李智敏 劉淑華

(黑龍江省哈爾濱市第四醫(yī)院老年病科 150026)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是以心臟擴(kuò)大，心肌收縮功能障礙為主要特征的原因不明性心肌疾病。目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有文獻(xiàn)報道細(xì)胞凋亡在擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生中起著重要作用，且與死亡率呈密切相關(guān)［1］。細(xì)胞凋亡三個主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:(1)線粒體通路;(2)死亡受體通路;(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，這些都與鈣密切相關(guān)。據(jù)報道心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載見于多種心臟病理狀態(tài)，如擴(kuò)張型心肌病［2.3.4.5］。

鈣敏感受體(calcium－sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員。CaSR主要存在參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的組織器官如甲狀旁腺、腎臟、骨組織、胃腸道，在心血管系統(tǒng)［6］也有表達(dá)。已經(jīng)證實，在心血管系統(tǒng)Ca2+通過CaSR發(fā)揮第一信使作用［7］。CaSR激活通過G蛋白－PLC－IP3通路引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加，參與心肌鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控，而心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)對心肌功能至關(guān)重要［8］。盡管國內(nèi)外學(xué)者對CaSR在心血管領(lǐng)域的作用進(jìn)行了一些研究，但CaSR在DOX誘導(dǎo)的DCM中的表達(dá)情況未見報道。本研究擬通過對DOX誘導(dǎo)的大鼠DCM形成過程中心臟功能、超微結(jié)構(gòu)變化以及CaSR的表達(dá)的檢測，探討DOX誘導(dǎo)的大鼠DCM發(fā)生的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠40只，體重220g±20g。

1.1.2 主要試劑 Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、DOX(Pfizer Italia S.r.l.)、分離膠濃縮液、濃縮膠濃縮液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、Anti－CaSR(Alpha Diagnostic International，USA)、Anti－ GAPDH(Santa)、羊抗兔IgG－FITC、馬抗鼠IgG－FITC等。

1.1.3 主要儀器 高速低溫離心機(jī)(LD5－2型);電泳儀;光學(xué)顯微鏡，GE Vivid7彩色多普勒超聲儀;酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)張型心肌病模型的建立 本實驗參照腹腔注射阿霉素的實驗方法，建立擴(kuò)張型心肌病模型［9］。雄性健康Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為對照組(n=10)和模型組(n=30)，模型組隨機(jī)分為3周組、6周組和9周組。模型組每周根據(jù)體重腹腔注射 DOX(2.5mg kg－1.week－1)，由生理鹽水溶解并稀釋，濃度為0.5mg/ml。3周組連續(xù)注射3周，每周1次，6周組連續(xù)注射6周，每周1次，9周組連續(xù)注射6周，觀察3周。每周根據(jù)體重調(diào)整阿霉素劑量。應(yīng)用GE Vivid7彩色多普勒超聲儀對正常對照組和模型組分別于實驗前和第3、6、9周末檢測大鼠左室舒張期末徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮期末徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular eject ion fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(fraction shortening，F(xiàn)S)，一般采取3個心動周期測量的數(shù)據(jù)。

1.2.2 心肌組織學(xué)觀察 處死大鼠，將左心室前壁取下1mm3心肌用于組織病理切片。經(jīng)10%甲醛固定，組織脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，用于蘇木素－伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 免疫組化檢測心肌CaSR表達(dá)情況 心肌組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切厚片，然后按免疫組化盒進(jìn)行操作。微波抗原修復(fù)，高火3min，中火5min。一抗?jié)舛葹?1:200)，PBS稀釋。細(xì)胞內(nèi)成團(tuán)深黃色顆粒示高表達(dá)，淡黃色顆粒示低表達(dá)，封片光鏡下觀察并分析平均光密度值(IOD/Area)。

