430000　武漢市中醫(yī)醫(yī)院

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缺血性腦損傷模型的研究

李梅芳李智杰

430000武漢市中醫(yī)醫(yī)院

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.06.021

缺血性腦損傷容易造成海馬損傷，海馬與人類記憶缺失上關系密切，損傷能夠引起學習和記憶功能衰退，而海馬解剖位置和纖維聯系的特點，提示它在腦功能中起著關鍵作用。因此，在研究腦的學習和記憶的功能上海馬是一個重點，加上它具有片層結構，結構相對較簡單，是一個很適用的研究重點[1]，進行其研究的關鍵是制作其相關研究的動物模型。目前關于學習記憶研究的海馬缺血性損傷的模型建立方式主要有以下幾種：

1全腦缺血再灌注損傷動物模型

1.1雙側頸總動脈結扎法

一種慢性腦缺血動物模型，可參照de la Torre[2]的方法對大鼠的雙側頸總動脈進行永久性結扎(bilateral carotid artery ligation，BCAL)[3]。亦可參照Ohta等制作慢性腦灌注不足的動物模型[4]。將大鼠麻醉后仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離出雙側頸總動脈，雙重絲線結扎。缺血組大鼠缺血半球皮質、內囊區(qū)、海馬區(qū)白質均出現較大軟化灶，伴膠質細胞和小血管增生[5]。Tsuchiya等報道大鼠雙側頸總動脈結扎后有15個腦區(qū)的局部腦血流量降低25%～87%[6]。雙側頸總動脈結扎后反映大鼠學習能力的跳臺試驗和反映空間記憶能力的水迷宮試驗的各項指標均有顯著下降，并隨時間的推移大鼠的學習記憶能力有進一步的降低[7]。

1.2雙側頸總動脈阻斷并循環(huán)降壓法

采用夾閉家兔雙側頸總動脈合并股動脈(兔子、貓、狗等體型較大的實驗動物)或眼眶后靜脈叢[8](小鼠)快速放血，造成急性腦缺血模型。腦電圖、生化指標和形態(tài)學檢測顯示，這種模型腦缺血效果明顯。但是，該模型不易進行再灌注觀察。有作者采用雙側頸總動脈阻斷合并控制性藥物(硝普鈉等)降壓法[9]，制各急性腦缺血模型。缺血一定時間后恢復血液灌流，用于腦缺血再灌注損傷觀察。但由于全身低血壓造成心、腎和其他重要器官的損害，導致模型復雜化。

1.3體循環(huán)控制性降壓復合顱內注液增壓法

李成輝等通過給狗快速滴注0.02%硝普鈉溶液，使其平均動脈壓(MAP)于2～3 min內降至6. 65 kPa，之后向小腦延髓池快速注入腦脊液近似溶液，使顱內壓(ICP)于5 s內升高至13. 3 kPa[10]。這樣由于降低MAP而使腦灌注壓下降，同時升高顱內壓使腦灌流阻力增大，導致腦血流阻斷，造成腦缺血。維持MAP及ICP于上述水平一定時間后顱內減壓使ICP降至正常水平，即可恢復血液灌流。經組織學、生理學、生物化學及放射性同位素等多項技術檢測，證明應用體循環(huán)降壓結合顱內增壓技術制造的腦缺血再灌注損傷模型，具有缺血效果可靠、并發(fā)癥少等優(yōu)點，用作腦復蘇的實驗研究。但該模型不適用于大鼠等小動物，并且也具有因全身性低血壓導致其它臟器損傷，而使模型復雜化的缺點。

1.4四動脈結扎法

Pulsinelli[11]和De Ryck[12]等1979年首先報道了采用電凝固Wistar大鼠雙側椎動脈合并結扎雙側頸總動脈，一定時間后再解除兩側頸總動脈結扎進行再灌注，從而造成嚴重大腦缺血再灌注損傷這種具有高度重復性的全腦缺血造模方法。Furlow[13]又用SD大鼠復制此模型并加以改進。優(yōu)點：簡便易行，可控制夾閉CCA時間，進行再灌注實驗是研究腦缺血再灌注損傷比較常用的動物模型；缺點：操作困難，尤其是動物的椎動脈與脊髓動脈間交通支差異很大，并且動物不同種屬和不同個體之間差異較大，模型的成功率較低，穩(wěn)定性亦較差。

