李 源 綜述，王小春 審校

(北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192)

自1992年Nagasawa和Little發(fā)現(xiàn)當只有1%的細胞接受α粒子照射時，30%的細胞發(fā)生姐妹染色單體互換后，輻射誘導的旁效應現(xiàn)象在多種細胞系中被發(fā)現(xiàn)，包括成纖維細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞及各種腫瘤細胞。電離輻射誘導的旁效應隨著應激信號的傳遞而不斷發(fā)展。一方面，通過照射細胞和旁效應細胞之間的直接接觸，由間隙連接細胞間通訊(GJIC)傳遞。另一方面，可溶性的損傷信號或應激信號(如活性氧、NO、細胞因子，胞外DNA等)通過被動擴散與旁效應細胞或質(zhì)膜上受體相互作用。本文就輻射旁效應中幾個重要的信號分子做一簡要綜述。

1 細胞間隙通訊與輻射旁效應

GJIC在暴露于低劑量α粒子照射的單層融合培養(yǎng)細胞的旁效應中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［1］。間隙連接由跨越相鄰細胞兩層質(zhì)膜的完整細胞間通道組成。每個連接子是多個連接蛋白亞基組成的多聚體［2］。Connexin43是間隙連接中重要的蛋白，嵌合在磷脂雙分子層內(nèi)，決定了間隙連接的滲透性和對通過物質(zhì)的選擇性［3］。通常這些孔道允許通過的最大分子量為1 000～1 500Da，允許離子、小分子代謝物和第二信使在細胞間直接交流［4］。如重要的第二信使鈣離子，能夠產(chǎn)生旁效應信號，并且在旁效應共培養(yǎng)實驗中發(fā)揮作用。鈣離子信號釋放進入旁效應細胞的方式就是通過GJIC［5］。

Hei等人發(fā)現(xiàn)，connexin43基因啟動子區(qū)存在AP-1(激活蛋白)和NF-κB轉錄因子結合位點。直接受照細胞釋放的細胞因子，如:腫瘤壞死因子(TNF-a)、轉化生長因子 -β1(TGF-β1)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素-8(IL-8)激活旁效應細胞中的NF-κB，誘導環(huán)氧合酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)基因表達，同時誘導connexin43的表達［6-7］。此外，種種研究結果顯示，受低劑量α粒子照射細胞的GJIC與氧化代謝相關。Mancuso等人的研究發(fā)現(xiàn)，致癌輻射損傷通過GJIC傳遞至未受照的小腦組織，這一過程涉及ATP的釋放和connexin43表達量的上調(diào)［8-9］。Autsavapromporn等人最近的研究也證實，氧化應激與GJIC存在協(xié)同作用，并且提出二者在調(diào)節(jié)受α粒子或γ射線照射的人體成纖維細胞輻射損傷修復過程中發(fā)揮重要作用［10］。另外，當使用間隙連接抑制劑處理細胞或在connexin43基因缺陷的細胞中，電離輻射誘導的旁效應被削弱［11］。以上實驗表明，輻射旁效應的產(chǎn)生依賴于GJIC，又不僅僅由間隙連接通道介導，還可以通過其他機制(如旁分泌)誘導產(chǎn)生［12］。

2 可溶性因子與輻射旁效應

另一種旁效應信號傳遞途徑即受照細胞釋放可溶性因子進而轉移至旁效應細胞。研究發(fā)現(xiàn)，這些可溶性因子大小介于1 000～10 000kDa之間，包括脂質(zhì)過氧化物、次黃嘌呤及細胞活素類，如白細胞介素6(IL-6)、IL-8、TGF- β1、TNF- α、活性氧(ROS)及活性氮(RNS)等［13］。

2．1 ROS 和RNS

ROS和RNS是多種細胞自然程序(如細胞凋亡、細胞生長、細胞信號轉導、免疫反應和炎癥反應)中的關鍵分子。由于氧化代謝失調(diào)和慢性炎癥反應，受照細胞及旁效應細胞中活性自由基的水平升高，從而影響致癌過程。Gollapalle等人的研究發(fā)現(xiàn)，受照數(shù)周后，非靶組織中產(chǎn)生高水平的氧化應激，并誘導聚集的DNA損傷［14］。而使用抗氧化劑處理細胞后，旁效應細胞中的DNA損傷減少。線粒體是自由基的主要產(chǎn)生者，研究發(fā)現(xiàn)，在線粒體缺陷型細胞或線粒體DNA突變型細胞中，輻射旁效應被削弱，表明線粒體在輻射旁效應中至關重要［15］。因此，線粒體功能缺陷，可能導致一系列疾病(如癌癥)的發(fā)生。

