鏈延長(zhǎng)酶[6-7]。

一般來說，海水魚類需要從食物（干物質(zhì)）中獲得0.5%～2.0%的n-3 HUFA用于維持正常的生長(zhǎng)和生理功能[8]。而且，對(duì)于n-3 HUFA的需求會(huì)隨著魚的不同生長(zhǎng)階段發(fā)生改變[9-11]。飼料中添加n-3 HUFA的研究同樣在蝦和蟹的幼體和后期幼體中被展開，如中國對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)[12]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[13]、日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)[14]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[15]和鋸緣青蟹(Scylla serrata)[16-17]，研究發(fā)現(xiàn)這些脂肪酸對(duì)蝦和蟹的成活或生長(zhǎng)有著一定的幫助。雖然對(duì)三疣梭子蟹已展開了一些研究，如飼喂經(jīng)過n-3 HUFA營養(yǎng)強(qiáng)化的輪蟲和鹵蟲的螃蟹在幼體階段能獲得更高的成活率[18]。以及n-3 HUFA對(duì)幼蟹營養(yǎng)品質(zhì)的影響[19]，但對(duì)大規(guī)格三疣梭子蟹幼蟹n-3 HUFA需求量的研究尚未見報(bào)道。所以本研究的目的就是確定大規(guī)格三疣梭子蟹幼蟹合適的n-3 HUFA需求量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

四組等氮(42.00%～44.10%)、等能(18.26～18.67 kJ/g)的實(shí)驗(yàn)飼料含有4個(gè)不同n-3 HUFA含量（0.52%、1.12%、2.33%和4.02%）。實(shí)驗(yàn)飼料中脂肪源的脂肪酸組成列于表1。實(shí)驗(yàn)飼料的原料組成和成分分析列于表2。實(shí)驗(yàn)飼料的脂肪酸組成列于表3。白魚粉和酪蛋白作為蛋白質(zhì)來源，玉米淀粉作為糖源。

首先，將各原料進(jìn)行粉碎（小于15 μm），再放入面團(tuán)混合機(jī)中混合，緩慢加入油源和足夠的蒸餾水，充分混合，使用雙螺桿擠壓機(jī)擠出，制成2.5 mm直徑的顆粒。飼料用烘箱在45℃下干燥12 h后，于-20℃冰柜中保存，直到使用。

表1 飼料中脂肪源的脂肪酸組成（%總脂肪酸）

表2 飼料原料組成和近似成分組成

表3 實(shí)驗(yàn)飼料脂肪酸組成（%總脂肪酸）

1.2 養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹幼蟹來自浙江省海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖基地（中國浙江）。實(shí)驗(yàn)前，梭子蟹用暫養(yǎng)顆粒飼料（粗蛋白46.22%、粗脂肪11.02%、灰分7.88%、水分3.83%）每天投喂兩次，馴養(yǎng)1周。暫養(yǎng)結(jié)束后,180只健康，無殘肢，大小相近的螃蟹被隨機(jī)分到實(shí)驗(yàn)裝置（藍(lán)色圓形塑料筐：高、上底直徑、下底直徑分別為22 cm、22 cm、17 cm）中，所有塑料筐被放置在一個(gè)4 m×6 m的水泥池中。實(shí)驗(yàn)共分4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)平行，每個(gè)平行15只蟹。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，蟹平均體質(zhì)量大約為24 g。

實(shí)驗(yàn)為期8周，每天投喂2次（07:00和17:00），投喂量為體重的6%～8%。每2周測(cè)一次體重，以確定投喂量。剛退殼的螃蟹停止投喂1 d。每天在喂料前計(jì)錄死亡和退殼情況。3/4的塑料筐浸在海水中，每天更換20%的海水。每?jī)商鞙y(cè)定一次水質(zhì)，實(shí)驗(yàn)期間水溫（25.8±2.9）℃，鹽度（27.5±0.9）‰，溶氧大于6 mg/l。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程采用自然光照。

