盧志芬 曹俊霞

L-精氨酸(L-Arg)為一種堿性氨基酸，可參與體內的多種代謝過程，其中L-Arg作為底物可生成NO，能抑制血小板聚集和黏附，降低血黏度，減少栓塞的發(fā)生;L-Arg還有類似硝酸脂類藥的作用，對于離體的血管具有調節(jié)其舒張功能的作用，特別是對冠狀動脈血管的作用更為明顯。而NO對于改善休克后行輸血治療過程中血管應激性損傷作用顯著且可靠，因此，L-Arg可能通過改善庫存血中NO濃度進而調節(jié)患者機體血管功能。本實驗主要研究庫存血中加入L-Arg后，對大鼠血管功能的調節(jié)作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3個月左右的SD大鼠，其中雄體10只，雌體10只;體重300～400 g，大鼠飼養(yǎng)盒外部溫度18～26℃，相對濕度40% ～70%，盒內溫度比外部環(huán)境高1～2℃，溫度高5% ～10%，噪音85分貝以下，氨濃度20 PPm以下，通風換氣8～12次/h，添加飼料2次/周，換水2～3次/周，換窩1～2次/周，由中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。經中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗材料

1.2.1 儀器及試劑:ABL735血氣分析儀及配套試劑(丹麥，Radiometer公司);BV-100懸絲流變儀及配套試劑(北京，泰諾德公司);LBY-BX紅細胞變形儀(北京，普利生儀器有限公司);550型酶標儀(美國，Bio-Rad公司)，Arg(美國，Fluka公司)、血漿游離血紅蛋白測定試劑盒(北京，瑞爾達生物科技有限公司)等。

1.2.2 血液標本:血液由廊坊市中心血站提供。選擇4名廊坊市定期無償獻血者，2人為O型，1人為A型，1人為B型，RhD血型均為陽性，均為漢族，年齡30～46歲。抽取靜脈血400 ml/人，分裝為200 ml/袋，其中一袋用白細胞濾器去除白細胞，分離出紅細胞，加入紅細胞保養(yǎng)液，制備成懸浮紅細胞，放置在4℃血液儲存冰箱中。標本留取在嚴格的無菌條件下進行，按照各檢測項目要求，每7天留取1次，進行檢測。全部血液和血液制品4℃保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組:動物隨機分為實驗組(L-Arg組)和對照組，每組10只。實驗組在CPD-A保養(yǎng)液中加入L-Arg，終濃度為3 000 μmol/L;對照組:用等體積的鹽水代替L-Arg。

1.3.2 實驗過程:用斷頭法處死大鼠，取其主動脈血管并剪成3～5 mm長的小段，利用帶掛鉤的轉換器將血管穿在小三角環(huán)上，兩三角環(huán)穿掛血管的兩條底邊應平行，使力的方向與換能器金屬彈片保持垂直并前負荷歸零。當血管環(huán)預收縮至平臺時，加入不含精氨酸的血液，等待15 min左右，等其效用達平臺，記錄曲線，采集信號;放掉血液，重新用K-H液平衡45 min，每15分鐘換1次液。待張力恢復到0時，重復第7步，用KCl重新建立收縮平臺;加入含精氨酸的血液，待15分鐘后，等其效用達平臺，記錄曲線，采集信號。

1.4 紅細胞理化特性相關指標的檢測 電解質、血氣分析、RBC變形性、聚集性、總 Hb-NO。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SAS 9.1統(tǒng)計軟件，先用VC、CS、UN、AR1和SPPOW 5種協(xié)方差結構模型擬合資料的情況，選擇AIC、BIC最小的模型，說明該模型擬合資料較好;主動脈環(huán)實驗采用具有1個重復測量的兩因素設計定量資料的方差分析，其他數據采用具有兩個重復測量的兩因素設計定量資料的方差分析，計算F值和P值，再進行各組受試對象在不同時間點之間的兩兩比較，計算出P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組血液pH值、離子濃度、ME及碳酸氫鹽濃度檢測 L-Arg 組與對照組分別在 0、7、14、21、28、35 d時檢測血液中pH值、離子濃度、ME和碳酸氫鹽濃度，經方差分析和各時間點兩兩比較，以上各指標2組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 2組不同時間點血液中pH值、離子濃度、ME及碳酸氫鹽濃度比較n=10，±s