大量的證據(jù)表明，ROS通過一系列級聯(lián)反應參與細胞外及細胞內(nèi)旁效應的誘導［16］。ROS可以直接由受照細胞的輻射分解產(chǎn)物產(chǎn)生，或者間接經(jīng)由炎癥過程產(chǎn)生，通過被動擴散、主動運輸或間隙連接轉移至臨近旁效應細胞［1］。大多數(shù)ROS的半衰期很短，僅能誘導距離DNA鏈幾納米內(nèi)的損傷;而過氧化氫具有相對更長的半衰期，能自由地穿過細胞膜，長距離遷移，導致遠位DNA損傷［17］。高濃度的ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至壞死。另外，羥基自由基和部分單線態(tài)氧分子能與DNA、蛋白質(zhì)和脂類發(fā)生反應，使其功能發(fā)生改變［18］。另有證據(jù)顯示，質(zhì)膜結合的NADPH氧化酶誘導胞內(nèi)ROS含量的增加［13］。另一方面，在旁效應細胞，COX-2通過對應的細胞因子受體的活化，調(diào)節(jié)前列腺素E2的合成，并伴隨產(chǎn)生大量活性氧，釋放至細胞外環(huán)境，與臨近細胞相互作用，增強輻射旁效應［6-7］。

RNS，尤其是NO，作為一個重要的信號分子，參與多條信號轉導通路。Shao等人的研究表明，當只有1%的細胞直接接受氦離子照射后，40%的細胞中NO水平升高［19］。進一步的研究顯示，加入特定的NO清除劑時，旁效應被抑制。而使用鈣離子阻滯劑后，旁效應消失，表明鈣離子能夠調(diào)節(jié)NO誘導的旁效應［20］。以上實驗結果顯示，抑制NO合成酶導致鈣離子通道被抑制，表明NO參與誘導輻射旁效應。Dickey等人的研究也發(fā)現(xiàn)，使用NO清除劑和NO合成酶抑制劑處理細胞都會導致旁效應細胞中DNA雙鏈斷裂水平降低［21］。Shao等人的另一項研究發(fā)現(xiàn)，射線誘導的NO的合成可以調(diào)節(jié)受照的人唾液下腺(human salivary gland，HSG)細胞對未受照淋巴瘤細胞的效應，這種調(diào)節(jié)過程依賴于HSG細胞接受的照射劑量和傳線能密度［22］。另有研究表明，NO參與淋巴瘤細胞、惡性膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)基介導的輻射旁效應，并且可能誘導鄰近細胞早期DNA損傷［4］。對未受照野生型(wt)p53的成膠質(zhì)細胞瘤細胞的研究表明，無論其與受照的突變型p53細胞共培養(yǎng)或暴露于條件培養(yǎng)基，作為氧化應激的應答，NO均可誘導野生型細胞中p53和熱體克蛋白72(hsp72)的表達。這一結果表明，NO可以誘導并調(diào)節(jié)旁效應，并且NO由受照細胞轉移至旁效應細胞過程中不需要直接的細胞間接觸(如間隙連接等)［23-24］。

2．2 絲裂原活化蛋白激酶

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一組能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞因子、趨化因子和有絲分裂原等分子經(jīng)由受體的信號傳遞。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是將信號從表面受體傳遞至細胞核的關鍵。磷酸化激活的ERK1/2由胞質(zhì)轉移到核內(nèi)，進而介導 NF-κB，Ap-1 等轉錄因子的活化［25］。研究發(fā)現(xiàn)，受照細胞中加入PD98059(一種特異性的MAPK激酶的抑制劑)后，旁效應的誘導被削弱，表明MAPK信號通路參與RIBE的誘導。以上結果表明，TGF-β、IGF、IL-1、IL-8 等配體結合到與其相互作用的受體，通過激活MEK(MARK/ERK激酶)1/2、MKK(MARK激酶)3/6或p38信號通路，進而誘導COX-2的表達［26］。研究表明，TNF-α也能夠通過AP-1轉錄因子激活MAPK通路，進一步上調(diào)COX-2及iNOS的表達，刺激NO的生成［27］。

2．3 細胞因子

由于電離輻射誘導的旁效應的一些特征與炎癥過程類似，因此細胞因子可以間接地進一步增強氧化應激在電離輻射誘導的旁效應中的作用。

具體而言，細胞因子(如 TNF-a、IL-1β、IL-33等)由受照細胞釋放，通過膜受體結合到旁效應細胞，直接激活轉錄因子NF-κB。NF-κB負責iNOS和COX-2基因的表達，其中COX-2參與ROS的產(chǎn)生，而iNOS控制NO的合成［6-7］。

另外，IL-6與其旁效應細胞表面上的受體結合，可以激活JAK2信號轉導分子和信號傳導及轉錄激活因子-3(signal transducers and activators of transcription，STAT-3)通路。反過來，STAT-3的激活導致活化的NF-κB在細胞核中長時間滯留，調(diào)控旁效應細胞中COX-2基因的表達和最終ROS的含量［28-29］。