1.3 樣本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，停止投喂24 h后，每個(gè)平行螃蟹計(jì)數(shù)，稱重并記錄。隨機(jī)從每個(gè)平行中選取3只螃蟹放入-20℃冰柜中作全蟹生化分析。另外隨機(jī)從每平行中選4只螃蟹，收集的頭胸部肌肉和肝胰臟，在液氮中冷凍，并儲(chǔ)存于-76℃超低溫冰箱中，用于分析水分、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)含量和脂肪酸組成。

1.4 成分分析和脂肪酸分析

飼料與全蟹成分分析采用AOAC（1995）[20]的方法。飼料和全蟹的水分測(cè)定在烘箱中105℃12 h烘干，肌肉和肝胰腺則采用冷凍干燥的方法(LL1500:Thermo,USA)；粗蛋白使用凱氏定氮法測(cè)定(K438/K355,BUCHI,Flawil,Switzerland)；粗脂肪使用索氏抽提法測(cè)定(E-816,BUCHI,Flawil,Switzerland)，灰分使用馬弗爐550℃焚燒12 h。

用于脂肪酸測(cè)定的飼料、肌肉和肝胰腺被分別均質(zhì)在氯仿-甲醇液(2∶1,v/v)中以抽提脂肪。脂肪酸的甲酯化物(FAME)是先用三氟化硼進(jìn)行甲酯化獲得，然后再用氣相色譜儀(GCMS-QP2010 Plus：SHIMADZU,Japan)進(jìn)行分析。以毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm；spb-50 SUPELCO，America）采用程序升溫（150℃:3.5 min；150～200 ℃:20 ℃/min；200 ℃:5 min；200～280℃:5℃/min；280:20min）進(jìn)行分離,載氣為氦氣（氣壓：73 kPa；流速：44.1 ml/min）。進(jìn)樣溫度和檢測(cè)器溫度為250℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，經(jīng)單因素方差分析(ANOVA)后,若存在顯著的差異,則采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。顯著性差異水平為0.05。所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0分析軟件和Microsoft Office Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能（見表4、表5）

由表4可知，飼料處理影響三疣梭子蟹的增重率，增重率最高值（193.04±6.47）%出現(xiàn)在喂食2.33%n-3 HUFA水平飼料組，顯著高于喂食0.52%組和4.02%組。特定生長(zhǎng)率表現(xiàn)出同增長(zhǎng)率相同的結(jié)果。而飼料處理對(duì)各組的存活率(55.56%～64.44%)無顯著性影響（P＞0.05）。

為了進(jìn)一步探討三疣梭子蟹增重率和飼料n-3 HUFA水平之間的關(guān)系，以飼料中n-3 HUFA水平為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)各組的增重率為縱坐標(biāo)，得折線回歸方程y=21.91x+140.4，R2=0.959和y=-32.29x+268.2，R2=1。由此估算出三疣梭子蟹幼蟹飼料中n-3 HUFA的合適需要量為 2.36%（圖 1）。

由表5可見，實(shí)驗(yàn)飼料的利用效率受到飼料處理的影響。隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升，餌料系數(shù)（FCR）呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，最低值出現(xiàn)在2.33%組，為1.02±0.11，顯著低于0.52%組和4.02%組（P＜0.05）。最高的蛋白質(zhì)利用率（PER）也出現(xiàn)在2.33%組（2.29±0.24），并且顯著高于其他各組（P＜0.05）。生物學(xué)指標(biāo)中，性腺指數(shù)（GSI）隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在2.33%組，但各組間不存在顯著性差異（P＞0.05）。肝體比（HSI）隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升而下降，其中4.02%組顯著低于0.52%組（P＜0.05）。

表4 投喂不同n-3 HUFA水平飼料的三疣梭子蟹的成活率和生長(zhǎng)表現(xiàn)

圖1 飼料不同n-3 HUFA水平對(duì)三疣梭子蟹增重率的影響

表5 投喂不同n-3HUFA水平飼料的三疣梭子蟹的飼料利用和生物學(xué)指標(biāo)