表1 2組不同時間點血液中pH值、離子濃度、ME及碳酸氫鹽濃度比較n=10，±s

0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d pH項目值對照組 6.79 ±0.09 6.58 ±0.03 6.52 ±0.04 6.49 ±0.04 6.42 ±0.02 6.43 ±0.03 L-Arg 組 6.78 ±0.07 6.59 ±0.04 6.52 ±0.05 6.49 ±0.05 6.43 ±0.03 6.43 ±0.02 K+(mmol/L)對照組 2.55 ±0.19 7.59 ±0.22 11.18 ±0.36 14.25 ±0.37 17.53 ±0.73 19.63 ±1.02 L-Arg 組 2.53 ±0.10 7.58 ±0.22 11.23 ±0.32 14.22 ±0.35 17.58 ±0.68 18.68 ±0.99 Na+(mmol/L)對照組 128.8 ±2.8 121.2 ±1.0 117.8 ±0.5 113.8 ±0.5 110.8 ±1.5 109.8 ±1.5 L-Arg 組 128.0 ±1.4 121.25 ±0.95 117.0 ±0.5 113.7 ±0.5 111.0 ±1.4 109.7 ±1.5 Cl－(mmol/L)對照組 68.0 ±4.8 63.9 ±2.1 64.0 ±1.4 64.5 ±2.1 68.8 ±1.3 65.8 ±1.3 L-Arg 組 68.0 ±4.8 63.8 ±1.0 64.2 ±1.2 65.0 ±1.8 68.8 ±0.5 66.5 ±0.6 ME離子(mmol/L)對照組 1.4 ±0.4 5.2 ±0.9 7.8 ±1.1 10.4 ±1.3 10.4 ±1.3 13.5 ±0.8 L-Arg 組 1.3 ±0.4 5.2 ±0.8 7.9 ±1.3 10.6 ±1.4 11.1 ±2.0 13.6 ±0.8碳酸氫鹽離子(mmol/L)對照組 8.33 ±1.57 4.78 ±0.59 3.78 ±0.55 3.23 ±0.50 2.60 ±0.22 2.58 ±0.24 L-Arg 組 8.10 ±1.12 4.78 ±0.62 3.83 ±0.64 3.28 ±0.55 2.55 ±0.26 2.58 ±0.24

2.2 2 組血氣分析結果 分別與保存 0、7、14、21、28、35 d取血，進行血氣分析，L-Arg對庫存血氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)和血氧飽和度(SO2)無明顯影響(P ＞0.05)。L-Arg組 PO2、PCO2和 SO2的檢測結果與對照組分別在各個時間點進行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖2。

表2 2組不同時間血氣分析比較n=10，xˉ±s

2.3 2組紅細胞變形性和聚集性檢測 分別與0、7、14、21、28、35 d取血，檢測紅細胞的變形性和聚集性，L-Arg對紅細胞變形性和聚集性的影響差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。2組紅細胞變形性(圖3-A)和聚集性(圖3-B)分別在各時間點，進行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表3、圖1。

表3 2組紅細胞變形性和聚集性比較n=10，xˉ±s

圖1 2組紅細胞變型性和聚集性比較

2.4 2組游離血紅蛋白檢測 分別于0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d取血，檢測游離血紅蛋白含量(圖4)。在0 d、7 d、14 d時，方差分析和兩兩比較結果顯示，2組游離血紅蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在21 d、28 d、35 d時，L-Arg組游離血紅蛋白含量低于對照組，方差分析和各時間點兩兩比較結果差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表4、圖2。

2.5 2組血管舒張功能檢測 L-Arg組與對照組分別在7 d、16 d、35 d時，用大鼠主動脈環(huán)實驗檢測血管舒張功能。方差分析結果顯示，L-Arg對血管舒張功能的影響具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。L-Arg組血管舒張功能與對照組在各時間點進行兩兩比較，結果差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。見表5、圖3。

表4 2組不同時間點血液中游離血紅蛋白含量 n=10，mg/L，±s

表4 2組不同時間點血液中游離血紅蛋白含量 n=10，mg/L，±s

0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d對照組 25±17 79±31 201±52 284±91 486±103 596±112組別L-Arg組 26±17 76±14 157±36 200±43* 364±72* 455±66*

圖2 2組游離血紅蛋白水平比較

表5 2組不同時間點血管舒張能力 n=10，%，±s

表5 2組不同時間點血管舒張能力 n=10，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05

7 d 16 d 35 d對照組 44±3 37±12 24±6組別L-Arg組 76±5* 64±25* 55±12*

3 討論

圖3 2組不同時間點血管舒張功能

3.1 L-Arg促進庫存血NO生成L-Arg本身是NOS的底物，是產生NO的生成前體，在NOS作用下生成NO和胍氨酸［1］。且L-Arg作為一種治療血氨升高的氨基酸類藥物在臨床應用已經比較普遍，不良反應較少。L-Arg做為底物，生成NO后發(fā)揮生理功能的相關研究多集中在心血管等領域，在輸血領域研究還未見報道。有研究表明，一定劑量的L-Arg能抑制血小板聚集和黏附，降低血黏度，減少栓塞的發(fā)生;應用多普勒超聲波檢查頸動脈血管內膜去除患者腦部的栓塞信號，發(fā)現靜脈注射L-Arg的患者信號強度明顯減小，提示LArg對栓塞性疾病具有一定療效［2］;L-Arg還有類似硝酸脂類藥的作用，對于離體的血管具有舒張作用，特別是對冠狀動脈血管的作用更為明顯。為了改善庫存血舒張血管的功能，避免外源性加入帶來的潛在不利影響，本研究利用紅細胞上含有功能性eNOS的特點，在血液中加入不同劑量的L-Arg，使其產生內源性的NO，對血管進行調節(jié)作用。