1.5三血管阻斷法

Kamegama等通過電灼斷基底動脈、同時夾閉兩側頸總動脈的方法復制全腦缺血模型，由于該方法不僅阻斷了腦供血主血管，而且也阻斷了從脊前動脈來的側支血管，與前述四血管阻斷模型比較，腦缺血成功率高且無需再篩選是其主要優(yōu)點。田鶴邨等在此基礎上又加以改進，不用顯微鏡而在自視下進行手術，用特制的動脈夾夾閉基底動脈而不用電灼斷的方法；缺血一定時間后去除夾閉進行徹底再灌注，也避免了灼斷基底動脈導致的動脈損傷、出血之弊，造成的缺血和再灌流效果迅速、穩(wěn)定性好；使用過程中全身動脈血壓一自穩(wěn)定在生理范圍內，從而避免了由全身動脈壓降低引起再灌流時腦血流灌注壓不足，是其又一個比較突出的優(yōu)點[14]。

1.6六動脈阻斷法

在四血管阻斷法造模的基礎上加以改進，將傳統(tǒng)的雙側頸總動脈阻斷改為雙側頸內動脈和頸外動脈阻斷再加雙側椎動脈阻斷。該方法由于頸動脈阻斷的部位是在頸動脈竇的遠心端，使頸動脈竇區(qū)能維持一定的壓力。這就避免了傳統(tǒng)的四血管法阻斷雙側頸總動脈，因雙側頸動脈竇區(qū)壓力同時驟降，導致全身血壓反射性升高，引起腦側支循環(huán)開放增加和腦血流增加，進而使腦缺血程度減輕等弊端。但該方法手術過程比較復雜、難度較大。

1.7頸動脈分流法

采用結扎左側頸總動脈、同時從右側頸總動脈遠心端放血，使大腦兩側頸總動脈來的血供停止，制造全腦缺血模型。此時雖然兩側椎動脈的血流仍能通過基底動脈流向大腦Willis環(huán)，但由于從右側頸總動脈遠心端進行放血，引起該側頸總動脈、頸內動脈和后交通動脈壓力顯著降低。因而，當基底動脈的血流進入后交通動脈后，并不向前灌注大腦，而是逆行經頸內動脈的頸總動脈流出，導致大腦缺血。從頸總動脈放出的血液又經同側股靜脈輸入體內。整個過程中可有效地控制血液流量和速度。該模型的優(yōu)點在于不影響基底動脈和椎動脈的血流量，腦干缺血不明顯，對呼吸、循環(huán)等基本生命活動的影響較小。再灌流時停止右頸總動脈放血，使右頸總動脈、頸內動脈和后交通動脈的低壓消失，由基底動脈來的血流能夠進入Willis環(huán)；同時解除左側頸總動脈結扎，恢復其血液灌流。這樣大腦便有了足夠的血液灌注，即再灌流充分是其又一特點。但對于這種造模方法所導致的腦缺血范圍尚有爭議。有研究顯示，這種缺血主要是右側大腦中動脈供應的腦區(qū)缺血。造成這一差異的原因可能與放血速度、頸內動脈壓力降低程度不同等有關。

1.8頸動脈負壓分流法

實驗大鼠以戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉。從左股靜脈注入肝素(180 U)后緩慢注入生理鹽水，夾閉兩側頸總動脈，從右頸外動脈持續(xù)抽吸頸總動脈內血液(0.3 ml/min)，此為腦缺血開始；同時自左股靜脈持續(xù)回輸血液，全腦缺血20 min后停止抽血，向頸動脈內注入1 mL生理鹽水，結扎頸外動脈，松開兩側頸總動脈，此為再灌注開始[15]。