2.2 成分分析

表6為攝食n-3 HUFA水平飼料8周后三疣梭子蟹的全蟹、肌肉和肝胰腺的成分分析。全蟹粗蛋白含量4.02%組顯著低于1.12%組（P＜0.05），但與其他兩組之間沒有顯著性差異。粗脂肪含量2.33%組和4.02%組顯著低于0.52%組和1.12%組（P＜0.05）。水分和灰分含量并沒有受到飼料n-3 HUFA含量變化的顯著影響（P＞0.05）。肌肉水分（80.13%～81.63%）、粗蛋白（14.27%～14.84%）和粗脂肪含量（1.51%～1.59%）各組間沒有顯著性差異（P＞0.05）。三疣梭子蟹肝胰腺的水分、粗蛋白沒有受到飼料n-3 HUFA水平的顯著影響（P＞0.05），粗脂肪含量隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升而下降，其中4.02%組顯著低于0.52%組和1.12%組（P＜0.05）。

表6 投喂不同n-3 HUFA水平飼料的三疣梭子蟹成分分析(%)

2.3 脂肪酸組成分析（見表7、表8）

由表7和表8可見，三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺的脂肪酸組成明顯受到了飼料脂肪酸組成的影響。三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺中的EPA、DHA和n-3 HUFA含量隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升顯著升高（P＜0.05）。然而，EPA/ARA的比值在肌肉和肝胰腺各組間沒有顯著性差異（P＞0.05）。DHA/EPA的比值在肝胰腺中各組間同樣沒有顯著性差異（P＞0.05），但在肌肉中隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升而下降。

表7 投喂不同n-3 HUFA水平飼料的三疣梭子蟹肝胰腺中的脂肪酸組成(%總脂肪酸)

表8 投喂不同n-3 HUFA水平飼料的三疣梭子蟹肌肉中的脂肪酸組成(%總脂肪酸)

肌肉和肝胰腺脂肪酸中n-3 HUFA含量與飼料脂肪酸中n-3 HUFA含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（肌肉：y=0.228x+27.28，R2=0.873；肝胰腺：y=0.544x+6.078，R2=0.996；圖2）。同時(shí)，圖2可知肌肉脂肪酸中n-3 HU-FA含量要明顯高于肝胰腺脂肪酸中n-3 HUFA含量，但肝胰腺脂肪酸中n-3 HUFA含量受飼料脂肪酸組成的影響比肌肉更加明顯。

圖2 飼料脂肪酸中n-3 HUFA含量和三疣梭子蟹組織脂肪酸中n-3 HUFA含量的關(guān)系

3 討論

3.1 飼料n-3 HUFA水平對(duì)三疣梭子蟹生長(zhǎng)表現(xiàn)的影響

經(jīng)過56 d的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，三疣梭子蟹的增重率（WG）和特定生長(zhǎng)率（SGR）受到了飼料脂肪酸組成的影響。飼料中n-3 HUFA含量從0.52%上升到4.02%時(shí)，三疣梭子蟹的增重率(WG)和特定生長(zhǎng)率(SGR)呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。這與之前在中華絨螯蟹[21]、鋸緣青蟹[17，21-23]和三疣梭子蟹[24]上的研究結(jié)果是相似的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低的增重率出現(xiàn)0.52%組和4.02%組，且顯著低于2.33%組。表明飼料中n-3 HUFA的不足會(huì)嚴(yán)重抑制三疣梭子蟹的生長(zhǎng)，也充分說明了n-3 HUFA是三疣梭子蟹的必需脂肪酸。同時(shí)，這一結(jié)果也表明了飼料中添加過量的n-3 HUFA同樣會(huì)對(duì)三疣梭子蟹產(chǎn)生不利的影響。張穩(wěn)等[24]（2014）在對(duì)體重約為2 g的三疣梭子蟹進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中n-3 HUFA含量到2.76%時(shí)，螃蟹的生長(zhǎng)速率反而下降了。類似現(xiàn)象在其他研究中也觀察到。Kim等（2004）[9]在牙鲆（P.olivaceus）幼魚的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中n-3 HUFA水平高于0.8%時(shí)，增重率不升反降。Brinkmeyer等(1998)[25]對(duì)美國紅魚（Sciaenops ocellatus）仔稚魚的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)餌料中n-3 HUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過5%時(shí),生長(zhǎng)受到抑制。這可能是由于組織中過多EPA和DHA的積累干擾了生物膜極性脂肪的生理功能[9]。吉紅等(2011)[26]對(duì)草魚（Ctenopharyngodon idellus）幼魚的研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中高HUFA水平顯著提高草魚幼魚的SOD超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量，過高水平HUFA誘發(fā)了魚體的氧化應(yīng)激。此外，Weatherill等（2005）[27]研究發(fā)現(xiàn)過高的n-3 HUFA會(huì)抑制細(xì)胞因子的釋放及樹突狀細(xì)胞免疫表型的表達(dá)，其刺激T細(xì)胞增殖的能力也會(huì)下降，從而損害機(jī)體免疫功能。但是，不同的結(jié)果也在其他的一些研究品種中被發(fā)現(xiàn)，如星斑川鰈(Platichthys stellatus)[2]和許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[5]。這一不同的研究結(jié)果的確切生理機(jī)制還并不明確，可能是由于不同的實(shí)驗(yàn)品種、飼料的脂肪酸組成、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)周期、最高量的設(shè)定等因素原因引起。