3.2 NO對血管功能的調節(jié)作用NO是存在于各種細胞內的一種重要的信號分子，可以調節(jié)紅細胞、白細胞和血小板的功能。SNO是NO的運輸形式，從而增加組織灌流，這對紅細胞運輸氧的功能是十分重要的［3］。紅細胞中的血紅蛋白已經被公認為是NO的貯存庫，傳遞O2和釋放出NO給低pH值或低氧張力區(qū)域，引起血管擴張。

國外研究報道在庫存血中造成紅細胞變形性下降的原因與NO含量的下降有關，NO可以影響RBC膜的性質，質膜將變得僵硬，紅細胞脆性增加和變形能力降低而不能輕松通過微血管，從而不利于紅細胞對組織供氧［4－6］。研究顯示血漿中的NO含量在貯存時間相對穩(wěn)定，沒有發(fā)生明顯變化，但當紅細胞Hb中的SNO酶將NO轉換為生物活性的SNO-Hb［7］，才具有血管舒張的活性。當輸注庫存紅細胞時，由于SNO-Hb已經耗竭，血液擴張血管功能失調，加之紅細胞變形能力減弱，則血液會堆積在較大的血管，進一步引起堵塞和缺血，在缺血患者中引起不良后果。

3.3 L-Arg可以通過促進庫存血NO生成調節(jié)血管舒張功能。本實驗中，我們對加入L-Arg的庫存血質量進行了初步評價，在保存期內，血液的pH值、離子濃度、ME、碳酸氫鹽、血氣含量、紅細胞的變形性和聚集性均沒有發(fā)生明顯變化;在血液游離血紅蛋白檢測結果表明，血液保存2周后，實驗組與對照組游離血紅蛋白含量均有所升高，但是實驗組明顯低于對照組，推測L-Arg對紅細胞膜具有一定的穩(wěn)定作用。本實驗并主要研究了L-Arg對血管功能的影響，結果顯示，對照組在血液保存期內，血管舒展功能較弱，1周后均在47%以下，加入L-Arg后，血管舒展功能明顯升高，均在55%以上，提示L-Arg對改善庫存血的舒張血管功能有明顯作用。

L-Arg是人體所需要的營養(yǎng)物質之一，是多種蛋白質的組成成分，如果攝入合理的劑量，不良反應會比較小，甚至沒有不良反應發(fā)生。在血液中加入L-Arg后，總Hb-NO含量增加，在體外實驗中，舒血管功能明顯增強，對于急性輸血患者，可降低其血管內壁損傷可能，從而減少炎性介質等產生幾率。另一方面，以LArg作為底物生成NO后對血管功能進行調節(jié)，可以避免因直接加入NO導致庫存血重新亞硝基化，難以做到標準化，以及過量的NO導致抑制組織細胞的氧化呼吸，引起多器官功能衰竭的弊端，但對于低血壓患者急救用血是否會有不利影響，尚有待進一步研究。盡管L-Arg不是目前獲批的紅細胞保存液的成分，若在保存液中添加新的成分需要進一步深入的研究，但利用紅細胞自身的eNOS，通過加入L-Arg來生增加庫存血中的NO含量，是改善血液舒張血管功能的比較理想的方法，是提高輸血安全性和有效性的一個可能的發(fā)展方向，值得今后進一步深入研究探討。

1 Sessa WC，Hecker M，Mitchell JA，et al.The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor:L-glutamine inhibits the generation of L-arginine by cultured endothelial cells.Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87:8607-8611.

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3 Tsuda K，Kimura K，Nishio I，et al.Nitric oxide improves membrane fluidity of erythrocytes in essential hypertension:an electron paramagnetic resonance investigation.Biochem Biophys Res Commun，2000，275:946-954.

4 Starzyk D，Korbut R，Gryglewski RJ.Effects of nitric oxide and prostacyclin on deformability and aggregability of red blood cells of rats ex vivo and in vitro.J Physiol Pharmacol，1999，50:629-637.

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7 Angelo M，Singel DJ，Stamler JS.An S-nitrosothiol(SNO)synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:8366-8371.