2局灶性腦缺血再灌注損傷造模方法

建立大腦局灶性缺血與再灌注損傷動物模型，是研究缺血性腦卒中的病理生理機制及其防治的重要手段之一。大腦中動脈(MCA)是人類腦梗塞的血管病變多發(fā)部位。由于大鼠腦血管解剖接近人類，血管性損傷恒定，重復性好等優(yōu)點。因而，大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型是比較公認的研究腦缺血損傷的標準動物模型。對于局灶性腦缺血模型的制備，目前比較常用的有開顱法、插線法、光化學誘導法和栓塞法等造成大鼠MCA血流阻斷與再通，從而導致其相應灌流區(qū)域局灶性腦缺血再灌注損傷。

2.1開顱法

多數研究選擇顳下部開顱，通過電凝或絲線結扎橫過嗅束外緣或內緣處的MCA，造成腦梗塞。Kader等對電凝閉塞MCA方法加以改進，閉塞MCA所有可見分支，梗塞效果更好。開顱法MCAO模型缺血效果可靠，是迄今應用最廣泛的經典局灶性腦缺血模型。但開顱創(chuàng)傷大，腦脊液外漏，易感染，改變了腦微環(huán)境，手術難度較大和MCA閉塞后無法觀察再灌注損傷效應。雖然有作者通過用微型動脈夾夾閉或通過穿線抬起MCA造成短暫腦缺血，然后使血流再通制作再灌注模型，但也只限于短時間MCAO后再灌注損傷的研究，技術上尚待進一步改進。

2.2微栓子栓塞阻斷法

自頸外動脈(ECA)向頸總動脈(CCA)逆行插管并注入大鼠自體血凝塊碎片與生理鹽水配制的混懸液，可造成頸內動脈(ICA)系統(tǒng)，主要是MCA供血區(qū)的缺血性損害，梗死灶位于同側大腦皮質、基底節(jié)及海馬等部位。有人報道，也可利用硅酮微球、碳粒微球或CCA自發(fā)性脫落的血栓栓子栓塞一側MCA。這種栓塞性腦梗死模型很接近人類自然栓塞現象，成功率高，手術創(chuàng)傷較小[16]。但也存在諸如不能預見缺血部位和范圍、不能控制再通、對側亦可能受累以及可能導致外源物質引起的炎癥反應等缺點[17-18]。故此法僅限于一些特殊研究的應用，如溶栓治療及血小板微血栓形成后的腦病理改變及功能變化研究等[19]。

2.3插線法

Kuizumi于1986年首次報道了尼龍線插線法制作的可逆性MCAO模型，解決了局灶性腦缺血再灌注損傷研究的難題。若手術選擇頸部旁側手術入路，可使手術視野暴露更好，便于血管分離，并且較頸部正中切口對氣管刺激小，無需再行氣管造疹，使手術相對較簡單。病理檢查結果顯示，造模動物均存在缺血側尾殼核及背外側皮層梗塞，病變一致、穩(wěn)定性好，缺血效果可靠。尤其適用于基底節(jié)缺血再灌注的病理生理機制的研究和藥物治療效果與機制的觀察。此外，無需開顱、創(chuàng)傷小，栓線閉塞MCA后不引起血壓、血氣和體溫的異常變化，不影響缺血后腦水腫和顱內壓病理變化的自然過程等優(yōu)點，均優(yōu)于開顱閉塞MCA法建立的局灶性腦缺血模型[20]。

Zea Longa線栓法[21]：該模型的制備方法是將動物麻醉后頸后正中切開，電燒雙側椎動脈局阻斷后循環(huán)；前正中切開，暴露左側CCA、ICA和ECA，以微血管夾將CCA夾閉，將單股尼龍線(4-0)插入ICA遠端，大腦中動脈起始部阻斷血流/平均進線長度為(2±0.2)cm。

2.4栓塞法

這種造模方法是將栓塞劑(如碎血凝塊、碳素顆粒、花生四烯酸鹽等)注入血管，制成腦栓塞模型。將無菌干燥的血凝塊研碎，制成栓子混懸液。從頸外動脈注入栓子后，結扎頸外動脈并放開總動脈，栓子沖入頸內動脈并進入MCA。該模型不需開顱，制作簡單，缺血效果可靠。且與臨床栓塞性腦卒中病理過程最為相似，比較適用于溶栓治療的觀察研究，尤其選用人血凝塊作為栓塞劑更具有實用意義。其缺點是由于栓子的隨機性較大，無法精確預測梗塞的部位和范圍大小。也有研究人員應用氣囊栓塞法，但僅能用于大動物如狒狒、家兔等。