TGF-β1由射線誘導或經(jīng)由NO誘導產(chǎn)生。它可以增加ROS的合成和微核形成，且TGF-β1抑制劑能夠減輕輻射旁效應［30］。具體而言，受照細胞分泌的TGF-β1參與旁效應誘導的NAD(P)H氧化酶的活化，導致胞內(nèi)ROS含量增加［13］。TGF-β1和IL-8，也可以激活MAPK通路，使旁效應細胞產(chǎn)生自由基［31］。另外，Shao等人的研究證實 TGF-β1是輻射誘導的NO的下游產(chǎn)物，且NO與TGF-β1兩種信號分子相互依存。當部分靶細胞受照時，NO及其下游產(chǎn)物TGF-β1由靶細胞釋放。一旦TGF-β1與未照射細胞相互作用，即可通過依賴于Ca2+的途徑誘導胞內(nèi)第二旁效應信號NO生成，并進一步誘導鄰近細胞微核形成［32］。體外實驗表明，TGF-β1誘導DNA損傷與條件培養(yǎng)基對細胞DNA損傷的程度類似［30］。同樣，與旁效應相似，TGF-β1可以誘導DNA合成酶缺陷型細胞的DNA損傷［33］。另外，最近的研究顯示，受照后，旁效應細胞中 TGF-β1及 TGF-β 受體的表達水平升高［34］。綜上所述，TGF-β1通過刺激ROS的合成或通過依賴于Ca2+的途徑誘導NO的合成參與輻射旁效應。

另一方面，作為DNA損傷的應答，旁效應細胞的氧化應激在其生存的“炎癥”環(huán)境下還可能激活野生型p53，以不依賴于NF-κB的方式上調(diào)黏附分子的表達［35］。

2．4 胞外 DNA

胞外DNA是一種獨立于細胞外的游離DNA，廣泛存在于體液中。最近，Ermakov和Glebova等人提出垂死的受照細胞釋放其受損DNA片段至胞外，并作為全身性應激信號參與輻射旁效應的進展［36-37］。

對于受照細胞，在氧化應激條件下，胞內(nèi)DNA的氧化修飾水平和細胞死亡率增加［36］，誘導細胞凋亡并釋放出受損的、氧化的胞外DNA至培養(yǎng)基。接著，擁有應激信號功能的氧化的胞外DNA與受體相互作用，導致旁效應細胞的表面或內(nèi)部發(fā)生次級氧化應激。旁效應細胞中氧化的胞外DNA的受體可能是Toll樣受體家族的跨膜蛋白TLR9［38］，DNATLR9復合物形成之后，通過下游信號通路激活促炎轉錄因子 IRF3和 NF-κB［37］，誘導 ROS的合成，而NO的生成量減少，同時，DNA單鏈和雙鏈斷裂數(shù)瞬時增加。

在旁效應細胞中，氧化應激導致基因組和線粒體的氧化損傷，并且激活DNA損傷應答途徑。然而，部分旁效應細胞由于觸發(fā)細胞級聯(lián)凋亡而趨向死亡，這又導致氧化的胞外DNA釋放并作為應激信號進一步促進旁效應的傳播［16］。

值得注意的是，未受照細胞釋放的胞外DNA不能作為氧化應激信號，也不能誘導細胞的ROS合成［36］。

3 結語

自從X射線被發(fā)現(xiàn)的一個多世紀以來，射線對DNA的直接損傷如突變或癌變等各種效應已被廣泛接受。同時，受照的腫瘤細胞釋放有活性的信號分子，進一步影響鄰近及遠位的腫瘤細胞或正常細胞。氧化應激和隨即產(chǎn)生的DNA損傷在輻射誘導的旁效應的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這種氧化應激效應促進旁效應信號的傳播，同時，通過炎癥反應進一步增強其作用。癌基因誘導復制應激，進而導致旁效應增強、DNA損傷應答及修復機制缺陷，可能作為誘裂因子進一步發(fā)揮作用。輻射產(chǎn)生的DNA氧化損傷可能產(chǎn)生治療效果，也可能造成有害效應。換句話說，放射治療可以殺死腫瘤細胞，也可能對正常組織或細胞造成損傷，導致DNA雙鏈斷裂及其他DNA損傷的累積，可能促進放療患者基因組不穩(wěn)定，并且增加二次癌變的危險性，同時降低腫瘤治療尤其是現(xiàn)代高LET粒子治療的效率。因此，對輻射旁效應分子機制更好的理解有助于對低劑量照射可能導致腫瘤的風險進行準確的評估，建立最優(yōu)化模型。電離輻射旁效應對輻射防護理論提出了新的觀點，也對放射防護技術提出了新的要求。

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