本試驗(yàn)以增重率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過折線回歸方程y=21.91x+140.4，R2=0.959和y=-32.29x+268.2，R2=1，估算出三疣梭子蟹幼蟹飼料中n-3 HUFA的合適需要量為2.36%。這一結(jié)果與張穩(wěn)等（2014）[24]的研究結(jié)果非常接近（2.357%）。這一現(xiàn)象說明2 g左右的三疣梭子蟹和24 g左右的三疣梭子蟹對(duì)飼料中n-3 HUFA的需求量沒有多大變化，并沒有像其他一些研究品種，對(duì)飼料中n-3 HUFA的需求量隨著生長(zhǎng)階段的不同發(fā)生改變，如牙鲆在仔稚魚時(shí)期對(duì)n-3 HUFA的需求量為0.8%～1%，但長(zhǎng)到20 g時(shí)幼魚對(duì) n-3 HUFA的需求量變?yōu)?.1%～1.4%[28]。

3.2 飼料n-3 HUFA水平對(duì)三疣梭子蟹飼料利用的影響

本實(shí)驗(yàn)中三疣梭子蟹的飼料系數(shù)（FCR）表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，蛋白質(zhì)利用率（PER）表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。最好的飼料利用出現(xiàn)在2.33%組，說明飼料中一定量的n-3 HUFA有助于提高三疣梭子蟹對(duì)飼料的利用率。相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也在三疣梭子蟹（2 g）[24]、牙鲆（11.5 g）[29]和軍曹魚（250 g）[30]的研究中被發(fā)現(xiàn)。

3.3 飼料n-3 HUFA水平對(duì)三疣梭子蟹生物學(xué)指標(biāo)和體組成的影響

脂肪代謝過程是脂肪合成代謝和分解代謝的一種動(dòng)態(tài)平衡，不管哪一個(gè)過程發(fā)生改變，都將影響脂肪的積累。如當(dāng)分解代謝下降或合成代謝增強(qiáng)時(shí)，就會(huì)致使脂肪積累量的增加，甚至有可能導(dǎo)致脂肪過度積累[31]。HUFA能抑制脂類合成，促進(jìn)脂類分解，降低肝脂和血脂[32]。蝦蟹類脂類儲(chǔ)存和加工的器官是肝胰腺，其生理和生化狀況在很大程度上受到飼料的影響[33-34]，當(dāng)營養(yǎng)素失衡和抗脂肪肝物質(zhì)缺乏時(shí),蝦蟹類的肝胰腺重量會(huì)發(fā)生明顯變化。在本研究中，三疣梭子蟹的肝體比（HSI）和肝胰腺脂肪含量隨著飼料n-3 HUFA含量的升高而降低，0.52%組的肝體比（HSI）和肝胰腺脂肪含量顯著高于4.02%組（P＜0.05）。在魚類中也有相似的研究結(jié)果，朱慶國等（2012）[32]在對(duì)斜帶石斑魚的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中n-3 HUFA水平的升高，斜帶石斑魚的肝體比顯著下降。Ibeas等(1996)[10]在對(duì)金頭鯛（Sparus aurata）幼魚研究指出，飼料中n-3 HUFA從較低水平0.19%提高到1%時(shí)，肝體比顯著降低，肝臟脂肪沉積顯著減少。在Hutchins等(1998)[35]對(duì)雜交條紋鱸的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。也有研究表明，飼喂n-3 HUFA能夠顯著降低草魚和鯉肝胰臟LPL的活性或基因表達(dá)，說明HUFA抑制了外源性脂質(zhì)進(jìn)入肝胰臟，能起到保證肝胰臟脂肪含量恒定的作用[36-37]。曹艷姿等(2009)[38]發(fā)現(xiàn)n-3 HUFA能夠顯著降低草魚肝胰臟LXRα以及脂肪組織PPARγ、SREBP-1c、FAS和ACC等脂肪合成相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些結(jié)果在一定程度上從轉(zhuǎn)錄水平解釋了n-3 HUFA對(duì)組織脂肪積累所產(chǎn)生的影響。