2.5Endothelin-1誘導的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型Sharkey等建立了ET-1誘導的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型[22]，國內外己有人采用該法進行了缺血性腦損傷的研究[23]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 m1/kg)麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上，以熱墊維持肛溫37.0～38.0℃，沿正中線切開頭皮暴露顱骨，參照大鼠腦立體定位圖譜以前囪為標志，頭端0.9 mm，右側開5.2 mm，顱骨下8.7 mm處植入一導管，5 min后將稀釋的不同濃度ET-1(4.0 μL)以1.0μL/ min速度注入到MCA附近：同時行尾動脈插管術監(jiān)測給ET-1前、后大鼠尾動脈血壓變化。與普遍應用的插線法相比，本模型僅涉及簡單的立體定位和開顱術，不會造成腦內較大動脈的損傷，減少了顱內出血的危險；再灌注的發(fā)生是一個漸進過程，避免了人為再灌注引起的CBF急劇增加，較符合人類腦卒中溶栓后CBF逐漸恢復的情況；開顱范圍小(直徑0. 65mm)，不會造成腦內環(huán)境的較大變化；產生與插線法類似的較穩(wěn)定的梗死范圍且具有良好的重現性。此外，本模型的最大優(yōu)點是可以對清醒動物進行缺血性腦損傷的研究，因此本模型對腦缺血再灌注機制的研究及腦保護新藥療效的評估而言是一種較理想的局灶性腦缺血再灌注模型。

3離體組織培養(yǎng)腦缺血再灌注損傷造模方法

海馬腦片抽氧缺糖模型：腦片的制作方法為取出生6～9 d SD大鼠，剝離出海馬，切成400 μm厚制成腦片培養(yǎng)液，放入插入微孔濾膜，再置入培養(yǎng)箱中，2周后加入碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)，再孵育1 h，選取完好無PI特異熒光著色的腦片。海馬腦片缺氧缺糖模型的制作方法有多種，目前運用較多的有浸沒法、充N2法和三氣缺氧培養(yǎng)箱法。浸沒法：將腦片換入內、外各含有1.2 mL無糖平衡鹽溶液的微孔濾膜上，再放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)30、45 min、1、1.5 h。充N2法：先將腦片用HEPES液沖洗，再放入含有1.2 mL HEPES緩沖液的微孔濾膜內，然后放入密閉容器中，分別持續(xù)充入5% CO2、95% N2的混合氣體30、45 min、1、1.5 h。三氣缺氧培養(yǎng)箱法：將腦片放入只有外側含有1.2 mL無糖平衡鹽溶液的微孔濾膜上，再放入5% CO2、1% O2、94% N2的三氣缺氧培養(yǎng)箱內分別缺血缺氧培養(yǎng)30、45 min、1、1.5 h。目前普遍認為三氣缺氧培養(yǎng)箱法來的缺氧缺糖模型最穩(wěn)定，但有實驗證實將浸沒法結合充N2法制作的模型與三氣缺氧培養(yǎng)箱法在缺氧1 h的結果相似[24]，且更方便實用。有實驗證實離體海馬腦片缺氧缺糖培養(yǎng)模擬“腦缺血”，可以重現在體動物實驗時海馬各區(qū)對缺血敏感性不同的特點[25]，這種方法正在逐步取代動物體內缺血模型。朱潔等在此基礎上發(fā)明了改良的新生大鼠海馬腦片缺氧缺糖巧匠制備方法，使得該方法應用更加經濟廣泛[26]。還有人認為從成年小鼠海馬腦片培養(yǎng)細胞損傷的評價將會成為研究神經保護作用的一個潛在模型系統(tǒng)[27]。

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(2015-03-02收稿2015-03-20修回)

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2015)06-0385-04