1.2.4 Western Blot檢測心肌CaSR表達(dá) 取心肌組織低溫研磨后加蛋白裂解液及 PMSF，4℃靜置50min，4℃12000r/min離心后取上清進(jìn)行蛋白定量;取60μg蛋白，10%SDS－PAGE凝膠電泳2h，300mA 1.5h轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂牛奶封閉膜1h;一抗(anti－CaSR(1:500)，anti－GAPDH(1:2000))4℃過夜;TBST充分洗膜后，二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG抗體(1:1000))孵育，顯色液(Promega)顯色掃描，分析光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，差異性檢驗采用完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析方法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01表示具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠左心室功能指標(biāo)的變化 與對照組相比，6周組、9周組大鼠左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)明顯升高、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)明顯降低(P＜0.01)，見下表。

表1 大鼠左室功能變化

2.2 心肌組織HE染色觀察結(jié)果 HE染色顯示正常對照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常、胞漿紋理清晰，結(jié)構(gòu)完整，無心肌纖維斷裂;3周組心肌細(xì)胞胞漿疏松，少量心肌纖維增粗;6周組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分心肌纖維增粗;9周組大部分心肌細(xì)胞腫脹，間隙增寬，心肌纖維局限性斷裂。

2.3 心肌CaSR表達(dá)情況 CaSR免疫組化顯示6周組和9周組明顯低于正常對照組(P＜0.01)，3周組對照組比無顯著差異。

Western Blot檢測顯示CaSR的表達(dá)逐漸降低，6周組和9周組明顯低于對照組(P＜0.01)，3周組與對照組比無顯著差異。

3 討論

3.1 擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是以左心室擴(kuò)大或左右雙心室擴(kuò)大并伴有心室肥厚、心室收縮功能障礙的心肌疾病。DCM的病因不明，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，可能與多種因素有關(guān)，如家族性/遺傳性、病毒性和(或)免疫性、代謝性以及酒精性/中毒性等［10］。實驗采用腹腔注射阿霉素的方法復(fù)制擴(kuò)張型心肌病模型，結(jié)果9周模型組的LVEDD、LVESD、EF、FS指標(biāo)均明顯低于對照組(P＜0.01);心肌組織HE染色觀察結(jié)果示心肌超微結(jié)構(gòu)改變嚴(yán)重說明成功構(gòu)建了大鼠擴(kuò)張型心肌病模型。

本實驗檢測了DOX誘導(dǎo)DCM大鼠3周、6周、9周時心肌CaSR蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6周組、9周組與對照組相比CaSR表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，3周組與對照組相比無顯著差異。CaSR表達(dá)降低同時左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)明顯升高、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)明顯降低(P＜0.01)，它提示CaSR表達(dá)降低與心功能相關(guān)，可能參與了DCM的發(fā)生。

3.2 阿霉素是一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，其引起心肌毒性的機(jī)制不十分明確，可能與自由基作用導(dǎo)致心肌損傷［11］，細(xì)胞內(nèi)鈣超載［12］，抑制心肌相關(guān)核酸、蛋白合成［13］，氧化應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)鈣超載致線粒體損傷、心肌細(xì)胞凋亡［14］有關(guān)。已經(jīng)有文獻(xiàn)報道阿霉素的心肌毒性與其引起的氧自由基損傷和肌質(zhì)網(wǎng)攝Ca2+功能障礙有關(guān)［15.16］。心血管領(lǐng)域CaSR的研究開展較晚。2006年，Tfelt－Hansen等人報告，CaSR在新生大鼠心室肌細(xì)胞也有功能性表達(dá)［17］。已經(jīng)證實，在心血管系統(tǒng)Ca2+通過CaSR發(fā)揮第一信使作用［7］。細(xì)胞外Ca2+增加及其它CaSR激動劑(Gd3等)可通過G蛋白－PLC－IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起肌漿網(wǎng)Ca2+釋放增加，濃度增加使心臟收縮，CaSR表達(dá)降低，引起肌漿網(wǎng)Ca2+胞漿減少，心肌興奮－收縮偶聯(lián)障礙，心肌收縮功能降低。

本實驗通過DOX誘導(dǎo)的大鼠DCM，檢測不同時間CaSR表達(dá)變化，提示在DOX誘導(dǎo)的大鼠DCM過程中，CaSR表達(dá)變化可能是鈣穩(wěn)態(tài)紊亂的機(jī)制，這對DCM的發(fā)病機(jī)制的研究有一定的意義。

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