在本實(shí)驗(yàn)中，肌肉的水分（80.13%～81.63%）、粗蛋白（14.27%～14.84%）和粗脂肪含量（1.51%～1.59%）并沒有受到飼料n-3 HUFA含量的很大影響，各組間沒有顯著性差異（P＞0.05），這可能是由于肌肉作為運(yùn)動(dòng)器官,其各種生化成分相對(duì)穩(wěn)定所致[39]。

3.4 飼料n-3 HUFA水平對(duì)三疣梭子蟹組織脂肪酸組成的影響

組織中脂肪酸組成很大程度上受到飼料中脂肪酸組成的影響。在本研究中，三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺中的EPA、DHA和n-3 HUFA含量隨著實(shí)驗(yàn)飼料中n-3 HUFA水平的上升顯著升高（P＜0.05）。相似的結(jié)果在很多研究中也被發(fā)現(xiàn)，如中華絨螯蟹[40]、斜帶石斑魚[32]、三疣梭子蟹[24]、軍曹魚[41]等。但肌肉和肝胰腺對(duì)n-3 HUFA的利用和保留存在著一定的差異，由圖2可見，肌肉脂肪酸中n-3 HUFA含量要明顯高于肝胰腺脂肪酸中n-3 HUFA含量，但肝胰腺脂肪酸中n-3 HUFA含量受飼料脂肪酸組成的影響比肌肉更加明顯。這一結(jié)果可能是由于不同組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的差異引起的。

在本實(shí)驗(yàn)中，肝胰腺脂肪酸DHA/EPA高于飼料中的比值，表明DHA在肝胰腺中的沉積速度要優(yōu)于EPA，或與EPA向DHA的轉(zhuǎn)化有關(guān)[42]。組織與飼料DHA/EPA的差異還可能是組織保留脂肪酸作為其基本組成成分的一種生化策略,在這種策略指引下,各組織分別對(duì)其初始DHA/EPA進(jìn)行調(diào)整,以滿足其各自的代謝與生理需要[10]。相似的結(jié)果在馬晶晶等（2008）[43]對(duì)黑鯛的研究中被發(fā)現(xiàn)。此外，組織中EPA/ARA的比值也能很好地證明上述理論，在本研究中即使飼料脂肪酸中EPA/ARA在各組間存在很大差異，肌肉和肝胰腺中各組間的EPA/ARA比值并不存在顯著性差異。

在本研究中，三疣梭子蟹肌肉的DHA/EPA比值和飼料中DHA/EPA比值相似，但隨著飼料中n-3 HUFA水平的上升（0.52%～4.02%）肌肉中DHA/EPA的比值下降了，0.52%組的比值顯著高于4.02%組，這表明當(dāng)飼料中缺乏n-3 HUFA時(shí)，螃蟹對(duì)DHA選擇性的進(jìn)行了保留。

4 結(jié)論

對(duì)于體重約為24 g的三疣梭子蟹，綜合飼料n-3 HUFA含量對(duì)其生長(zhǎng)和飼料利用的影響，再結(jié)合生長(zhǎng)的折線模型，估算出三疣梭子蟹配合飼料中n-3 HUFA的適宜添加量為2.36%。